治疗用（合成肽）乙型肝炎疫苗（εPA44）项目工作总结

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一、

前言

慢性乙型病毒性肝炎是由乙型肝炎病毒（HBV）引起的肝脏疾病。约10－20%的病人会发展成肝硬化，每年有1-4％的肝硬化病人发展成肝癌。乙型肝炎病毒（Hepatitis B virus，HBV）是已知仅次于烟草的人类致癌原[1]。

当前，对乙型肝炎病毒慢性持续感染状态（包括病毒携带者、慢性肝炎）尚无特效治疗手段。干扰素（IFN-α/β，IFN-γ）及肿瘤坏死因子（TNF-α）被证明能下调感染细胞HBV的复制和基因表达，复制中的DNA中间体和转录模板等对它具有敏感性，但并不能清除病毒[3]。拉米呋定（3TC）是第一个用于临床的核苷类抗乙肝病毒药物，能明显降低病毒水平，减低病毒血症。但却很难清除病毒。实际上，临床研究也很少发现HBsAg转阴的病人[2,4]。因此，急需要发展有效治疗乙型肝炎病毒慢性持续感染状态的手段。

自1996年以来，国内外许多实验室和公司，如Pasteur Institute、Viagene公司、Vical公司、Cytel公司、国内闻玉梅研究组等致力于此方面的研究。采用DNA疫苗、重组蛋白疫苗、免疫复合物、多肽疫苗等技术进行了探索[5]。虽然在体外和动物实验取得一定效果，但是仍然未克服采用天然抗原所带来的共同问题。由于进化、免疫遗传学等方面的原因，HBV慢性感染持续状态个体对天然抗原处于耐受状态。 既往研究表明：天然抗原既含有优势中和性（保护性）表位，又含有优势非中和性表位、非优势中和性表位、交叉反应性表位、致病性表位等。后者可引起免疫偏移、免疫颠覆等不利的免疫反应而导致免疫耐受。因此用天然抗原克服此耐受状态非常困难，应屏除对保护性免疫不利的表位组分，必须进行天然抗原改造，以打破机体的免疫耐受状态。国内外研发单位采用的天然抗原的免疫治疗效果，不论是DNA疫苗还是重组蛋白疫苗，均不理想。

治疗用（合成肽）乙型肝炎疫苗是由第三军医大学全军免疫学研究所和重庆佳辰生物工程有限公司联合研制的国家I类新生物制品。研制单位提出了用模拟抗原（英文译名为Mimogen）进行特异性免疫治疗的思路。模拟抗原应在抗原特性上与天然抗原不同，而引起的免疫反应特异性与天然抗原无异。它摒除了致病性的表位、优势性非保护性表位、亚优势性保护性表位、交叉反应性表位等不利组分，因而具有更好的




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针对性。
近年来，国内外的研究阐明：①HBV作为一种嗜肝病毒，并不能直接引起肝细胞损伤，其感染的病理和临床后果取决于免疫机制。②作为细胞内感染，慢性持续性感染状态主要与机体细胞免疫应答太弱有关。其中，HBV特异性细胞毒性T淋巴细胞（cytotoxic T lymphocyte，CTL）反应决定了HBV感染的最终结果。感染HBV后CTL活性高者体内病毒被清除而痊愈；CTL活性低或测不到的感染者则发展为慢性持续感染状态[6]。③在HBV的抗原中，核心抗原（HBcAg）所诱发的CTL反应与感染的转归相关性最好[7]。Chisari领导的研究小组将其优势性表位确定在18-27顺序[8]。该表位被认为是HLA-A2限制性的，由于HLA-A2阳性人群在人类约占50-60%，因此，认为它有很大的应用前景。后来又发现，它还可诱发HLA-II类分子限制的T细胞应答。因而，可能有更大的人群适用性。因此，该表位被本研究所采用。
随着HBV特异性CTL表位的不断发现及鉴定，使得人们开始采用CTL表位诱导CTL应答，以治疗慢性持续感染状态。但国内外多家实验室直接采用天然CTL表位多肽免疫HBV感染个体，不能有效在体内诱导CTL应答，治疗效果不够满意。表明单一表位的多肽并不是构建治疗性疫苗的一种有效形式。如何根据抗原表位图谱构建有效免疫原成为当前亟待解决的问题。现代保护性免疫理论认为有效的免疫原应由一组（a set）表位组成。但如何确定表位的合理的组合和搭配，尚无技术方案。大量实验证明：单独使用单表位多肽由于其免疫原性太低，不能取得满意效果。因此，如何根据表位构建免疫原成为亟待解决的问题。本研究采用了自主创立的根据表位设计疫苗（英文译名为：EPITOPE-BASED VACCINE DESIGN，EBVD）的技术路线，并采用该路线设计、筛选和研究[9]。
治疗用（合成肽）乙肝疫苗的研制设想是通过对天然抗原的免疫识别研究弄清抗原的表位图谱及其精细结构-功能关系，通过分子设计的手段以表位图谱为基础设计能诱发理想免疫反应的免疫原（计算机辅助疫苗设计），在体内诱导HBV特异性细胞免疫应答，为HBV慢性持续感染状态提供特异性治疗手段。通过自行创立的基于表位的疫苗设计技术路线（英文译名为：EPITOPE-BASED VACCINE DESIGN，EBVD）设计、筛选出三表位多肽抗原、加用棕榈酸为分子内佐剂克服了可溶性蛋白难以在体内诱导Th1

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极化和CTL应答的问题；通过采用模拟抗原而非天然抗原以克服机体对HBV天然抗原的免疫耐受；采用脂质体剂型将抗原投入MHC I 类分子限制性呈递途径，以诱导CTL应答。经过临床前药学、药理毒理学研究证实本产品达到设计要求，动物实验证明本品诱导Th1极化、诱导HBV特异性CTL活性并抑制病毒复制和抗原分泌，对HBV慢性持续感染状态有较好的治疗效果，在动物毒理评价试验中证明本品安全性良好。
治疗用（合成肽）乙肝疫苗的临床前系列研究概述如下：

药效学特性
参照SFDA、FDA和WHO的有关要求和文献资料，对试品进行了体外、体内药效学研究。体外实验采用HLA-A2阳性健康人、乙型肝炎病毒（HBV）携带者、急性乙型病毒性肝炎病人、慢性乙型病毒性肝炎病人各20例的外周血单个核细胞（PBMC）为实验对象，设0、0.1、0.4、2.0、10.0、50.0 ng/106 PBMC 6个剂量组，将试品加入PBMC培养液中培养后，采用3H-TdR掺入法检测淋巴细胞增殖活性；采用ELISA法检测Th1型细胞因子分泌；采用IFN-γELISPOT法检测PBMC中IFN-γ分泌细胞数，以检测试品的免疫原性和诱导Th1极化效应；分别用HepG2.2.15细胞(HBV全基因转染的人肝癌细胞系)、表位肽负载的E6细胞（HLA-A*0201质粒转染的P815细胞系）和表位肽负载的T2细胞作为靶细胞，采用标准51Cr释放实验，检测试品诱导PBMC产生的HBV特异性细胞毒性T细胞对上述靶细胞的特异性细胞毒作用；以HepG2.2.15细胞为模型细胞，观察试品通过作用于PBMC形成 HBV特异性效应细胞而产生的抗病毒效果。结果表明：试品可诱导HLA-A2阳性健康人、HBV携带者、急性肝炎恢复期患者和慢性肝炎患者的PBMC增殖，在0.4-10.0 ng/106PBMC剂量范围内呈剂量依赖性反应；试品在体外可诱导Th1极化及IFN-γ分泌细胞扩增，其中试品在0.4～50.0ng/106PBMC范围内，IFN-γ的分泌呈剂量依赖性反应；在0.4～10.0ng/106PBMC范围内，IFN-γ分泌细胞的扩增呈剂量依赖反应；标准51Cr释放实验表明，试品在体外诱导的效应细胞可导致前述靶细胞51Cr释放增加，在0.4-10.0ng/106PBMC范围内，呈剂量依赖性反应；病毒抑制实验表明，试品体外诱导的HBV特异性效应细胞可抑制HepG2.2.15模型细胞的HBV-DNA复制和HBsAg、HBeAg分泌，在0.1-10.0ng/106PBMC范围内，呈剂量依赖性关

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系。综上所述，试品可在体外诱导HLA-A2阳性人外周血淋巴细胞增殖、诱导Th1极化、诱导产生HBV特异性细胞毒效应并抑制HBV复制和抗原分泌。
体内实验采用目前国际上通用的HBV全基因转基因小鼠模型为实验对象。首先通过预实验确定试品的有效剂量。预实验设0、1.0、2.0、5.0、10.0μg/kg 5个剂量组,每组6只，于小鼠的尾根部和双侧后足掌皮下注射1次。给药后14天活杀小鼠，检测血清IFN-γ及HBsAg和HBeAg的变化。结果表明：试品2.0μg/kg以下剂量组，未见血清IFN-γ分泌细胞数升高及HBsAg和HBeAg的明显变化；5.0μg/kg 以上剂量组，血清IFN-γ分泌细胞数明显增高，HBsAg和HBeAg下降，与2.0μg/kg 以下剂量组相比，有显著统计学差异；而5.0μg/kg和10.0μg/kg剂量组比较，无显著统计学意义。故初步确定试品的有效剂量为5.0μg/kg。在此基础上，进行试品的主要药效学实验。将小鼠随机分为5组，每组30只，试品设5μg/kg、50μg/kg、500μg/kg 3个剂量组，设空白脂质体为阴性对照组，于小鼠尾根部和双侧后足掌皮下注射给药，每周1次，共3次；设鼠源IFN-α为阳性对照组，10μg/kg皮下注射，每2天1次，共8次。于停药后第10、20、30天，各组分别活杀1/3动物，取脾脏分离淋巴细胞检测Th1极化效应；取血清，用ELISA法检测HBsAg分泌水平；取肝组织做病理检查。结果表明：各组动物一般性状良好；试品可诱导Th1极化，试品3个剂量组停药后10天，可检测到IFN-γ分泌增高，其中50μg/kg和500μg/kg 剂量组略高于5μg/kg 剂量组，但3组间无统计学意义；停药后30天，试品3个剂量组血清IFN-γ分别达到185、188、225pg/ml；试品可抑制血清中HBsAg分泌和肝组织HBV-DNA复制，试品3个剂量组停药后10天可检测到血清HBsAg水平（A450nm）和肝组织HBV-DNA拷贝数下降，其中以试品50μg/kg和500μg/kg剂量组效应略高于5μg/kg剂量组，但无统计学意义；观察至停药后第30天，试品3个剂量组HBsAg水平（A450nm）降至阴性对照组10%以下、肝组织HBV-DNA拷贝数降至阴性对照组5%以下。与IFN-α组比较，停药后10天，试品各剂量组对血清HBsAg肝组织HBV-DNA抑制效应低于前者；停药后30天，试品各剂量组上述效应均明显高于前者。停药后20天，IFN-α治疗组血清HBsAg和肝组织HBV-DNA拷贝数已回复至阴性对照组水平；而停药后20天和30天，试品各剂量组血清HBsAg和肝组织HBV-DNA拷贝数等指标仍维持在较低水平。病理检查表明，

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各组小鼠肝脏未见明显差异。在进行药效学试验同时，观察了小鼠体重、胸腺、肝、脾、肾、脑等器官重量、血白细胞计数及分类、皮肤迟发型超敏反应、ConA与LPS刺激的有丝分裂反应、同种混合淋巴细胞培养等指标。试品治疗组与阴性对照组比较，上述实验各指标未发现有统计学意义的变化。以上结果表明，试品可在体诱导Th1极化，抑制血清HBsAg，抑制肝内HBV复制，并对肝脏和免疫系统无明显损害。

一般药理学研究
选用日本大耳白兔，Wistar大白鼠、昆明种小鼠和家猫进行一般药理实验。分别测定εＰＡ４４成品经皮下和静脉两种给药途径用药、500g/kg（100倍临床拟用剂量）和250g /kg（50倍临床拟用剂量）两个剂量对心血管功能、呼吸功能和神经系统功能的影响。
结果显示，在所用剂量范围内，皮下注射和静脉注射εＰＡ４４对日本大耳白兔、家猫血压和心电等循环功能不产生明显作用，呼吸功能也不受εＰＡ４４用药的影响；εＰＡ４４对大鼠顶叶脑皮层电位不产生影响；在本实验条件下，εＰＡ４４不影响小鼠空中翻正行为；静脉注射εＰＡ４４ 500g /kg组小鼠的痛觉反应潜伏期（17.2±1.13）略长于对照组，但无统计学意义，说明εＰＡ４４对小鼠的痛觉反应无明显影响；皮下注射εＰＡ４４ 500 g/kg后，小鼠的连续通道活动有所提高，但无统计学意义，说明εＰＡ４４对小鼠的连续通道活动不产生明显影响。

药代动力学研究
以小鼠、大鼠和猕猴为实验动物，设皮下注射和静脉注射两种给药途经给药。其中，在小鼠设0.4、0.8和1.6 g/鼠3个剂量组。观察本品的药代动力学特征。结果表明：
小鼠皮下注射125I-εＰＡ４４脂质体后0～120h内，泌尿系统和注射部位总放射性浓度最高，肌肉、脂肪、心脏和脑浓度最低。其中，泌尿系统、注射部位和胆囊浓度高于血清，其它组织均低于血清。注射部位酸沉淀放射性最高。尿、肾、膀胱和肠内容物比值最低，表明这些组织中所含的放射性主要是125I-标记降解代谢物。而一些

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重要组织如注射部位皮肤及皮下组织、心、肝、脾和肺等组织比值较高。
小鼠静脉注射125I-εＰＡ４４脂质体后0～8h，尿和网状内皮系统如肺脏、脾、肝、肠淋巴结等放射性浓度最高，肌肉和脑浓度最低。其中，尿、胆囊、肺脏、脾、肝、肠淋巴结、肠内容物和肾上腺总放射性浓度均高于血清。与总放射性相对应，网状内皮系统如肺脏、脾、肝、肠淋巴结等酸沉淀放射性浓度最高，而尿中的酸沉淀放射性则很低，如8h时尿酸沉淀放射性只占总放射性的2.88±0.79％。
小鼠皮下注射125I-εＰＡ４４脂质体后，血清中放射性较低，小鼠皮下注射0.4、0.8和1.6μg/鼠125I-εＰＡ４４脂质体后AUC(0-Z)分别为393.8、813.8和1066.5ng.Equ•h•mL-1，剂量之比为1:2:4，AUC(0-Z)之比为1:2.1:2.7，CL(S)分别为0.051、0.049和0.075L•h-1•Kg-1，Vss为0.664、0.701和1.220 L•Kg-1；MRT分别为12.7、14.3和16.3h；而末端相t1/2分别为78.0、80.1和104.8h。TCA酸沉淀部分放射性浓度的AUC(0-Z)分别为332.0、676.7和924.4ng.Equ•h•mL-1，剂量之比为1:2:4，AUC(0-Z)之比为1:2.0:2.8，CL(S)分别为0.060、0.059和0.087 L•h-1•Kg-1；Vss为0.780、0.825和1.420 L•Kg-1，MRT分别为13.0、14.0和16.4h；而末端相t1/2分别为92.4、77.4和107.1h。
小鼠皮下注射125I-εＰＡ４４脂质体后，放射性主要经尿排泄，少量经粪排泄，16h以前排泄较快，16h时尿中已排出注入放射量的约61.33±6.72％，但以后排泄较慢，120h时尿粪分别排出注入放射性量的83.73±8.26％和9.88±4.65％，尿粪合计排出注入放射性量的93.6±9.8％。
大鼠皮下注射125I-εＰＡ４４脂质体后，经胆汁排泄很少，18h时胆汁的排泄量仅占注入总放射性的1.90±0.50％。
用放射性125I-标记治疗用（合成肽）乙型肝炎疫苗（简称125I-εＰＡ４４）结合RP-HPLC法、TCA酸沉淀法和γ-计数法，研究猕猴皮下注射125I-εＰＡ４４脂质体后血药浓度时间曲线、药代动力学、生物利用度和代谢转化及排泄；并与静脉注射比较。
静脉注射后15min，血清RP-HPLC放射色谱图发现与标准125I-εＰＡ４４或125I-εＰＡ４４脂质体行为相同的125I-εＰＡ４４放射性峰（占注入HPLC放射性45.8％），还检测到亲水性代谢产物峰（占16.7％）及水溶性125I-标记降解产物（占36.0％）。

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30min后的血清未检测到125I-εＰＡ４４峰，主要为水溶性125I-标记降解产物。皮下注射疫苗的猕猴血清未检测到原形125I-εＰＡ４４，但静脉注射或注射猴0～2（或3）h采集尿RP-HPLC分析也检测到亲水性125I-代谢物和少量的原形125I-εＰＡ４４。
猕猴静脉注射或皮下注射125I-εＰＡ４４脂质体10μg•Kg-1（118395Bq•Kg-1）后，4h前静脉注射组血清总放射性明显高于相同剂量皮下注射组（P<0.001），6h后则低于皮下注射组，48h时两者差别有统计意义（P<0.05）。酸沉淀放射性浓度的变化趋势与总放射性相似。静脉注射后5min时浓度已下降一半，30min以后缓慢下降，而皮下注射后存在明显吸收相，于注射后6h达到高峰。
皮下注射或静脉注射后总放射性浓度-时间曲线的AUC(0-∞)分别为444.0±54.1和380.7±54.2 ng.Equ•h•mL-1，全身生物利用度为115.9±6.2%。皮下注射后MRT比静脉注射明显后延（P<0.05），Tmax为6.7±1.2h；CLs分别为0.023±0.003和0.027±0.004 L•h-1•Kg-1；末端相t1/2分别为91.4±12.0和90.9±21.2h；Vss为0.407±0.051和0.38±0.02L•h-1•Kg-1。TCA酸沉淀放射性参数和总放射性相似。
猕猴皮下或静脉注射125I-εＰＡ４４脂质体10μg•Kg-1（118395Bq•Kg-1）后，放射性的主要排泄途径是尿，皮下注射比静脉注射的排泄速度相对较慢（P<0.05‐0.001），24h时尿中累计排出量分别占注入放射性的28.4±2.0％和60.5±5.0％，72h时分别为56.2±1.9％和82.2±1.3％，而144h时分别为71.9±2.8％和89.0±2.2％，粪累计排出量分别只占注入放射性的9.8±2.8％和2.83±0.62％。值得注意的是，皮下注射组粪内排泄的放射性统计上明显高于静脉注射组，表明两者的体内过程不同。

毒理学研究
动物急性(单剂量)毒性研究
选用昆明种小鼠作为实验动物，采用静脉注射给药途径，观察了小鼠单次静脉注射的εＰＡ４４成品最大耐受剂量（MTD），采用最大溶解度（1mg/ml）和最大容量法（0.25ml/10g体重）给药，设εＰＡ４４25mg/kg一个剂量组。相当于人拟用剂量的5000倍。给药后观察动物2周，动物的一般行为活动和食量正常，注射部位无刺激性现象。心率、呼吸、姿势、皮肤、毛发、体表粘膜、眼、鼻、口腔等未见异常。会阴

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部及大、小便性状等正常。未见动物有明显中毒反应情况，试验期间未发生动物死亡。每只动物给药后第1天至第14天体重增长无显著性差别。第14天处死动物剖检，心、肝、脾、肺、肾、脑等重要脏器大体解剖无异常发现。εＰＡ４４的静脉注射最大耐受剂量为25mg/kg。相当人拟用剂量的5000倍时对小鼠无明显的毒性作用。
选用昆明种小鼠作为实验动物，采用皮下注射给药途径，观察了小鼠单次皮下注射的εＰＡ４４最大耐受剂量（MTD），目的是评价小鼠皮下注射εＰＡ４４单次给药产生的急性中毒反应。本次试验设εＰＡ44 25mg/kg一个剂量组。相当人拟用剂量的5000倍。给药后观察动物2周，动物的一般行为活动和食量正常，注射部位无刺激性现象。心率、呼吸、姿势、皮肤、毛发、体表粘膜、眼、鼻、口腔等未见异常。会阴部及大、小便性状等正常。未见动物有明显中毒反应情况，试验期间未发生动物死亡。每只动物给药后第1天至第14天体重增长无显著性差别。第14天处死动物剖检，心、肝、脾、肺、肾、脑等重要脏器大体解剖无异常发现。综上所述，在本试验条件下，εＰＡ４４的最大耐受剂量为25mg/kg。相当于人拟用剂量的5000倍时对小鼠无明显的毒性作用。
选用恒河猴作为实验动物，采用近似致死剂量法（Approximate Lethal Dose, ALD），设εＰＡ44 10240、5120、1280、320、80和20μg/kg 6个剂量序列。每个剂量相当于人拟用剂量的2048、1024、256、64、16和4倍。皮下给药后2周观察动物的一般行为活动和食量正常，注射部位无刺激性现象。心率、呼吸、姿势、皮肤、毛发、体表粘膜、眼、鼻、口腔等未见异常。会阴部及大、小便性状等正常。未见动物有明显中毒反应情况，试验期间未发生动物死亡。每只动物给药后第8天和第15天体重增长无显著性差别。第15天麻醉后处死动物剖检，心、肝、脾、肺、肾、脑等重要脏器大体解剖无异常发现。在本试验条件下，εＰＡ４４的近似致死剂量大于10240μg/kg，相当于人拟用剂量的2048倍时对恒河猴无明显的毒性作用。

动物长期(重复给药)毒性研究
以大鼠为实验动物，设εＰＡ４４1mg/kg、0.2mg/kg 和0.04mg/kg3个剂量组，相当于人拟用剂量的200、40和8倍。每组36只大鼠，皮下注射，连续给药28天。

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观察动物6周，动物的一般行为活动和食量正常，注射部位皮下出现硬结。心率、呼吸、姿势、皮肤、毛发、体表粘膜、眼、鼻、口腔等未见异常。会阴部及大、小便性状等正常。未见动物有明显中毒反应情况，试验期间未发生动物死亡。各组动物给药后第1周至第6周体重增长无显著性差别。各组动物给药后第2、4、6周，给药组均出现εＰＡ４４抗体。第28天和第42天麻醉后处死动物剖检，心、肝、脾、肺、肾、脑等重要脏器大体解剖无异常发现，高剂量组多数动物、中剂量组部分动物及小剂量组少数动物注射部位皮下出现结节。给药组动物心、脾、肺、肾、肾上腺、脑、睾丸、附睾、前列腺、卵巢、子宫、甲状腺、胸腺、肠系膜淋巴结、膀胱、胸骨、脊髓、视神经、脑垂体、主动脉、气管、腹壁、大网膜、股四头肌、食道、胃、十二指肠、空肠、回肠和结肠等脏器组织学检查均未见到毒性病理改变，高剂量组多数动物、中剂量组部分动物及小剂量组少数动物注射部位皮下纤维结缔组织性增厚、出现慢性肉芽肿，第42天后高剂量组个别动物注射部位皮下仍见到慢性肉芽肿，中剂量组动物皮下未见到慢性肉芽肿。各项出血、凝血指标、4项离子指标、尿十项指标与溶剂对照组相比较无统计学差异。个别血液学指标和血液生化指标与溶剂对照组相比虽有统计学差异，但不具有毒理学意义。
以恒河猴为实验动物。设ε-PA44 2.00、0.40和0.08 mg.kg-1（相当于27.00、5.40和1.08 mg/m2）3个剂量组，分别相当于人拟用剂量的400、80和16倍。每组6只恒河猴，连续给药42天。观察动物9周，动物的心率、呼吸、姿势、皮肤、毛发、体表粘膜、眼、鼻、口腔等未见异常,注射部位未见刺激性现象，动物无过敏性等药物毒性反应情况。给药后第5周，部分动物患感冒，发生腹泻、脱水、拒食，未采取治疗措施导致对照组1只，高剂量组2只，中剂量组2只动物死亡。对死亡动物进行病理组织学检查，均见肠绒毛坏死、脱落等急性坏死性小肠炎表现，综合分析后确定上述动物的死亡系意外疾病所致，与给药无关。第42天和第56天麻醉后处死动物剖检，各组动物心、肝、脾、肺、肾、脑等重要脏器大体解剖未见与给药有关的异常表现，恢复期结束时各组病理组织学检查未见异常。各给药组五项出血、凝血指标，尿十项指标与溶剂对照组相比较无统计学差异。十二项血液学指标、十八项血液生化学指标均在正常范围，个别离子指标、血液学指标和血液生化指标与溶剂对照组相比虽

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有统计学差异，但无明显毒理学意义。结果表明，在本试验条件下，ε-PA44脂质体冻干剂在2.00mg.kg-1剂量，相当于小鼠药效学剂量和人拟用剂量的400倍时对恒河猴无明显的毒性作用。

遗传毒性研究
为检测εＰＡ４４成品的致突变作用，进行了该药的CHL染色体畸变试验。结果显示，无论是24ｈ及48ｈ收获细胞进行染色体畸变分析，溶媒对照、S9混合液对照组的染色体畸变率在正常范围，在S9活化和非活化两种测试条件下，εＰＡ４４在25～400ｇ/ｍl浓度范围内染色体畸变率也在正常范围，因此，在本试验系统条件下，εＰＡ４４在25～400ｇ/ｍl浓度范围内未见诱发CHL细胞染色体畸变率增高。
采用了沙门氏菌诱变性试验平皿掺入法检测了εＰＡ４４成品对菌株TA97、TA98、TA100、TA102的致突变作用。结果表明εＰＡ４４在0.1～1000μg/皿浓度范围内，S9活化和非活化两种测试条件下，诱发TA97、TA98、TA100和TA102产生的回变菌落数与阴性对照相比无明显增加。表明在0.1～1000μg/皿测试浓度范围内，εＰＡ４４成品对四种测试菌株均无致基因突变作用。在1000μg/皿浓度下，εＰＡ４４对TA97、TA98、TA100和TA102有轻微的抑菌作用。
选用昆明种小鼠皮下注射εＰＡ４４ 20.0 mg/kg（相当于临床拟用剂量的4000倍），分别于12、24、36、48和72 h采样，未发现εＰＡ４４对骨髓多染红细胞的微核率有明显影响，也未发现抑制红系细胞造血的影响。εＰＡ４４20.0 、2.0、0.2、0.02mg/kg四个剂量组给药后24小时，对骨髓多染红细胞微核率均无明显影响。各组微核率分别为3.0±1.2、3.0±0.8、2.2±1.0和3.3±1.1 ‰，与溶对照组2.3±1.1 ‰相比较，P>0.05，无显著性差异。四个给药组对骨髓红系细胞造血作用也无明显抑制。在本实验室条件下，εＰＡ４４对昆明种小鼠无致骨髓细胞微核形成作用，也未见对骨髓红细胞造血的抑制作用。

生殖毒性研究
观察了εＰＡ４４能否在大鼠胚胎发育时期引起永久性的肉眼可见的形态改变及