我国科学家开发出比Cas9/sgRNA更优的基因编辑系统

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比乙肝受体现实，希望在hbv上发挥作用

齐欢畅2

2016年5月10日/生物谷BIOON/--基因组编辑技术CRISPR/Cas9被《科学》杂志列为2013年年度十大科技进展之一，受到人们的高度重视。CRISPR是规律间隔性成簇短回文重复序列的简称，Cas是CRISPR相关蛋白的简称。CRISPR/Cas最初是在细菌体内发现的，是细菌用来识别和摧毁抗噬菌体和其他病原体入侵的防御系统。


在CRISPR/Cas9系统中，酶Cas9在DNA靶位点上进行切割，其中这种靶位点是这样确定的：一种被称作CRISPR RNA（crRNA）的RNA分子利用它的一部分序列与另一种被称作tracrRNA的RNA分子通过碱基配对结合在一起，形成嵌合RNA（tracrRNA/crRNA），然后，借助crRNA的另一部分序列与靶DNA位点进行碱基配对，以这种方式，这种嵌合RNA就能够引导Cas9结合到这个靶位点上并进行切割。在实际应用时，人们可以将tracrRNA和crRNA作为两种向导RNA（gRNA）或者融合在一起形成单向导RNA（single guide RNA, sgRNA），并被用来引导酶Cas9结合到靶DNA序列上并进行切割，其中Cas9与sgRNA一起被称作Cas9-sgRNA系统。

进一步的研究还证实，CRISPR/Cas9的基因组编辑能力只有在被称作前间隔序列邻近基序(protospacer adjacent motif, PAM)的短片段DNA序列的存在下才成为可能。只有DNA靶位点附近存在PAM时，Cas9才能进行准确切割。再者，PAM的存在也是激活酶Cas9所必需的。

尽管科学家们已采用多种方式对CRISPR/Cas9系统进行优化来提高它的效率和特异性，它仍然存在一些不足之处，如CRISPR/Cas9系统仍然会在脱靶位点（在这些位点上，gRNA与靶DNA序列之间存在错配）进行切割，这种脱靶切割有可能导致很多有害的后果，如癌症产生；向导RNA容易形成二级结构，等等。

在一项新的研究中，来自中国河北科技大学和浙江大学医学院的研究人员发现类似于Cas9，来自Argonaute蛋白家族的核酸内切酶也利用寡核苷酸作为向导降解入侵的基因组。具体而言，他们发现来自格氏嗜盐碱杆菌（Natronobacterium gregoryi）的一种Argonaute蛋白（NgAgo）作为一种核酸内切酶，在向导DNA（guide DNA, gDNA）的引导下，能够在人细胞中进行基因组编辑。相关研究结果于2016年5月2日在线发表在Nature Biotechnology期刊上，论文标题为“DNA-guided genome editing using the Natronobacterium gregoryi Argonaute”。论文通信作者为河北科技大学生物科学与工程学院韩春雨（Chunyu Han）副教授。

来自格氏嗜盐碱杆菌的Argonaute蛋白利用单链gDNA切割靶DNA

尽管来自嗜热栖热菌（Thermus thermophilus）的Argonaute蛋白（TtAgo）或来自强烈炽热球菌（Pyrococcus furiosus）的Argonaute蛋白（PfAgo）在5’端发生磷酸化的单链DNA存在下能够在体外切割DNA靶序列，但是它们都需要非常高的反应温度（>65 °C），这就使得它们不能够应用于哺乳动物细胞中。为了解决这一问题，研究人员利用PSI-BLAST搜索工具以TtAgo和PfAgo氨基酸序列为对象，在美国国家生物技术信息中心（NCBI）非冗余蛋白序列数据库种进行搜索，从中鉴定出一种潜在的候选蛋白：来自格氏嗜盐碱杆菌SP2菌株的Argonaute蛋白（即NgAgo）

研究人员接着设计三种5’端发生磷酸化的长24个核苷酸的单链gDNA，其中两种单链gDNA彼此互补（记为FW和RV），而且能够结合到pACYCDuet-eGFP质粒的靶位点上；第三种单链gDNA含有随机的碱基序列，但不与这种质粒互补（记为NC）。此外，他们还设计了一对5’端发生磷酸化的单链gRNA，它们也能够结合这种相同的靶位点上。结果证实，在没有gDNA存在时，或者在NC gDNA存在时，NgAgo都不能切割这种质粒。当FW或RV gDNA存在时，NgAgo能够在37 °C下让这种超螺旋的质粒产生切口。当FW和RV gDNA同时存在时，NgAgo能够让这种质粒线性化。但是，在5’端未发生磷酸化的单链gDNA或者5’端发生磷酸化的单链gRNA存在下，NgAgo都不能切割这种质粒。

因此，NgAgo当与5’端发生磷酸化的单链gDNA结合时能够在37 °C下切割靶双链DNA。

NgAgo结合单链gDNA，并导致靶DNA发生双链断裂

为了评估NgAgo是否能够作为一种基因组编辑工具进行使用，研究人员首先在293T细胞中表达NgAgo，并研究它是否与人细胞中的内源性核酸结合，结果他们并未检测到与从293T细胞中纯化出来的NgAgo相结合的核酸，这提示着人细胞中存在的5’端发生磷酸化的单链DNA是非常少的，而且即便存在内源性的单链DNA，也不会将NgAgo引导到脱靶位点上。

研究人员利用编码NgAgo的质粒和这些人工合成的长24个核苷酸的单链gDNA或gRNA（5’端发生或未发生磷酸化）转染293T细胞时，发现NgAgo只能结合5’端发生磷酸化的单链gDNA，而不能结合单链gRNA和5’端未发生磷酸化的单链gDNA。

当将编码NgAgo的质粒转染到293T细胞24小时后再将5’端磷酸化的单链gDNA运送到这些细胞中时，研究人员发现NgAgo结合单链gDNA的数量显著下降，这提示着当NgAgo表达时，它只有在较短的时间内装载单链（或者说结合）gDNA。与这相一致的是，当从293T细胞中纯化出来的未装载单链gDNA的NgAgo在37 °C下即便与单链gDNA在体外孵育长达8小时，单链gDNA也不会装载到NgAgo上。再者，单链gDNA在体外只能在比较高的温度（55 °C）下装载到NgAgo上。只有从已进行单链gDNA转染的293T细胞中纯化出来的NgAgo，而不是在37 °C下与单链gDNA（FW gDNA，或者RV gDNA）孵育的NgAgo，才能在体外切割靶DNA。

进一步的实验证实从已进行NC gDNA转染的293T细胞中纯化出来的NgAgo随后在37 °C下即便与FW gDNA在体外孵育8小时也不能切割靶DNA。这些结果表明NgAgo非常忠实于它的初始单链gDNA，不能够在37 °C下进行单链gDNA交换。不过在55 °C下，NgAgo能够交换单链gDNA，即重新装载单链gDNA，但这时，NgAgo不能象37 °C下装载单链gDNA时那样高效地切割靶DNA，这是因为55 °C高温会降低NgAgo的酶活性。此外，在切割靶DNA时，NgAgo会在双链DNA（不是单链DNA）的靶位点内移除几个核苷酸。

研究人员在哺乳动物细胞中比较NgAgo-gDNA系统和Cas9-sgRNA系统的编辑效率，发现NgAgo-gDNA系统让靶基因失活的效率与Cas9-sgRNA系统一样高。利用这种方法，他们还证实对NgAgo而言，单链gDNA的最佳长度是24个核苷酸左右。

广泛的基因组靶向范围和较低的错配耐受性

研究人员测试了NgAgo对人基因组上的内源性靶位点进行编辑的能力。为此，他们对NgAgo进行修饰，将一种核定位信号（nuclear localization signal）附着到它的氨基端上确保NgAgo位于细胞核中。他们设计出5个针对人DYRK1A基因第11外显子的单链gDNA，然后通过T7核酸内切酶I（T7EI）检测和DNA测序，证实这5个gDNA均能引导NgAgo高效地切割靶DNA序列。

研究人员还测试47个靶向作用于8种不同基因的单链gDNA，他们发现这些gDNA的基因组编辑效率（21.3～41.3%）具有可比性，而且也没有观察到NgAgo对具有特定性质的序列具有明显的偏好性。

研究人员还在包括乳腺癌细胞系MCF-7、人骨髓细胞系K562和HeLa细胞系在内的多种哺乳动物细胞系中测试了NgAgo-gDNA系统，结果发现在所有这些细胞系中，NgAgo都能够高效地诱导DYRK1A基因靶位点发生双链断裂。

为了研究单链gDNA与靶DNA序列之间的核苷酸错配对NgAgo活性的影响，研究人员先针对一个DYRK1A基因靶位点设计出一个长24个核苷酸的单链gDNA，然后在这个单链gDNA的每个位置上引入单核苷酸错配。他们发现NgAgo介导的靶DNA切割对这个gDNA每个位置上的单核苷酸错配非常敏感：切割效率下降了73～100%，其中P8～P11位置上发生的单核苷酸错配导致最大的切割效率下降（85~100%）。他们还发现任何3个连续位置发生错配会完全破坏这种切割。

为了研究当单链gDNA长度发生变化时，NgAgo是否仍然对单核苷酸错配敏感，研究人员合成出长21个核苷酸的单链gDNA，结果发现这个长度缩短的gDNA任何位置上发生的单核苷酸错配仍然极大地破坏NgAgo活性；尽管gDNA长度发生变化，P8～P11位置上发生的单核苷酸错配仍然是破坏NgAgo活性最大的关键位置。考虑到Cas9-sgRNA系统甚至能够耐受5个核苷酸错配，这些实验初步地证实NgAgo-gDNA系统是高度保真的。

研究人员比较了NgAgo-gDNA和Cas9-sgRNA系统切割哺乳动物基因组上的DYRK1A基因靶位点的效率，结果发现两者的切割效率是可比的（前者是31.97%，后者是32.2%）。接着，他们还研究了NgAgo-gDNA在靶向切割富含G+C的DNA位点上是否优于Cas9-sgRNA。确实，他们证实相比于NgAgo-gDNA，Cas9-sgRNA切割HBA2基因和GATA4基因上富含G+CDNA位点的效率要差很多。因此，NgAgo-gDNA系统比Cas9- sgRNA有潜力用于更为宽广的基因组位点。再者，Cas9要发挥切割作用，必须要求靶位点紧靠在PAM的上游，而诸如NgAgo之类的Argonaute蛋白则没有这种靶序列限制。

NgAgo准确地将DNA片段插入到基因组中

为了验证NgAgo能够靶向切割哺乳动物基因组，研究人员测试了NgAgo-gDNA系统是否能够被用来编辑基因组。同源重组修复（homology-directed Repair, HDR）介导的供者序列捕获是一种广泛采用的策略，可被用来产生特异性的基因组修饰。为此，研究人员设计出一种由报告基因区和G418抗性基因组成的供者DNA片段，其中这种报告基因区由两个阅读框组成：一个阅读框编码mRFP，另一个是无法阅读的编码eGFP的序列，这两个阅读框由TGA终止子分隔开。这种报告基因区没有启动子，因此正常情形下，不会表达。在将编码NgAgo的质粒、单链gDNA和这种供者DNA片段转染进293T细胞后，研究人员检测到表达mRFP的细胞，并且证实在这些细胞中，供者DNA片段准确地插入到所需的位点中。在进行G418筛选后，他们分离出含有这种供者DNA片段的细胞克隆株。

此外，研究人员还利用NgAgo-gDNA系统靶向切割这种阳性细胞克隆株中的TGA终止子。由非同源性末端连接（nonhomologous end joining, NHEJ）介导的不精准基因组修复让这种TGA终止子发生突变，从而使得mRFP-eGFP嵌合蛋白表达。利用流式细胞仪进行分析，他们检测到11.7%的细胞是eGFP阳性的，这就证实NgAgo-gDNA能够对哺乳动物基因组进行高效地编辑。

最后，当利用Cas9-sgRNA和NgAgo-gDNA系统---其中，Cas9的剂量和NgAgo的剂量相同---分别导入293T细胞中靶向基因组相同位点时，Cas9而不是NgAgo导致供者DNA片段插入到脱靶位点中。

总之，这种NgAgo-gDNA系统设计方便，gDNA可直接转染细胞，而无需构建专门的gDNA表达载体；NgAgo可编辑基因组内任何位点，而Cas9的基因组靶点必须位于PAM序列的上游，而且不能富含G+C；所使用的gDNA是DNA而非RNA，不会像RNA那样容易形成二级结构而导致失效或脱靶效应；对游离于细胞核的DNA具有更高的切割效率。由此可知，相比较于Cas9-sgRNA，NgAgo-gDNA具有更大的优势，规避了令人头痛的脱靶效应，其应用前景是不言而喻的。更难能可贵的是，在Cas9-sgRNA成为全世界各大实验室争相使用的香饽饽时，这项研究发现的新基因编辑系统具有如此巨大的优势，向它发出有力的挑战，也难怪也会在国内引发一阵热潮。

齐欢畅2

地球文明开始进入设计生命阶段。

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欢畅，正能量，绝对是正能量

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避免脱靶

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科技日报：基因编辑技术 “哪家强”
来源：科技日报时间：2016-05-13



5月2日，《自然》系列顶尖刊物《自然生物技术》在线发表了一项关于基因编辑技术的研究成果，这项成果出自河北科技大学一位名不见经传的副教授韩春雨和他的团队。



图为韩春雨（右）与其合作者沈啸（左）、高峰（中）。



与以前效率低下的DNA编辑方法相比，基因组编辑工具CRISPR/Cas9提供了一条捷径。它就像一个DNA剪刀手，剪开特定RNA序列指向的地方，开启细胞DNA的修复过程。

5月2日，《自然》系列顶尖刊物《自然生物技术》（《Nature Biotechnology》）在线发表了一项关于基因编辑技术的研究成果，并被评价为“具有带来技术和产业变化的潜能”。这项成果不是来自麻省理工，也不是来自哈佛、斯坦福，而是出自河北科技大学一位名不见经传的副教授韩春雨和他的团队。

“该成果属于‘中国创造’的尖端生物技术，不仅打破了外国基因编辑技术的专利垄断，而且还有自己的特点和优势，研究水平可与国际一流大学同领域教授的工作相媲美。”中国科学院动物研究所研究员李伟博士认为，韩春雨创造的这一基因修饰新技术，未来的应用前景非常明确也非常广阔。

“但是作为一种新的工具，可能还需要在应用的过程中不断的去完善去打磨。” 李伟说，“就像切肉一样，一开始我们拿砍刀去切，后来发现还能把刀做的更加精细，更加小巧，这样可以切出更好的效果来。”

横空出世的DNA剪刀

长期以来，科学家们只能通过物理和化学诱变、同源重组等方式对DNA进行编辑。但这些方法都不够方便和精确，直到2012年， CRISPR/Cas9让科学家们看到了希望

对于这项轰动了中国生物界的研究成果，韩春雨所在单位——河北科技大学5月6日在其官网上贴出如是介绍：“该研究成果找到了对基因组位点编辑范围更广的基因编辑工具。该工具完全不同于以RNA为向导的CRISPR/Cas9基因编辑技术：这种从古细菌来源的Argonaute（简称NgAgo），利用短链DNA作向导，真正实现了对基因组的任意位置进行切割，将基因编辑的可能性推入了更广泛的境地。”

自从科学家发现生命的遗传密码主要存在于DNA双螺旋结构以来，人类就开始幻想着能通过一些基因编辑技术，对DNA核苷酸序列进行删除和插入等操作。

“换句话说，人们想要通过基因编辑技术来改写DNA这本‘生命的无字天书’，就像用电脑编辑一篇word文件，可以利用鼠标和键盘等手段进行编辑。”李伟说。然而长期以来，科学家们只能通过物理和化学诱变、同源重组等方式对DNA进行编辑。但这些方法都不够方便和精确。直到2012年，一种名为“CRISPR/Cas9”的DNA剪切技术横空出世，让科学家们看到了希望。

CRISPR被称作“规律间隔成簇短回文重复序列”，是在一些细菌基因组内存在的一系列成簇排列的DNA序列，是源于细菌及古细菌中的一种后天免疫系统。科学家们发现，这些重复序列和很多能够侵入细菌的噬菌体的DNA序列相同。

进一步研究发现，这些序列在被转录成为RNA后，能够和细菌产生的一类称为CRISPR关联蛋白Cas9的蛋白质形成复合体，起到导向作用，因此这段RNA也被称为导向RNA。当复合体检测到入侵的DNA和导向RNA序列一致时，Cas9蛋白就能够切割入侵的DNA，结合细菌沉默病毒等入侵者的遗传信息的关键部分，达到防御病毒等目的。

CRISPR展现“惊人实力”

它就像一个DNA剪刀手，剪开特定RNA序列指向的地方，开启细胞DNA的修复过程，由于Cas9系统优异的指向性和特定性，一问世就获得了科学家们的青睐

与以前效率低下的DNA编辑方法相比，新出现的基因组编辑工具CRISPR/Cas9提供了一条捷径。它就像一个DNA剪刀手，剪开特定RNA序列指向的地方，开启细胞DNA的修复过程。由于Cas9系统优异的指向性和特定性，一问世就获得了科学家们的青睐。

科学家们认为，CRISPR可能是自20世纪70年代生物技术时代开启以来出现的最重要的基因工程技术。CRISPR系统具有搜索和替换DNA的双重功能，可以让科学们通过替换碱基，轻松的改变DNA的功能。在过去的研究中，科学家们已经证实，利用CRISPR可以治疗小鼠的肌肉萎缩、罕见肝脏疾病，使人类细胞免疫HIV等惊人的功能。

2015年7月，一个韩国科学小组利用CRISPR RNA引导的工程核酸酶修复了两个频发的大的染色体倒位——它们导致了近一半的重症血友病A病例。这是第一次证实可以用可编程核酸酶纠正患者染色体倒位和其他大型的染色体重排。

复旦大学生命科学学院遗传工程国家重点实验室的研究人员，也通过CRISPR/Cas9技术进行特定基因敲除，快速、高效地构建了血友病乙模型小鼠，以期为血友病乙的研究提供更加便捷的途径。甚至还有研究者用CRISPR成功治疗了患有遗传性肝病和肌营养不良的动物。

令人担心的问题不止一个

CRISPR/Cas9系统自身也存在一些缺陷，比如进入细胞后，有可能在非目标位点进行酶切，从而导致脱靶，如此可能会引发癌症而非治愈癌症

随着对CRISPR/Cas9系统的研究深入，该技术现已广泛地应用于生物领域的各个方面，在动物基因功能和转基因动物研究等方面，提供了简易、实用的基因组定点编辑技术。

然而，CRISPR/Cas9系统自身也存在一些缺陷，比如进入细胞后，有可能在非目标位点进行酶切，从而导致脱靶，如此可能会引发癌症而非治愈癌症。

“CRISPR脱靶效应常被人们挂在嘴边，这也是该技术最大的隐患之一。但脱靶效应并不是CRISPR唯一令人担心的问题。”李伟透露，目前，研究者们往往只能借助病毒载体把编码Cas9的DNA带入细胞。也就是说，Cas9完成切割任务之后细胞仍会继续生产这种蛋白。这种情况下，就算是特异性非常高的Cas9也可能会发生脱靶，机体也可能会对其产生免疫反应。

“传统基因疗法面对的许多难题，也是CRISPR前进的障碍。比如，基因编辑的细胞会死亡，患者需要进行多次治疗。病毒载体的递送能力限制着基因编辑的效力。CRISPR研究者往往需要两种病毒载体将CRISPR组分送入细胞，大大降低了效率和成功率。”李伟说。

新工具的新亮点

在整个生物界基因编辑技术一枝独秀的情况下，韩春雨另辟蹊径，找到了一种全新的基因编辑工具NgAgo，为基因编辑应用提供了更好的技术和更加多样化的选择

NgAgo是Natronobacterium gregoryi Argonaute这一短语的简称。韩春雨团队就是利用格氏嗜盐碱杆菌（Natronobacterium gregoryi）的Argonaute蛋白实现了DNA引导的基因组编辑，并发现NgAgo作为一种DNA介导的核酸内切酶，适合在人体细胞中进行基因组编辑。简而言之，之前的方法是通过RNA寻找替换序列，而新技术通过DNA作为介导寻找替换目标。

“在需要编辑的基因组上，CRISPR/Cas9系统需要19个配对的碱基，并且这19个碱基后面必须紧邻一个特殊的碱基序列。”李伟介绍。

“Cas9的‘取材’范围有限，NgAgo的优势之一，就是大大扩充了基因编辑的取材范围。”韩春雨在接受媒体采访时表示，“在新技术帮助下，地球上大部分生物的基因都可成为基因编辑工具，这意味着基因编辑技术受限更小，便利性更大。”

此外，新的基因编辑工具精确性更高。李伟介绍，NgAgo要结合24个碱基，比Cas9结合的19个碱基要长5个碱基，理论上其精确性会提高1024倍。

“DNA编辑技术就相当于word中的‘查找’‘替换’工具，如果需要替换的是‘的’‘地’‘得’这种高频文字，那么有可能会把不需要替换的地方也替换了，但如果要找‘一种DNA介导的核酸内切酶’这样的词组，则不太可能找错。”李伟说。

韩春雨团队的研究发现，NgAgo–gDNA系统对向导序列-靶序列错配容忍度很低。目标DNA序列上任何一个碱基的变换都会降低NgAgo的切割效率，如有三个错配则会使其完全失活。这在另外一个机制上提高了NgAgo使用的精确性。

李伟认为，在整个生物界基因编辑技术一枝独秀的情况下，韩春雨另辟蹊径，找到了一种全新的基因编辑工具NgAgo，为基因编辑应用提供了更好的技术和更加多样化的选择。

东霸天

中国又出来吹牛逼了  哎   中国要是能有办法功能性治愈乙肝   太阳从西面出来了  大象都会上树

山野菜面

回复 东霸天 的帖子

首先，这是发表在《nature》的文章，不是国内的垃圾期刊，影响因子和可信度很高；其次，这是在基因编辑领域里的研究，至于乙肝的治疗是其应用的研究。不要一味的妄自菲薄，也不要自欺欺人。

山野菜面

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首先，这是发表在《nature》的文章，不是国内的垃圾期刊，影响因子和可信度很高；其次，这是在基因编辑领域里的研究，至于乙肝的治疗是其应用的研究。不要一味的妄自菲薄，也不要自欺欺人。