研究报告：吴玉章的治疗用（合成肽）乙肝疫苗

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但是，天然抗原的组合并没有获得很大的进展。随着模拟表位的发现，吴教授提出了模拟抗原的概念。在乙肝疫苗的设计中提出了模拟抗原代替天然抗原的思路。 　　
作为治疗用（合成肽）乙肝疫苗，它的理论基础就是免疫识别新理论的表位生物学，氨基酸密码学说。此外，通过吴玉章自创的基于表位的疫苗设计路线（EBVD）来实现以上理论指导下的乙肝疫苗设计。 　　
该类疫苗根据现代免疫抗原提呈理论、治疗机理的独创性和可行性，主要是通过结构化学、计算机模拟配对技术。经过分子设计，重新构建，以获得与原天然病毒蛋白结构类似，但又不同的新免疫刺激分子。在全世界，这一技术路线也只有第三军医大的吴玉章采用。该技术路线是以乙肝抗原表位图谱为基础，采用肽扫描技术、窗口分析技术和氨基酸基置换方法确定了HBV保护性抗原的B、Th、CTL细胞表位和表位内的必需氨基酸基；在此基础上，按照不同类型表位、不同抗原来源表位、不同的连接顺序、不同的化学修饰基团等，采用EBVD方案进行设计、筛选。表位组分的来源范围包括：HBV的s抗原、e抗原、e抗原的线性优势B细胞表位、T辅助细胞（Th）表位、细胞毒性T细胞（CTL）表位，来源于其他抗原的线性通用Th细胞表位、表位修饰基团。在表位修饰基团中考虑了可促进免疫活性的单链脂肪酸和糖类基团。 　　

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表位间的连接顺序采用已证明对抗原性（免疫原性）无影响的-A-A-A-或-G-G-G-或-K-S-S-。采用分子模拟方法，比较了所设计抗原多肽的结构与天然抗原之间的相似性、与MHC结合的位阻情况等，并对抗原多肽进行免疫原性、理化、生化特性分析，排序。3．治疗用（合成肽）乙肝疫苗相关机理基础治疗用（合成肽）乙肝疫苗，通过基于表位疫苗设计路线（EBVD）方法，设计特异性主动免疫治疗药物。来解决由于Th1/ Th2细胞极化的失衡导致Th1细胞、和CTL细胞的功能低下，不能够清除有感染病毒的肝细胞，从而机体表现为持续感染状态的免疫耐受问题。Th1主要参与细胞毒性T（CTL）细胞介导的细胞免疫，解决胞内感染问题中发挥重要作用。而Th2主要功能在于刺激B细胞增殖及嗜酸性粒细胞活化，促进抗体（IgG1与IgE）产生，参与体液免疫，在抗细胞外感染与致敏原引起的免疫应答中起关键作用。越来越多的证据表明Th1/ Th2细胞极化是免疫应答调节中的关键环节。Th1/ Th2细胞极化异常或缺陷均可以导致疾病，如慢性感染、自身免疫性疾病或变态反应。所以Th1/ Th2细胞极化是目前免疫应答研究的热点。现已证实，Thl、Th2细胞是Th前体细胞（pTh）在特定抗原刺激及多种信号综合作用下．发生功能性极化的结果。pTh指未受抗原刺激、处于原始状态的细胞（也称为naive cel1），在抗原刺激后分化为中间状态的Th0细胞，在多种因素的综合作用下．Th0选择性地往Thl或Th2方向分化。究竟是何信号诱导Thl／Th2极化?这种极化的分子机制是什么?已成为免疫功能紊乱与免疫调节、移植免疫、感染及肿瘤免疫等研究领域中急待弄清的环节。已有的研究表明，细胞因子、抗原、抗原递呈细胞（APC）、共刺激信号及一些基因调控因子均为Thl／Th2极化提供了重要信号。

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4．Th细胞的功能性极化对于调节机体免疫功能是至关重要的。许多免疫性疾病与Th极化异常有关，如AIDS患者体内存在着Thl向Th2应答的显著偏移，增强Thl应答能缓解病情；肿瘤细胞多分泌Th2型细胞因子使机体处于Th2优势应答状态，这可能是肿瘤免疫逃逸机制之一。Th极化是一个多信号参与的复杂过程，弄清Th1／Th2极化的分子机制，对于在免疫功能紊乱状态下诱导Th细胞极化平衡，针对不同的免疫性疾病诱导某种Th细胞的优势极化，以及发展特异性免疫治疗等，具有指导意义。 　　
我们认为理解Th1／Th2极化的分子机制与CTL的相关性是目前的治疗性疫苗的核心。 　　伤性T细胞又称为细胞毒性T细胞（CTL、主要参与抗病毒、肿瘤免疫及移植排斥反应。静止的CTL前体细胞通过其TCRαβ识别靶细胞或抗原提呈细胞表面的抗原肽一MHC l复台物”、被活化为抗原特异性的细胞毒效应细胞，并通过颗粒外吐和受体介导的机制（如Fas／FasL途径、TNF／TNFR途径等）伤靶细胞。多年的研究表明，辅助性CD4＋T细胞存在着功能性极化反应，而该极化反应的平衡对诱导或抑制CTL的活化及功能有着重要的调节作用。 　　

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机体维持正常的免疫功能状态．有赖于细胞免疫与体液免疫间的平衡，该平衡在很大程度上受CD4＋Th细胞功能性极化及CTL应答所控制。 　　
Th1细胞与CTL活化许多实验发现有效的CTL活的产生需要多步诱导及多种信号，并证实了给予Th细胞辅助比单个刺激分子更加有效： CD4＋Th细胞接受APC提呈的抗原信号后。其膜表面可大量表达CD154分子，CD154与APC细胞表面的CD40分子结合，可引起APc活化并分泌大量IL-I2，IL-12又可反过来作用于Th及CTL。表明Th1与CTL活化密切相关。 　　
在某些病毒感染细胞及肿瘤细胞可表达Fas，而CTL及Th1细胞被抗原激活后可迅速高表达FasL，但Th2却很少表达FasL，故CTL及Th1细胞可通过不依赖穿孔素的FasL途径，使靶细胞死亡。CTL在抗病毒感染的免疫反应中占有重要地位。而CD4＋辅助性T细胞亚群Th1、Th2的平衡在抵御病毒感染中起了同样重要的作用。 　　
HBV感染在大量乙型肝炎病毒感染的病例研究中．发现急性自限性肝炎与高效的CTL应答之间有着密切联系。但在慢性乙肝患者体内，CTL活性通常是较弱的，甚至缺乏。在慢性HBV感染中，肝浸润性CD4＋T细胞主要是Th0或Th2细胞；相反，在急性自限性肝炎中，肝浸润性CD4＋T细胞主要为Th1型细胞。表明以Th1为主的应答促进细胞介导的免疫，与更好地控制病毒感染及延缓慢性疾病的发作有关。 　　
慢性肝炎患者体内高水平的循环病毒抗原可能是产生CTL对抗原特异性耐受和Th1朝Th2转换的原因之一。

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治疗用（合成肽）乙肝疫苗（从本质上应该称为药物）的核心就是要上调Th1细胞的活化数量和CTL细胞的功能。以期达到彻底清除肝细胞的目的。有关体液免疫方面，我们已经取得了非常大的成功（在预防性疫苗上），但是作为治疗用（合成肽）乙肝疫苗，在提高体液免疫反应的同时，更加注重细胞免疫，加强CTL效应。该疫苗在表位设计上，利用了HBcAg来源的CTL表位（21～30位氨基酸基）、破伤风类毒素来源的通用Th细胞表位（4～17位氨基酸基）、PreS2来源的B细胞表位（34～44位氨基酸基）和棕榈酸分子（N末端）各一个拷贝。同时考虑了MHC限制位间的相对位置及其间隔顺序等。体液免疫只能够死血液里面离的病毒颗粒，对于细胞内感染需要通过细胞免疫来解决。该疫苗主要通过细胞免疫中CTL细胞的CTL效应来清除胞内感染的细胞。 　　
通过HBcAg来源的CTL表位（21～30位氨基酸基），激活细胞免疫中CTL细胞的CTL效应。同时PreS2来源的B细胞表位和破伤风类毒素来源的通用Th细胞表位，能够有效的增强CTL效应。

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这里主要介绍CTL效应是如何识别和死带病毒的肝细胞的。 　　
1．CTL的免疫识别。免疫识别是机体免疫系统产生特异性免疫的基础，通过对抗原的特异性免疫识别．激发机体产生免疫应答最终由效应细胞和，或效应分子（Ab）清除病原体或异己物质近年来，细胞毒性T细胞（CTL）引起人们的重视，发现人类面临的多种难以攻克的疾病．如肿瘤、AIDS、乙型肝炎等，CTL在疾病治愈中扮演着关键角色。 　　
CTL仅能识别表达于抗原提呈细胞（APCs）表面并与MHCⅠ类分子结合成复合物的肽类抗原。其它共刺激分子如CD3、CD8和辅助分子IFA-1、CD28等可分别与相应配体结合，提供CTL激活的共刺激信号．有助于T细胞对外来抗原的精确识别。 　　
虽然抗原在APC中加工的分子事件并不完全清楚，但已有动物实验的证据表明： 　　可能传统的MHCⅠ分子、MHC1ike分子、CD1等参与了交叉呈递和交叉激活；分子伴娘（如热休克蛋白）对于交叉呈递和交叉激活至关重要；而抗原的特性起最关键的作用。既往由于“可溶性蛋白不能在体诱导CTL活性”，因此实现可溶性蛋白在体内诱导CTL活性一直难以突破。但在这些认识的启发下通过抗原的设计对实现可溶性蛋白在体内诱导CTL活性取得重要突破。吴玉章提出了抗原工程（antigen engineering）的概念及模拟抗原（mimogen）、模拟病毒（mimovirus）的概念，采用APC靶向技术、MHCⅠ呈递途径靶向技术（proteasome靶向、endosome靶向、内质网靶向等）可启动CTL应答，探索到颗粒抗原、分子内佐剂抗原可有效在体内诱导Th1极化和CTL应答。在此基础上，建立了基于表位的治疗性疫苗设计路线（epitope．based vaccine design，EBVD），并筛选到了乙肝和肿瘤治疗性疫苗的先导结构。 　

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2．CTL抗原直接识别和活化机制。吴玉章在实验研究中发现一些经特殊修饰（如：磷酸化、人工糖基化）的多肽抗原可直接活化CTL。T细胞作为非职业APC的意义目前并不清楚，但直接被抗原活化则具有重要的理论意义和应用价值。此种识别是由传统MHCⅠ类分子介导或是其它分子介导正在进一步研究中。非职业APC表面的空（未结合表位）MHCⅠ类分子、MHC-like分子的代谢动力学及其意义是弄清这一问题的前提。

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3．CTL的效应机制。CTIL的效应机制一般认为，CTL细胞毒作用主要依赖于穿孔素－颗粒酶途径和FasL-Fas介导的细胞凋亡途径。前者发生较早，约占细胞毒60％一70％权重，后者发生较晚，约占30％一40％权重。 　　
不同细胞毒T淋巴细胞亚群的伤靶细胞机制略有不同CD8＋ CTLs主要通过颗粒依赖性途径伤靶细胞和病原，DN CTL（CD8- CD4-）主要是通过FasL-Fas介导且不能伤病原体；而CD4＋CTLs可通过任一途径伤靶细胞。 　　
在细胞内感染CTL清除病原体的作用是否以牺牲宿主细胞功能为代价?最近国外两家实验室在乙型肝炎模型证实：乙肝抗原特异性CTL在清除病原的同时并不造成肝功能损害。吴玉章的实验结果也证实了这一现象。有人推测疾病状态下CTL造成肝功损害是由于病毒非特异性CTL所致。这提示CTL的效应机制及其在肿瘤和细胞内感染中的不同之处目前还不完全清楚。
相关机理基础小结：从上面有关乙肝免疫耐受的机理、治疗用（合成肽）乙肝疫苗有关的免疫识别理论（表位生物学、氨基酸密码学说），影响Th1/Th2细胞极化的多重因素，CTL效应与Th1/Th2细胞极化的关系，CTL免疫识别和效应，以及吴教授的基于表位的疫苗设计路线（EBVD）的阐述来看。我们认为该疫苗的设计路线新颖，理论成熟可靠，具有很高的实用价值。打破乙肝病毒免疫耐受的概率极大。

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4．治疗用（合成肽）乙肝疫苗相关实验情况。吴玉章采用Chou和Fasman方法预测adw，adr，ayw三种亚型的己肝病毒Pre-s2蛋白的二级结构，并用双亲性方案和亲水性方案分析了抗原表位。结果显示三者均可能含有较多的β-片层和β-转折，N末端30个基所形成的二级结构较保守，而c末端顺序的构象在亚型间差别较大，Th细胞识别的表位可能在39-49肽段，B细胞识别的袁位可能主要在l3一l8基或其附近，为分子免疫学的深入研究提供了线索。 　　
吴玉章采用自己实验室建立的短肽点免疫结合试验，确定了Pre-S2蛋白B细胞表位的精细特异性．这对设计新一代疫苗及诊断试剂有指导意义。

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在对PreS蛋白进行了高分辨率免疫识别研究基础上，以PreS蛋白的优势B细胞表位B1、B2为基础，引入不同的Th细胞表位Thl、Th2以观察不同表位组合与搭配对免疫原性的影响；设计、合成四分枝MAP肽并与线性多肽PreS2蛋白相比较，观察分枝肽设计对免疫原性的影响。结果显示此种MAP多肽均比PreS2诱发更高抗体滴度；Th细胞表位引入可显著增强反应强度。增加肽抗原结构复杂性可提高其免疫原性，其表位排列以B细胞表位在赖氨酸核心外侧为佳，MAP是一种较好的肽苗结构。 　　
吴玉章在实验中发现，MAP肽诱发的免疫反应明显高于对照的线性Pre-S2蛋白和Pc，证明MAP肽的结构能明显提高抗原肽的免疫原性，提示分枝肽结构可能部分恢复其大分子特征。在MAP肽抗原表位经重新搭配、组合，表位分子内环境已不同于原来的天然蛋白，在恢复其大分子特性后，提高了其免疫原性。虽然表位氨基酸序列末变，但其构象是如何变化，抗原进入体内到淋巴细胞和活化需经过抗原被吞噬、降解、呈递多个复杂的环节。在体内激发的抗体是否还能识别原来的天然蛋白抗原?该研究以Pre-S蛋白为包被抗原，检测不同免疫原激发的抗体与Pre-S的交叉反应，研究发现MAP1和MAP2产生抗体都能和Pres蛋白结合，说明含有Pre-S蛋白B细胞表位的MAP肽所激发的抗体仍能识别Pre-S蛋白，因此，该抗原的免疫特异性是由特异性氮基酸序列决定MAP结构的引人是替代传统肽交联蛋白载体并提高免疫原性的有效办法。