研究报告：吴玉章的治疗用（合成肽）乙肝疫苗

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1．治疗性乙肝疫苗的研究进展。目前治疗性疫苗，是指能够打破慢性感染者体内免疫耐受、重建和增强免疫应答的新型疫苗，是抗病毒、抗肿瘤的新型免疫手段。在现阶段，关于乙肝病毒免疫耐受的机理，欧洲学派认为是树突状细胞不作为，而美国学派认为是T细胞不作为。

目前在这两个方向都有人探索治疗性乙肝疫苗。由于CTL（细胞毒性T细胞）和Th1细胞和相关的细胞因子是清除细胞内病毒的主要手段，所以有学者集中在提高细胞免疫方面做出了探讨。

从治疗性乙肝疫苗种类来说，目前主要分为蛋白疫苗、多肽疫苗、DNA疫苗这几大类。 　　蛋白疫苗：大家都是集中在HBsAg作为基础抗原，通过重组或者改变抗原提呈方式。以期达到打破机体免疫耐受的目的。由于对乙肝病毒的研究发现，preS蛋白上具有肝细胞的结合序列和Th（辅助性T细胞）表位能够增强该蛋白的免疫原性。 　　

对提高免疫应答率和打破免疫耐受有积极作用。Senturk等利用含有preS、CHO细胞来源的M蛋白组成的GenHevac B疫苗，能够诱导机体产生抗preS2抗体和抗S抗体，并降低部分慢性乙肝患者血清中的DNA拷贝数，表明GenHevac B疫苗在预防方面优于目前的S蛋白预防性疫苗，但是该疫苗不能够有效的降低免疫耐受患者血清中的病毒DNA拷贝数。而且无清除或者降低肝细胞内cccDNA（共价闭合环状DNA）含量的证据。



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Page M等利用含S（aywz和adw）、preS2-S（preS1 20-47aa ayw＋S adw）4种成分的新型多分子疫苗Hepacare。该疫苗的免疫原性更强，在小鼠、大猩猩和人体内都能够激发强烈的体液和细胞应答，该疫苗在慢性乙肝患者体内激发的主要以Th2z细胞因子为主，特异性的CD8＋T细胞增殖并不明显，虽然能够抑制病毒复制，但是CTLs活性低，依旧不能够清除肝细胞内cccDNA。治疗作用不是很理想[4,5,6]。所以增加preS成分的疫苗虽然提高了机体的免疫应答，但是只是增强了预防效果，对于作为治疗性疫苗还是远远不够的。 　　
闻玉梅等研制的抗原抗体复合物疫苗是通过抗-HBs与HBsAg混合后，增强HBsAg的提呈来诱导免疫应答，消除免疫耐受。目前临床Ⅱ期试验基本结束，没有有关治愈的报道。 　　DNA疫苗：DNA疫苗主要是通过表达质粒载体，持续表达抗原蛋白，反复刺激免疫系统。1990年，wolff通过试验证实了外源基因在体内的转染和表达，为DNA疫苗的运用奠定了基础。Davis等通过给小鼠肌肉注射表达HBsAg的DNA质粒，可以诱导小鼠能够产生体液免疫和细胞免疫。4－8周出现高滴度的抗-HBs，高水平的CTL和CTL前体细胞在1周内能够被检测到，并维持数月之久[7,8]。MegedeJZ等通过同义突变优化抗原基因，提高了疫苗的表达量，激发了更强烈的体液和细胞免疫反应。DNA疫苗通过优化后可以达到治疗性疫苗的要求。激发高水平的CTL应答。 　　
DNA疫苗免疫效果与质粒表达抗原的性质、水平和方式都有很大的关系。另外，进入体内的质粒是不可控的，它持续地在人体内表达抗原，一旦出现免疫偏差，后果非常严重，所以对人体的长期副作用还是无法评价的，DNA疫苗的安全性问题非常大。

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多肽疫苗：多肽类疫苗的理论基础是基于抗原分子表为水平的研究。由于蛋白质抗原是通过表位来体现其免疫特异性，有效的保护性免疫有赖于一组抗原表位的合理搭配和组合（在吴玉章的多肽疫苗中详细论述）多肽疫苗去除了抗原蛋白重的无效序列和免疫抑制序列。剩下的是免疫有效成分，具有高效、针对性强、副作用低的特点。由于表位的锚基序、侧翼序列影响表位的亲和力和切割提呈效率。因此，在表位优化及组合、链接方式等研究积累后，多表位多肽疫苗完全可以实现高提呈效率和应答类型的可控。目前多肽类疫苗的关键在于期免疫原性太弱。但是可以通过糖基化、脂质修饰和辅以适当的佐剂来克服。Vitiello A等用CY-1899T细胞疫苗，治疗慢性乙肝患者。该疫苗是T细胞相关表位疫苗。该疫苗包括源于核心抗原（HBcAg）第18～27位的氨基酸组成的CTL表位，源于破伤风类毒素的T辅助性细胞（Th）表位和两个棕榈酸分子。在26位健康志愿者中进行的剂量梯度实验显示出良好的安全性，并且可以诱导核心抗原的CTL反应。吴玉章等研制的TT830-843（破伤风类毒素的T辅助性细胞表位）、HBcAg18-27 CTL细胞表位、PreS218-24的B细胞表位、以及棕榈酸作为分子内佐剂，和相关表位的定位后的组成的MAP（multi-antigen peptide）已经开始临床二期。预计不久的将来人们将会看到该疫苗的治愈效果。

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小结：目前，无论是蛋白疫苗、DNA疫苗还是多肽类疫苗，国内外现有研究开发，主要集中在天然抗原选择搭配、在预防性疫苗的制剂中添加抗原或抗体的方式。而且除多肽类疫苗是在表位识别水平外，其余的都是在蛋白大分子水平上。目前所有的治疗性乙肝疫苗没有出现有效治愈的案例，没有取得突破性的进展。吴玉章首创了表位识别的氨基酸密码学说和模拟抗原的分子设计理念（我们在下面会详细介绍），来克服天然抗原的免疫弱势和蛋白大分子的免疫偏差和免疫颠覆。

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2．治疗用（合成肽）乙肝疫苗的理论基础。乙肝的感染和自愈自然痊愈的机制是慢性乙肝患者的免疫力增强，提高了Th1细胞活化比率，产生足够强的细胞免疫反应，彻底清除病毒。虽然，慢性乙肝患者的免疫力弱化，但是由于存在极少数患者通过自身免疫的增强打破了免疫耐受，为在理论上能够彻底清除病毒提供了基础。目前国内外，在这方面的研究探讨非常多，希望通过增强慢性乙肝患者的免疫系统的免疫力，纠正免疫系统的不作为，但是没有取得良好的效果。 　　
乙肝病毒进入人体后，分为感染急性期和感染慢性期。在感染的急性期，B细胞和T细胞合作共同将病毒灭。其中B细胞接受抗原提呈细胞（APC）传递的信号，开始分泌抗体，最初分泌IgM型抗体，后为IgG型抗体（主要是IgG2a）。产生的抗体与相关抗原结合后将抗原抗体复合物通过巨噬细胞和抗原提呈细胞将信号向下传递。这就是体液免疫。而免疫系统最终清除病毒的手段是细胞免疫。在急性感染期、Th1细胞大量繁殖以清除病毒，、Th2细胞适量增殖。 　　
当进入感染慢性期，Th2途径调控下的Th1细胞相关的免疫反应低下，不能死所有的肝炎病毒，使得病毒的产生和清除处于平衡状态，此时血清中的肝炎病毒滴度和肝细胞感染指标长期存在，病人进入了慢性肝炎期。所以，Th1/ Th2细胞活化的失衡导致Th1细胞、和CTL细胞的功能低下，不能够清除感染病毒的肝细胞，从而机体表现为持续感染状态。
免疫力强的患者，通过感染急性期后，能够自己痊愈。免疫力弱的患者进入感染慢性期后，自愈的概率在1％以下，基本上是认为不可治愈。 　

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乙肝病人的免疫耐受免疫耐受是乙肝慢性化的主要原因之一，表面抗原为分泌性蛋白，在慢性感染者体内，它作为耐受原清除了血清中的活化Th1细胞，使得患者的细胞免疫强度不高。同时表面抗原的变异也是目前乙肝难以治愈的因素之一。如何在体内启动Th1细胞极化和有效的细胞免疫，来克服免疫耐受成为关键问题。 　　
目前在天然抗原的组合和搭配上进行了多年的探索，依然是没有取得突破性的近展。主要是由于天然抗原产生的免疫耐受、免疫偏差、免疫颠覆基本上是同时存在，因此仅仅依靠天然抗原的组合难以解决乙肝病人的免疫耐受。

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3．免疫识别的新理论（表位生物学、氨基酸密码学说） 　　
表位生物学：目前研究表明，蛋白质抗原不是通过它的完整分子来发挥功能（与信号传递和转导的机理非常类似）。它的特异性是通过其表位来体现的。一个蛋白质抗原，它含有多种与免疫识别密切相关的表位例如：B细胞表位、Th细胞表位、CTL细胞表位等与免疫识别密切相关的结构，而且还同时存在毒性或抑制性表位、优势非中和性表位、病理与自身抗原交叉反应性表位等与保护性免疫不利的成分。 　　
人们还认识到在同一蛋白质分子的众多表位中，各表位对抗原性的贡献不同，有优势表位和非优势表位之分。此外，表位间的相对位置、构像特征、表位侧翼序列等也与表位功能的表达密切相关。

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许多研究发现，天然蛋白抗原在激发免疫反应时，不能够满足清除病原体的需要，主要是由于隐匿的保护性表位功能未能够表达。因而所引发的保护性免疫不够强大。二是所引发的免疫反应发生了免疫偏差（deviation），甚至造成T、B细胞之间、T细胞亚群之间互相，从而加重感染。因此，对于抗原性的研究需要从天然抗原整个分子水平向表位水平过渡。进入表位水平后，同一表位内氨基酸基对抗原性的贡献也不同，此外表位内氨基酸的组成和顺序决定了抗原的特异性。现代保护性免疫理论认为：有效的保护性免疫来源于一组表位的合理组合与搭配。 　　
免疫原由天然蛋白大分子向亚单位、表位多肽水平过渡后，分子量变小了，所引发的免疫应答的特异性和针对性增强了。并且摆脱了抑制性和毒性表位的影响。在分子量减小和特异性增强的同时，也产生出新的问题。一是分子量减小，造成抗原性和免疫原性的降低，从而不能激发满意的保护性免疫反应。二是修改和重新搭配后的表位所组成的短肽分子能否在体内得到正确的呈递？ 　　
通过国际上许多实验室通过对上千种不同抗原进行的免疫识别研究，积累了丰富的表位研究资料。关于提高免疫原性，目前形成了两条思路。1、恢复短肽分子的生物大分子的特性。通过采用多分枝抗原系统、融合蛋白设计等。2、设计更有效的免疫原分子。如脂质肽分子、T、B细胞表位或多表位嵌合体、分子内佐剂疫苗的设计等。 　　
有关短肽分子能否在体内得到正确呈递的问题，近年来也引起了许多实验室的关注。抗原呈递的研究进展很快，除了有MHC-Ⅰ、MHC-Ⅱ及MHC-Ⅰ、MHC-Ⅱ类似物呈递途径外，还有CD1呈递和直接呈递等多种方式。从传统的表位概念来看，CD1呈递和直接呈递尚缺乏寻找表位的方法。另外，单纯的多肽抗原在体外能有效的激活CTL细胞，但在体内则无此反应。据文献报道，加入脂类基团能够有希望解决这一问题。

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氨基酸密码学说：吴玉章根据实验发现和理论推算，提出了免疫识别过程中蛋白质抗原以其氨基酸基的组合和搭配而形成“识别码”的学说。认为蛋白质的抗原性主要由其侧链组合形式决定，推断识别码的大小约为15个氨基酸。该学说对指导今后的免疫识别研究和新型疫苗设计具有指导意义。 　　
该学说的主要观点：1、蛋白质抗原性由组成蛋白质的氨基酸顺序所决定。2、氨基酸顺序本质上是氨基酸侧链的排列和组合方式。因为多肽链的主链结构都是相同的，侧链的组合方式直接决定了肽链的亲（疏）水性、带电情况、可及性、动性及空间构像等，这些特征与蛋白质的抗原性有关，属于间接相关。3、由氨基酸基组成的“识别码”在顺序上应是宿主自身分子所没有的，以保证区分“自我”与“非我”而不引发自身免疫反应。4、为构成有效的“识别码”，蛋白质抗原不受自然氨基酸顺序限制，即可以有交叠顺序或间断顺序通过肽链折叠形成。5、不同的氨基酸基在抗原识别过程中可能有相同的贡献。有可能根据氨基酸基的抗原性进行分类。6、有效区分“自我”、“非我”的识别码大小是15个氨基酸基。大于15个基的识别码引发高动力型免疫应答；小于15个基的识别码原则上只引发低张力“联系”，且基数越少张力越低，引发自身反应的可能性越大。7、根据抗原性分类的氨基酸基是形成识别码的基本密码。8、识别码免疫原性的表达还有赖于其所处分子内的环境，如B细胞表位、T细胞表位、MHC限制位间的相对位置及其间隔顺序等。 　

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在文献中，有关该学说的提出进行了详尽的论述，主要思想是根据20种氨基酸的抗原指数，以及氨基酸的理化性质和抗原表位相关的统计，抗原抗体结合的分子机理，相关试验数据和经验，提出了该学说，该学说在吴教授的研究中也得到了实践的验证。疫苗设计的基础和方法从Jenner开始，研制疫苗就是模拟天然感染过程，对于预防性疫苗已经取得了很大的成功，为人类抵抗感染性疾病做出了重大贡献。近来的研究表明模拟自然感染过程的策略，往往不能够制备出高效的疫苗，这不单归因于细胞免疫比体液免疫更为重要，而且发现1.天然病原体的感染会通过其“不合理”的表位组分引起Th1/Th2平衡改变而继发免疫偏差、免疫缺陷或通过引发免疫活性细胞间的“互相”的机制加重感染过程和病理过程。2.由于进化的原因，天然病原体或抗原上含有各种不同的细胞因子、补体或化学趋化因子受体等高同源性顺序，从而干扰细胞间通讯，产生免疫颠覆。病原体通过这些机制逃避机体的免疫清除，而导致病原体携带状态或持续感染状态。因此新一代疫苗必须能够诱发出在性质和强度上与自然感染过程又所不同的免疫反应，所以就有了目前各种天然抗原的组合疫苗。