欢畅团

齐欢畅2

继续前行，~~

富贵数字

原帖由 齐欢畅2 于 2010-7-15 15:44 发表
继续前行，~~

行到哪里了??

富贵数字

齐大 我对你很无语啊, 为什么就T我啊 ,

虎豆

真羡慕你，有目标，我只是无望的徘徊

dfyy8989

继续前行，~~

齐欢畅2

原帖由 正义天蓝 于 2010-7-16 19:09 发表
HBV cccDNA与 HBsAg定量检测的研究进展
目前没有证据表明HBV的复制会直接破坏肝细胞，主要认为它是通过触发机体免疫反应引起肝损害等一系列后果。因此治疗慢性乙型肝炎的关键在于抗病毒治疗，而目前的抗病毒药物均不可能彻底清除HBV。随着对HBV感染分子机制认识的逐渐深入，人们已经认识到导致病毒在人体内持续存在、病情反复发作、停药后乙肝复发等不良事件的罪魁祸首是HBV的一种复制中间体——共价闭合环状DNA（covalently closed circular DNA，cccDNA）。

cccDNA的数量和形式是相对稳定的， HBV感染的自然史提示人们，要彻底清除病毒必须彻底清除cccDNA。cccDNA是HBV前基因组RNA转录产物最原始的模板，是HBV持续感染的关键因素，故cccDNA水平是HBV复制最特异的指标。但cccDNA一般存在于肝细胞核内，对其进行测定需要通过肝活检，并不是每例患者都能接受这种有创检查。因而通过肝活检对cccDNA进行定量来监测抗病毒效果存在困难。寻找能够代替cccDNA来反映HBV感染状况的无创指标用于临床变得迫在眉睫。已有研究显示，HBsAg的产生也是以cccDNA为模板的，因此血清学HBsAg水平可反映肝内cccDNA和肝内HBV DNA水平，与之相应，血清学HBsAg水平可以作为反映HBV感染细胞数量的无创标志物。

肝组织内cccDNA的检测技术的发展

cccDNA的研究已有将近30年的历史，但在前20年几乎均为动物实验或体外实验，很少有来自人体的研究。人肝细胞内cccDNA的存在最初是通过Southern Blot法证实的。随着PCR技术的进步，人们可以用极微量的肝组织来定量检测cccDNA。但因为肝内存在各种形式的DNA，早期的PCR法有很大的假阳性，近年来发展了一些消除假阳性的方法，包括①用质粒安全的DNA酶来处理从肝组织中抽提出来的总HBV DNA，可以消化除cccDNA之外的HBV DNA形式，包括单链DNA、rcDNA、线状DNA等；②设计引物位于rcDNA的缺口两端，保证rcDNA不被扩增。cccDNA的定量测定主要使用实时荧光探针技术，通过捕获和计量有效的PCR循环中积累的荧光强度和标准曲线来计算cccDNA的值。检测仪器的敏感度也越来越高，目前常用的检测方法是质粒安全DNA酶消化的实时荧光定量PCR法，常见的检测仪器有ABI系统、FTC2000 系统、LightCyecler系统等。

在HBV感染自然史不同阶段的cccDNA的研究

是否存在肝外复制场所？

HBV的复制是否在肝外进行？这是了解HBV感染慢性化机制的一个重要问题。如果在血清、血浆或PBMC中能够检测到cccDNA，即可作为HBV肝外复制的一个证据，因此近年来成为研究热点，到目前为止研究结果仍然存在争议。

早期普遍认为人PBMC中可检测到cccDNA，至1995年有人提出基于cccDNA的检测结果过高（104~106 copies/mL）和检测方法的不成熟，可能造成假阳性。目前主要有两种观点：一种观点认为PBMC能够检测到cccDNA，是HBV肝外复制的场所；另一种观点认为PBMC并非肝外复制的场所，在PBMC或外周血中检测到的cccDNA或者是假阳性，或者是肝细胞破裂后释放到肝外的少量残存物，并没有复制活性。2004年，Chen等认为血清cccDNA水平与ALT呈正相关，可以作为肝细胞早期损伤的一个标志。但最近一篇文章却认为Chen的结果出自较小的样本量，并不可靠，相反有数个独立研究表明血清或血浆中的cccDNA水平与ALT并无显著相关性，说明外周检测到的cccDNA并不是——至少并非完全是由肝细胞损伤释放出来的，可能存在cccDNA的肝外装配场所。他们用敏感性高的PCR法检测了不同中心的血浆样本的cccDNA，证实检测到的并不是rcDNA或其他类型的DNA。在该研究中也显示ALT与血浆cccDNA水平没有显著相关性。文章认为，外周血存在的cccDNA是非常有意义的。

HBV感染自然史不同阶段cccDNA的变化

对HBV感染自然史的研究表明，HBeAg（+）慢乙肝患者的cccDNA水平要显著高于HBeAg阴性慢乙肝患者和HBV携带者，并且与肝内总HBV DNA、血清中HBV DNA高度正相关。在所有HBeAg（-）患者肝组织中也均能检测到cccDNA，这解释了为何HBeAg阴性患者病情仍有可能出现进展和恶化。事实上，HBV的复制和肝炎进展在整个自然史中是反复波动的。即使HBsAg清除的患者，在肝组织内仍可以检测到少量的cccDNA。37%的患者体内有低水平的HBV DNA，以cccDNA为主要形式，占总DNA的71%~100%。因此HBsAg（-）者在肝移植术后、肿瘤化疗患者、激素应用者免疫功能极度抑制情况下发生乙肝是不足为奇的，提示有必要对此类人群加强乙型肝炎的检测，甚至预防性抗病毒治疗。另外，人们也已经注意到，接受了HBcAb（+）供者肝脏的肝移植患者会出现HBV感染，这是由于供者急性感染HBV恢复后肝内仍有cccDNA的残存，这为移植肝的选择提出了更苛刻的要求。

在抗病毒治疗过程中cccDNA的演变与血清HBsAg水平

1985年日本学者首次对接受抗病毒治疗前后肝组织内HBV复制形式的变化进行了对比研究，他们用干扰素进行抗病毒治疗，发现治疗后除了超螺旋形环状DNA，其他形式的HBV DNA都较基线水平减少。

近年来用血清HBsAg水平来监测抗病毒治疗的研究逐渐成为关注的焦点，香港陈力元教授等在两项有关PEG-IFN联合拉米夫定治疗慢性乙肝的研究中阐明了cccDNA与血清HBsAg水平及治疗应答的关系。他们在研究中发现，患者血清HBV DNA水平与其肝内cccDNA水平及肝内总HBV DNA水平存在良好的相关性，持续应答的患者肝内cccDNA水平及肝内总HBV DNA水平显著降低。与血清HBV DNA水平相比，肝内cccDNA水平及肝内总HBV DNA水平预测病毒学应答的效果更好。这反映了免疫控制对疾病缓解的重要意义。他们随后的小型临床研究显示，治疗应答者的cccDNA显著降低，而未应答者则不降低。此外，他们同时测定了患者血清HBsAg的水平，定量检测的结果与其肝内cccDNA水平具有非常好的相关性，这进一步提示可考虑将血清HBsAg作为替代cccDNA的标志物。

同样的，在2009年的EASL大会报告中，几乎目前所有上市的核苷（酸）类似物的临床研究均涉及了在抗病毒治疗过程中定量检测HBsAg水平的作用。

病毒代谢动力学对抗病毒治疗有着非常明确的重要性。已经知道病毒的减少主要分为两个阶段：①快速病毒下降期：是因为被感染肝细胞内的病毒复制被阻止；②缓慢病毒清除期：可能是因为被感染肝细胞的减少和消失，这一阶段的缓慢速度可能与cccDNA的缓慢下降有关。目前核苷（酸）类似物对cccDNA的影响，研究结果并不完全一致。恩替卡韦或拉米夫定治疗1年后观察肝内cccDNA水平和总HBV DNA的变化，发现均有下降，且cccDNA所占总HBV DNA比例上升。PEG-IFN素联合阿德福韦酯治疗后也观察到cccDNA和总HBV DNA 的显著下降，且与血清HBsAg滴度下降具有相关性。长期阿德福韦酯能够降低肝内cccDNA水平，有研究显示阿德福韦酯可通过非细胞溶解途径降低cccDNA。拉米夫定联合阿德福韦酯甚至可能出现HBsAg消失。部分接受拉米夫定或阿德福韦酯治疗的患者发生了免疫反应的再激活。2005年曾报道1例患者拉米夫定耐药后加用阿德福韦酯治疗22个月后出现了HBsAg的血清学转换，肝内总HBV DNA和cccDNA均显著下降，可能与HBsAg血清转换后非细胞毒性Th1反应的突然修复有关。

患者接受抗病毒治疗后，需定期接受复查以监测治疗效果。其中，HBsAg定量可反映cccDNA水平，同时对于判断治疗应答也具有较大的实践价值。

总    结

ccc DNA是乙肝病毒持续感染的关键因素，也是HBV复制最特异的指标，其准确性超过目前常用的HBV DNA检测。对于慢性HBV感染者肝组织内cccDNA的定量检测可以作为监测抗病毒反应和决定治疗终点的一个关键指标。肝内HBV cccDNA与血清HBsAg水平显著相关。HBsAg定量水平可以作为反映HBV感染细胞数量的无创标志物，并用于指导治疗应答，有助于治疗方案的制定。

检测技术的完善和对cccDNA分子机制的进一步认识，有助于人们发掘出针对HBV复制各个环节的抗病毒新药，达到减少耐药发生、减少复发和激活宿主免疫反应的目的。cccDNA及相关研究领域中仍有大量的未知数等待研究者去解答。

本文和我前几天的想法相合。hbsag和cccdna正相关，hbeag和hbvdna正相关。真是不错的文章啊。谢谢这位战友~~~

[ 本帖最后由 齐欢畅2 于 2010-7-16 19:58 编辑 ]

齐欢畅2

1、对HBV感染自然史的研究表明，HBeAg（+）慢乙肝患者的cccDNA水平要显著高于HBeAg阴性慢乙肝患者和HBV携带者，并且与肝内总HBV DNA、血清中HBV DNA高度正相关。
2、此外，他们同时测定了患者血清HBsAg的水平，定量检测的结果与其肝内cccDNA水平具有非常好的相关性，这进一步提示可考虑将血清HBsAg作为替代cccDNA的标志物。
3、已经知道病毒的减少主要分为两个阶段：①快速病毒下降期：是因为被感染肝细胞内的病毒复制被阻止；②缓慢病毒清除期：可能是因为被感染肝细胞的减少和消失，这一阶段的缓慢速度可能与cccDNA的缓慢下降有关。目前核苷（酸）类似物对cccDNA的影响，研究结果并不完全一致。恩替卡韦或拉米夫定治疗1年后观察肝内cccDNA水平和总HBV DNA的变化，发现均有下降，且cccDNA所占总HBV DNA比例上升。PEG-IFN素联合阿德福韦酯治疗后也观察到cccDNA和总HBV DNA 的显著下降，且与血清HBsAg滴度下降具有相关性。长期阿德福韦酯能够降低肝内cccDNA水平，有研究显示阿德福韦酯可通过非细胞溶解途径降低cccDNA。拉米夫定联合阿德福韦酯甚至可能出现HBsAg消失。部分接受拉米夫定或阿德福韦酯治疗的患者发生了免疫反应的再激活。2005年曾报道1例患者拉米夫定耐药后加用阿德福韦酯治疗22个月后出现了HBsAg的血清学转换，肝内总HBV DNA和cccDNA均显著下降，可能与HBsAg血清转换后非细胞毒性Th1反应的突然修复有关

lanwj

2005年曾报道1例患者拉米夫定耐药后加用阿德福韦酯治疗22个月后出现了HBsAg的血清学转换，肝内总HBV DNA和cccDNA均显著下降，可能与HBsAg血清转换后非细胞毒性Th1反应的突然修复有关。

如果在内能有效清除cccDNA，在外能有效清除HBsAg，这两个能做到一个应该就OK了。

齐欢畅2

有的患者虽然在治疗后五项全阴，但肝细胞内仍然存在cccdna。
还有的情况是由于整合dna的作用，复发~~肝细胞重新生成cccdna。
所以我觉得，如果人体不能产生针对表抗的免疫反应的话，还是无法根本的解决cccdna的。
其实按照我的思考，可以这样，既对付cccdna，又同时抑制表抗的表达。
这样就可能是hbsag达到持续降低的可能，因为cccdna和表抗存在相关性，打击表抗的表达，和打击cccdna都可以降低hbsag，如果表抗能够持续降低，那么最终，就可以打破免疫耐受，启动针对表抗的免疫反应~~一举消灭cccdna。