悬赏：抗乙肝药物对cccDNA抑制作用的文章

StephenW

springa 发表于 2011-5-5 22:09
多谢,
http://www.med66.com/html/ziliao/yixue/11/56f63261671fdfe71cd4f4e0f16f90c4.htm

"以上是摘自骆抗先教授的文章" - 此文章有一个链接?

springa

没有没有.
是指我转的全部是从这个连接里转来的.

bigben446

interdetect 发表于 2011-5-5 13:30
cccDNA是当今乙肝治疗药物研发的热点。一直以来由于分离难，测试灵敏度低10^4，制约了其作为临床常规检测指 ...

要清除cccDNA，必须研发针对cccDNA病毒复制周期前的药物

从病毒复制周期看，核苷类似物不可能对cccDNA有根本影响，
因为核苷类似物是针对的cccDNA下游，只能影响cccDNA池的补充

interdetect

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ben，如果说不能持续被补充了，那cccDNA池会不会被慢慢饿死呢？
有文章报道说经过48周ADV治疗，可以导致0.8log的cccDNA降低。

ainile

项目的主要内容介绍：慢性乙型肝炎（CHB）一直是肝病治疗的难点和重点，目前国内外还没有公认非常有效的治疗方法和治疗药物。1998年，我们根据乙肝免疫治疗研究现状及DNA疫苗研究发展趋势，本项目通过基因重组技术，构建了编码乙肝病毒（HBV）主要抗原蛋白（preS2+S）的质粒作为治疗性乙肝基因疫苗；同时构建了编码人白细胞介素（IL-2）和干扰素(IFN-?)融合蛋白质粒作为佐剂，并采用肌肉注射联合电脉冲转导技术免疫接种，完成了临床前研究，于2006年获临床试验批文。现已在国家认定的肝病治疗药物临床试验基地，按照SFDA制订的GCP规范进行治疗性HBV DNA疫苗的临床试验，对该新药治疗的安全性、有效性及其作用机理作出科学的评价及论证，2010年获新药证书及生产批文；通过临床大量样本的收集及分析总结，建立特异性免疫功能临床诊断实验的方法和技术平台，为CHB免疫治疗疗效评价提供可靠标准；同时，优化该疫苗的工业生产工艺，获取工业化规模生产的工艺与质量控制参数，按照GMP规范建立本项目产品的质量管理体系，为大规模临床应用和产业化做好准备。（1） 疫苗安全性的考察。观察受试者对EP及制剂的局部和全身的一般反应；通过检测血清抗核抗体（ANA）及抗DNA抗体，监测受试者自身免疫病的发生；通过血清胆红素、ALT及IFN-?/TNF水平变化等的检测，对受试者是否因细胞免疫激活而诱发的急性肝损伤或肝功能衰竭进行监测。（2） 疫苗有效性的考察。观察评价双质粒HBV DNA疫苗诱导受试者抗病毒治疗效果。抗病毒治疗各单项应答包括病毒学应答、血清学应答、生化学应答及组织学应答，具体观测指标详见2006年版“慢性乙型肝炎防治指南”相关内容。（3） 特异性免疫功能重建及临床诊断实验平台建立。治疗性双质粒HBV DNA疫苗通过诱导或增强机体特异性细胞免疫应答，旨在打破HBV在机体形成的免疫耐受状态，重建或恢复慢性HBV感染患者机体针对HBV特异性免疫功能。采用酶联免疫斑点（ELISPOT）及四聚体（Tetramer）等方法检测CHB患者外周血单个核细胞（PBMC）HBV特异性T细胞免疫应答，收集能够确定细胞免疫检测指标的第一手数据资料，制订CHB免疫功能评价指标，以指导临床抗病毒药物的合理使用并评价免疫调节治疗效果。本项目符合国家“十一五”重点发展生物技术（医药）产业政策，属国际前沿课题，拥有自主知识产权。项目成功实施将推动我省乃至我国基因药物赶超国际先进水平，争取在全球首次推出乙肝治疗的基因药物。并为基因治疗其它重大疾病等生物技术药物的开发提供先进、实用的技术平台。
需要解决的关键技术？技术指标如何？
需要解决的关键技术？技术指标如何？（1） 提高DNA疫苗转染率。人体研究中，传统的肌注方法难以获得较高的裸DNA质粒转染效率。本项目采用上海交通大学徐宇虹教授研制的在体电脉冲技术，以提高治疗性双质粒DNA对人体的转染效率。（2） 肝细胞核内cccDNA清除问题。HBV cccDNA是乙肝病毒复制的模板，也是乙肝复发、难以彻底治愈的根源。目前临床上使用的药物均无明显清除肝细胞核内HBV cccDNA作用。临床前研究结果表明，通过特异性细胞免疫途径，治疗性HBV DNA疫苗能够清除HBV cccDNA。本研究拟对部分临床试验对象进行肝穿检查（自愿），用PCR方法对肝组织和外周血重的HBV cccDNA定量检测。（3） 特异性免疫功能临床诊断实验平台。特异性细胞免疫应答主要以T细胞应答为指标，观察受试者外周血单个核细胞（PBMC）增殖并以酶联免疫斑点法（ELISPot）及流式细胞术结合四聚体（Tetramer）法检测HBV特异的T淋巴细胞免疫应答。
项目实施后可以取得的效果：
  项目实施后可以取得的效果：本项目属国际前沿课题，拥有自主知识产权。项目成功实施将加快国家一类新药的产业化。慢性乙型肝炎是一种潜在威胁生命的疾病，全球每年有超过50万人死于原发性肝癌，而其中多达80%的原发性肝癌是由慢性乙肝引起的。在4亿慢性乙肝患者中，有75%生活在亚洲，而我国是世界上乙肝发病率最高的国家，HBV病毒携带者占全球总数的1/3以上，大概有1.2亿。抗病毒治疗是乙肝治疗的核心和关键内容，也是治疗乙肝的难点所在。目前临床应用的抗病毒药物如干扰素和拉米呋啶仅仅以控制病毒进一步复制繁殖为主要治疗目标，并无清除或杀灭病毒的作用，尤其是对HBV复制的模板cccDNA无作用，因此需要长期用药，由此常常引起病毒变异和产生耐药性，而且一旦停药病毒复制往往反跳。目前，市场上各种治疗乙肝药物的适应症均要求患者转氨酶升高二倍以上方可使用，有效率也仅在35-45%之间，“大三阳”免疫耐受患者均无效，这些病人现在处于无药可治的慢性损伤状态。临床医生和乙肝患者都迫切需要在诊疗手段上进一步提高目前抗病毒治疗水平。特异性免疫功能临床诊断实验平台建立将有效降低抗病毒药物使用的盲目性，对临床抗HBV治疗的合理应用具有积极的指导意义。CHB患者机体HBV特异性免疫功能的重建将提高患者机体特异性细胞免疫功能达到最终清除HBV的目的，对于治疗CHB患者、减少肝硬化、肝癌发病率、增强民族身体素质等方面具有重要社会效益；同时，新药研制的产业化将会产生巨大的经济效益（年产值5亿元以上）。

ainile

目的：探讨慢性乙肝患者肝细胞内HBV cccDNA含量与肝细胞内tDNA、HBsAg、HBcAg及血清HBV DNA、HBsAg、HBeAg的关系以及其临床应用。 方法：应用荧光定量聚合酶链反应法检测28例慢性乙型肝炎病人(乙肝组)、30例乙肝肝癌病人(肝癌组)、4例抗病毒治疗的慢乙肝病人(抗病毒组)、7例血清HBV标志物、HBV DNA均阴性的非乙肝病人(对照组)的肝细胞内HBV cccDNA、tDNA和血清HBV DNA含量，用ELISA法检测上述病人血清内HBsAg、HBeAg水平，免疫组化法定性检测肝组织内HBsAg、HBcAg，用spss 13.0软件统计分析肝细胞HBV cccDNA含量与肝细胞tDNA、HBsAg、HBcAg及血清HBV DNA、HBsAg、HBeAg的关系。 结果：(1)HBsAg、HBcAg在肝细胞的不同表达模式间肝细胞HBVcccDNA、HBV tDNA含量问没有显著性差别，p值分别为0.128，0.111。(2)肝细胞内HBV cccDNA含量与血清HBV DNA水平呈低度正相关，(r=0.387，p=0.003)。(3)肝细胞内HBV cccDNA含量与血清HBsAg水平呈低度正相关，(r=0.295，p=0.025)，与血清里HBeAg水平无相关性，(r=0.125，p=0.254)。(4)肝细胞内HBV cccDNA含量与肝细胞内HBV tDNA含量高度正相关，(r=0.881，p=0.00)。(5)慢乙肝、肝癌癌旁和肝癌的肝细胞内HBV cccDNA含量之间没有显著差别，p=0.459。(6)4例抗病毒组病人，疗程>2年并达到《病毒性肝炎防治方案》规定停药标准，肝细胞内cccDNA、tDNA含量及血清HBsAg、HBeAg水平与未抗病毒组比较明显降低，但肝细胞内仍然可以检出HBV cccDNA、tDNA。 结论：(1)肝细胞HBV cccDNA含量高低与HBsAg、HBcAg在肝细胞的表达模式关系没有一定规律性。(2)HBV病毒复制活跃时，肝细胞HBVcccDNA、tDNA、血清HBV DNA相应升高，当肝细胞cccDNA处于低转录状态，血清HBV DNA<103 copies/ml，肝细胞内仍可能检出低拷贝HBVcccDNA。(3)定量检测肝细胞内HBV cccDNA的临床意义及学术价值尚不能被肝细胞内HBV tDNA及血清HBV DNA、HBsAg、HBeAg的检测所取代。(4)使用核苷类似药物抗病毒治疗达到乙肝防治指南停药标准，肝细胞内仍可能检出低拷贝HBV cccDNA；(5)长期(>2年)核苷类似物抗病毒治疗能够耗竭肝细胞HBV cccDNA。

ainile

乙型肝炎病毒( Hepatitis B virus ,HBV) 感染是世界性的公共卫生问题,目前世界范围内有近4亿的慢性HBV 携带者,而慢性乙型肝炎是肝硬化和肝细胞癌的高危因素。HBV 属嗜肝DNA 病毒,已经证实共价闭合环状DNA (Covalently closedcircular DNA , cccDNA) 是HBV 前基因组RNA 转录的原始模板,是HBV 持续感染和抗病毒药物停用后病情反复的关键因素。根据数学模型推算得出,应用阿德福韦(Adefovir ,ADV) 可能需要1415 年才能完全清除慢性乙肝患者肝细胞中的cccDNA。
    因此,了解细胞内HBV cccDNA 的存在情况,对深入研究cccDNA 在HBV 致病机制及药物疗效评价等方面具有重要意义。现就近年来有关cccDNA 的常用检测方法及其临床意义等方面的进展作一综述。
    2 　HBV cccDNA 的生物学特性
    HBV 通过肝细胞胞膜上可能存在的受体入侵肝细胞,在胞质内脱壳, 松弛环状DNA ( relaxedcircular DNA , rcDNA) 进入肝细胞核,在宿主和病毒DNA 聚合酶作用下,以负链DNA 为模板,延长修补正链DNA 裂隙区,完成正链两端连接而形成双链完整的cccDNA。cccDNA 在复制过程中,可以转录为3.5 、2.4 、2.1 、0.7 kb 等不同大小的mR－NA ,并翻译成为各种病毒蛋白。其中3.5 kb 的mRNA 作为逆转录模板,利用病毒的逆转录酶合成全长的基因组负链DNA ,再以负链DNA 作为模板,通过病毒DNA 聚合酶的作用,合成正链DNA ,与负链DNA 一起组成新的rcDNA。新合成的HBV rcDNA 大部分与病毒蛋白装配成新的完整HBV ,以芽生方式,从细胞膜上释放至细胞外,再感染健康的肝细胞。另有部分可进入细胞核内,转化为新的cccDNA ,补充细胞内的cccDNA 池。机体通过免疫清除HBV cccDNA 的途径主要有:1) 通过细胞溶解机制,清除感染的肝细胞, HBV 被巨噬细胞吞噬或与抗－HBs 抗体结合成为免疫复合物后被巨噬细胞吞噬并从尿中排出。破坏的肝细胞由新生肝细胞替代;2) 通过Th1 反应介导的依赖细胞因子的非细胞溶解机制,如干扰素、肿瘤坏死因子和白介素－2 等细胞因子清除HBV。
    3 　HBV cccDNA 的主要检测方法
    以往文献报道较多的cccDNA 定量检测的方法是Sout hern blot ,该方法是分子生物学的经典方法,检测较为准确,但操作繁琐、敏感性较低且不能准确定量,需标本量也较大,故在临床上应用较少。目前对HBV cccDNA 检测的设计多是基于其与rcDNA在结构上的不同: cccDNA 两条链均是完整的,而rcDNA 在正链和负链上均有缺刻或缺口; 由于cccDNA 双链结构完整,一般不会被绿豆核酸酶等核酸外切酶降解,而rcDNA 可以被这些外切酶降解。
    3. 1 　巢式聚合酶链反应( Nested polymearse chainreaction , nPCR)
　　巢式聚合酶链反应也称套式PCR。由于使用了两对引物并且进行了两轮扩增反应,实验的敏感性和特异性均增强。其引物设计的原理也是基于cccDNA 与rcDNA 结构的不同, 引物跨过环状HBV－DNA 的DR1 、DR－重复序列旁的两个缺刻。因此,cccDNA 能够被扩增,而rcDNA 则不能扩增。董庆鸣等用该法检测HBV cccDNA 标准对照质粒, 结果表明该法可以检测到5 ×10*5 拷贝/ L HBVcccDNA。
    3. 2 　实时荧光定量PCR 扩增法
    He 等根据cccDNA 与rcDNA 在结构和生化特性上的不同,建立了实时荧光定量PCR 扩增法。他们将具有发光基团和淬灭基团的TaqMan 探针设计于负链缺口的下游,与负链互补。在上游引物的引导下,若负链是完整的, Taq 酶则到达Taq-Man探针所结合的位点,利用其5′→3′的外切酶活性将探针切断,从而3′端的淬灭基团失去对5′端发光集团的抑制作用,产生荧光信号。相反,若负链含有缺口,由于上游引物引发的链延伸不能通过负链缺口,故不能产生荧光信号。这样,cccDNA 和rcDNA 得以区分开来。其定量检测的线性范围是1 ×10*2 ～1×10*7 拷贝/ L 。该方法对比分析了HBV 基因库中150 条已知A2G基因亚型的序列,根据保守区域设计引物,能检测A、B、C、F、G基因型,故该方法可用于90 %亚太地区的乙肝病人cccDNA 的检测。目前认为该法是临床肝穿刺标本中cccDNA 定量的金标准。
    3. 3 　嵌合引物两步法荧光定量
    Shao 等根据非cccDNA 形式的HBV 基因组存在缺口,设计由两段序列构成的嵌合引物。其3′端的12 个碱基与正链(1604～1615) 互补,结合位点为负链缺口上游DR2 缺口下游,5′端的一段与人类免疫缺陷病毒的部分基因序列一致而与HBV 基因组无同源性。首先用该嵌和引物对模板DNA 进行15 个循环的单链延伸,在该反应过程中,cccDNA 因为正链完整,引物能够顺利延伸形成一条新生链;而HBV DNA 的其他形式,如rcDNA ,由于DR2 区存在缺口,引物的延伸停止于DR2 区,不能产生单链延伸产物。新生链形成以后,设计另一对引物,一个与嵌合性引物的片段B 杂交,另一个与正链DR2 后的序列互补, 这样可以保证只能检测单链延伸反应的产物而不能直接检测HBV 基因。由于部分延伸产物存在互补区域, 通过互相杂交可形成假阳性。因此,通过采用一种依赖于A TP 的脱氧核糖核酸内切酶处理,可以消除此假阳性现象。同时,rcDNA 由于包含一个对上述脱氧核糖核酸酶敏感的单链区域, 于是Singh 等用plamid-saf teTMA TP 依赖的DNA 酶消化底物后再进行PCR 扩增,提高了实验的特异性。
    3. 4 　非PCR 扩增法———入侵检测( Invader asssay)入侵检测是近年来刚开始应用的技术。其基本原理是根据目标DNA 设计一对探针,一个探针称为初始探针( Primary probe) ,另一个称为入侵探针( Invader probe) 。初始探针的5′端一段寡核苷酸序列不与目标DNA 互补,入侵探针3′末端的单个碱基不与目标DNA 互补, Flap 核酸内切酶Ⅰ( Flapendonuclease Ⅰ) 将初始探针5′端不与目标DNA互补的寡核苷酸序列剪切下来,之后此段寡核苷酸序列与具有发光基团和淬灭集团的荧光共振能量转移( Fluorescence resonance energy t ransfer ,FRET)探针相结合,从而产生荧光信号, 能够被实时荧光PCR 仪器检测。Wong 等根据此原理,分别设计了与HBV DR2 区正链下游、负链上游相结合的两种入侵探针;当正链、负链均为完整时,产生两种荧光信号,从而可检测cccDNA ;rcDNA 由于正链含有缺口,只能产生一种荧光信号,得以和cccDNA 相区分。
    4 　乙肝病毒cccDNA 检测的临床意义
    4. 1 　在HBV相关肝癌患者组织中的分布和在其发生发展中可能的作用
　　张涛等对20 例HBV 感染的肝癌患者肝组织采用PCR 检查cccDNA ,结果9 例癌组织、13 例癌旁组织检测出cccDNA , 并且在部分血清HBVDNA 阴性的患者中,仍可在肝组织中检测出cccD-NA 。提示cccDNA 在HBV 慢性感染的自然过程中,可能持久存在,也表明cccDNA 在癌组织和癌旁组织的分布不同。
    Wong 等对21 例表面抗原阳性的肝癌患者进行了肝内总HBV DNA 和cccDNA 的定量分析。结果显示,在表面抗原阳性的肝癌患者中,肝内总HBV DNA 水平在癌组织和非癌肝组织中没有显著差异,但癌组织中的cccDNA 高于非癌肝组织。在癌组织中,其cccDNA 占HBV DNA 比例也明显高于非癌肝组织。癌组织中cccDNA 占HBV DNA的比例较高的可能原因为: (1) 癌组织HBV 复制水平低于非癌肝组织; (2) cccDNA 池是肝癌形成过程中的副产品; (3) cccDNA 对肝癌的发生具有直接作用。
    4. 2 　评价乙肝患者肝脏损伤程度的可能指标之一从理论上推测,存在于肝细胞核内的cccDNA分子在肝细胞变性、坏死时可以释放到血液中,对于同一个患者而言,肝脏损伤程度越重,变性坏死的肝细胞越多, 其血液中的cccDNA 水平也就越高。Chen 等发现乙肝患者肝组织中HBVDNA 和cccDNA 均阳性,而血清cccDNA 仅于肝炎活动时检测到,而且cccDNA 和病毒载量在谷丙转氨酶上升以前就已经上升到较高水平,一旦谷丙转氨酶水平上升, cccDNA 水平就会迅速下降; 提示血清HBV cccDNA 的检测有可能作为慢性乙肝病人HBV 活化和肝脏损伤的早期信号。
    4. 3 　可能作为抗病毒药物疗效评价及停药的指标之一
　　目前临床上评价抗乙肝病毒药物疗效的主要指标包括肝功能的改善、血清HBV DNA 水平的变化、HBeAg 血清学转换以及肝组织的病理学改变等,这些指标对临床医生判断患者病情和选择抗乙肝病毒药物非常重要和实用,然而对于何时停用抗病毒药物、停用抗病毒药物后HBV 是否会重新复制活跃导致乙肝复发,仍缺乏客观有效的指标。虽然血清HBsAg 的消失或血清学的转换被认为是临床“治愈”的标准,但有研究发现,血清HBsAg 消失的患者,肝内仍可能存在HBV DNA 和cccDNA ,从而成为停药后复发的来源。目前认为,只有出现能够彻底清除cccDNA 的药物, 才能真正清除HBV ,而肝组织中cccDNA 的检测就能给治疗的时间提供参考。Werle-Lapostolle 等用实时荧光定量的方法检测了98 例处于自然史状态乙肝患者及32 例进行ADV 治疗的乙肝患者肝穿刺组织的HBV DNA 和cccDNA ;结果发现,应用ADV 治疗48 周后,患者肝细胞的cccDNA 和HBV DNA 平均下降了84 %和98 % ,并且患者外周血中HBV DNA下降的平均速率> 肝细胞的HBV DNA > 肝细胞的cccDNA。ADV 治疗时, 肝内cccDNA、肝内总HBV DNA 和血清HBV DNA 的变化与血清HB2sAg 滴度降低相关, cccDNA 拷贝数和肝内HBVDNA 水平与HBcAg ( + ) 的细胞数相关;ADV 治疗后cccDNA 水平明显下降,而HBV 抗原阳性细胞的比例没有下降,即感染的肝细胞数目并未下降,提示每个细胞内的cccDNA 水平下降了。
    Bourne 等发现肝内HBV DNA 形式能反映慢性乙型肝炎患者的血清学和病毒学应答情况,只有当肝内HBV DNA 和cccDNA 水平都下降后,才能检测到血清中HBV DNA 水平的下降; 发生HBeAg 应答的患者,其肝内HBV DNA 和cccDNA水平的绝对值下降,而与此同时cccDNA 占总HBVDNA 比例上升。
    Yuen 等对82 例接受拉米夫定治疗的慢性乙型肝炎患者进行研究,结果显示,安慰剂组24 周和52 周的总HBV DNA 和cccDNA 水平与基线水平无统计学差异,提示HBV 感染是处于一种平衡状态的。对于在拉米夫定治疗52 周出现HBVDNA 多聚酶结构域C 的酪氨酸2甲硫氨酸-天门冬氨酸-天门冬氨酸( Typrosine-methionine-aspartate-aspartate ,YMDD) 变异的15 例患者,其血清cccD-NA 的对数下降值低于无YMDD 变异的患者。发生YMDD 变异的患者在52 周时,其cccDNA 水平与基线水平相比无统计学差异。而对于在52 周发生YMDD 变异的患者,其在24 周时的cccDNA 较基线下降的对数值就低于无YMDD 变异的患者,提示24 周时的病毒抑制程度越大,其52 周发生YM-DD 变异的概率就越低。其机制可能是通过抑制病毒在感染的肝脏细胞内复制,降低cccDNA 的补给,从而打破cccDNA 的平衡状态。
    4. 4 　作为探讨是否存在肝外复制的重要指标HBV 不仅仅是一种嗜肝病毒,一些肝外组织中也可检测到HBV DNA ,如肾脏、胰腺以及外周血单个核细胞( Perip heral blood mononuclear cell , PB-MC) 等。但关于PBMC 能否被HBV 感染的问题目前仍有争议。Torii 等报道慢性乙肝和急性乙肝恢复期患者PBMC 中均存在cccDNA ,是HBV 的肝外复制场所。郭皓宇等对17 例经拉米夫定治疗取得初步疗效而停药的患者进行研究,在复发的10 例患者中,停药时PBMC 中有9 例检出HBVcccDNA ,由此可见,HBV cccDNA 的确与停药后病毒再次复制活跃有关,甚至可能是复发的来源。Ca-brerizo 等和Stoll-Becker 等也在PBMC 中检测出cccDNA。但也有报道认为PBMC 中无cccD-NA 的存在。不同的研究者得出相反的结果,可能与HBV 感染状态、PBMC 的状态、PCR 引物的设计存在差异等因素有关。
    5 　小结与展望
    目前,HBV cccDNA 的检测还没有成为临床常规的检查手段,但随着PCR 技术的进一步完善,HBV cccDNA 有可能成为临床评价抗病毒疗效的重要指标,在确定抗病毒治疗的最佳治疗方案、时间、治疗终点以建立最优的抗HBV 策略,分析机体和药物清除cccDNA 的机制,以及促进新药的研发等方面具有重要意义。同时, HBV cccDNA 的检测对研究HBV 的生物学特性、致病机制、乙型肝炎慢性化机制等方面也将具有积极的意义。

ainile

可乐咋不给我奖励了？

StephenW

springa 发表于 2011-5-5 22:39
没有没有.
是指我转的全部是从这个连接里转来的.

非常感谢你.

bigben446

interdetect 发表于 2011-5-6 08:48
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ben，如果说不能持续被补充了，那cccDNA池会不会被慢慢饿死呢？

可能（临床上那些核苷类似物治愈乙肝的应该就是例证），但是成功率低，因为cccDNA半衰期很长，最好的方法是要寻找cccDNA生活周期前的，现在有几个药物是在此之前的，还在实验中