山西医科大学第二医院 邓志华、王桂琴、曹燕、徐永群、王琦
全世界乙型肝炎病毒（HBV）感染者超过3.5亿，因此乙型肝炎病毒感染是一个全球性问题。根据乙型肝炎病毒基因组序列趋异>8%、S基因差异>4%为一个基因型的原则，目前已确立乙型肝炎病毒有A～H八种基因型。基因型不同，乙型肝炎病毒生物学特性不相同，表现为：
1、不同乙型肝炎病毒基因型感染有明显地域及种族分布差异。基因型A和D感染多见于非洲、欧洲和印度，基因型B和C在亚洲普遍流行，基因型E只在非洲西部发现，基因型F在南美洲和美洲中部出现；
2、不同基因型感染，临床表现不同。A、B基因型感染者临床表现较其他基因型轻，且抗病毒治疗缓解率高；
3、不同地域病毒突变的位点和频率不相同，如D基因型病毒前C区1896位终止密码子的突变非常普遍，这一突变使得复制后病毒的核包装信号ε变得稳定，而A基因型则很少有这种突变，使得包装信号常不稳定。
乙型肝炎病毒感染的临床预后不同可能与基因型有关。对乙型肝炎病毒分型的重要性在于：
1、根据感染的乙型肝炎病毒基因型对患者发生肝细胞癌（HCC）的危险性进行预测；
2、根据乙型肝炎病毒基因型预测患者的耐药风险；
3、为与乙型肝炎病毒相关的无症状病毒携带者提供临床用药的分子生物学依据。
本研究采用RDB DNA反向斑点杂交技术，快速、准确地从患者血液中检测出2种国内广泛分布的乙型肝炎病毒基因型，为临床治疗和评估预后提供实验依据。
结果
一、慢性乙型肝炎患者乙型肝炎病毒基因型
RDB基因分型结果显示，本组慢性乙型肝炎患者所感染的乙型肝炎病毒基因型以B和C为主，且存在B、C混合感染。B基因型感染占56%，C基因型为26%，B、C基因型混合感染率为17%。只检测到A、D基因型各1例，均为新疆人且长期居住新疆。
乙型肝炎病毒基因型不同，基线水平的HBV-DNA含量、肝损害程度、临床转归均有显著差异。乙型肝炎病毒基因型C及B、C混合感染者临床表现比单一B基因感染者严重。
二、乙型肝炎肝硬化患者乙型肝炎病毒基因分型
肝硬化患者50例，基因分型结果显示，C基因型及B、C混合感染所占比例显著高于B基因型（P<0.05），病毒载量也较B基因型高。
在研究的2年内有2例发展为肝细胞癌，且均为乙型肝炎病毒B基因型，1例年龄为23岁，另1例年龄为29岁，家族中母系为乙型肝炎病毒高载量，为垂直传播的患者。
三、肝细胞癌患者乙型肝炎病毒基因分型
对有乙型肝炎病毒复制的64例肝细胞癌患者基因分型结果显示，肝细胞癌患者中以C及B、C混合感染为主，且病毒载量均高于10E7，C及B、C混合感染、病毒高载量可能在肝细胞癌发生中呈累加作用。另外，B基因型的肝细胞癌发生年龄低于其他2组患者。HBV-DNA水平、ALT各组间差异无统计学意义（P>0.05）。
讨论
同一病原体不同基因型感染常用的分析方法为测序，其缺陷在于不能对不同基因型同时进行测序。RDB法将不同序列先固定于纤维膜上，然后设计不同引物对靶序列进行扩增，通过杂交确定所扩增的基因序列，实验过程简单、重复性强，一次对多个基因型进行检测，可检出同一患者体内不同基因型的混合感染。
本研究对山西地区314例存在乙型肝炎病毒复制的慢性乙型肝炎、乙型肝炎肝硬化及肝细胞癌的小样本研究结果表明，山西地区感染的乙型肝炎病毒均为B和C基因型，并存在B和C基因型的混合感染，说明不同乙型肝炎病毒基因型混合感染及基因重组在临床上并不少见。在200例慢性乙型肝炎患者中只检出A、D基因型各1例，这2例患者均为长期居住在新疆的少数民族患者，为罕见基因型感染，除此之外未检出乙型肝炎病毒其他基因型，与亚洲流行基因型相符。
本组慢性乙型肝炎乙型肝炎病毒C基因型感染患者HBV-DNA载量显著高于B基因型，而ALT水平则低于B基因型，说明C基因型病毒致病性强，容易导致感染者免疫耐受；B、C混合感染患者HBV-DNA载量、肝损伤程度较单一基因型感染严重，其导致的肝脏病变似乎呈“基因毒性累加现象”。混合感染的患者HBeAg阳性率（67.64%）显著低于单一基因型感染者，说明混合感染可致乙型肝炎病毒前C区频繁突变，使HBeAg消失而导致乙型肝炎病毒免疫逃逸、病毒大量复制，这可能是临床上HBeAg阴性慢性乙型肝炎肝功能受损严重、预后不良的原因。
本研究发现，肝硬化患者中C和B、C混合感染的概率显著高于B基因型。C基因型感染可能与严重肝病相关，也可能是肝病医生对临床症状较轻的B基因型患者进行了抗病毒治疗，使得最近几年B基因型慢性乙型肝炎患者进展为肝硬化的概率有所降低。混合感染者HBsAg阳性率降低，说明混合感染不仅存在前C区突变，而且存在S区的突变，更容易导致病毒生物学特性的改变及免疫逃逸。
乙型肝炎病毒基因组前C区编码前C融合蛋白，这一蛋白经过翻译后修饰成为HBeAg，参与免疫调控而改变宿主对核心蛋白的反应。乙型肝炎病毒1896位终止密码子G→A突变可导致HBeAg缺失造成乙型肝炎病毒免疫逃逸；包装信号也是由乙型肝炎病毒基因组编码HBeAg的同一区域转录的，1896位是否能发生点突变由包装信号的2级结构所限制，若1896点突变为A，则造成1858-1896 G-C碱基配对破坏，病毒复制的机制就被破坏。因此，1896位点突变依赖于1858位是否存在C或T，而1858位的核苷酸序列是由基因型决定的，也就是说基因突变依赖于乙型肝炎病毒基因型，这可以解释C及B、C混合感染容易发生突变而单一B基因型感染不容易突变的原因，因此，C及B、C混合感染HBeAg阳性率低于B基因型。
前S区也可发生如点突变、缺失突变或插入突变等影响前S2蛋白的表达。病毒前S区缺失突变可造成宿主对病毒清除能力下降，但不影响病毒对肝细胞的结合和穿透而造成病毒慢性感染状态。前S缺失突变多发生在B、C基因型混合感染的患者。另外前S突变可以造成HBsAg假阴性，这就是B、C基因型混合感染的患者虽然表面抗体阳性、表面抗原阴性、但病毒高载量的原因，因为此时的抗体对B、C基因型病毒无免疫清除作用。
值得注意的是，在肝硬化患者中，乙型肝炎病毒B基因型感染的患者在研究的2年中有2例发生了肝细胞癌，其血清中存在乙型肝炎病毒大量复制（>10E8拷贝/ml），对这2例患者进一步询问病史发现均有乙肝家族史，为垂直传播，年龄<35岁，存在免疫耐受，乙型肝炎病毒B基因型可能与年轻患者的肝细胞癌发生有关，而且有可能是基因重组造成的。最近有研究显示，对我国台湾地区460例儿童乙型肝炎病毒携带者随访15年，发现26例乙型肝炎病毒相关肝细胞癌，而这些患者的乙型肝炎病毒基因型为B型者占74%。检测乙型肝炎病毒基因型对筛查肝细胞癌高危人群有重要意义。最近对我国台湾地区4841例乙型肝炎病毒携带的男性患者14年前瞻性研究结果表明，基因型C与年长患者肝细胞癌发生有关，而且与病毒高载量相关。B、C混合感染患者肝硬化发生的年龄显著低于单一基因型感染者。
乙型肝炎病毒基因型所致临床表现差异的分子病毒学机制目前还不明确。有人在肝细胞癌患者中发现乙型肝炎病毒基因组的BCP突变频率显著升高；基因型为B和C的BCP突变与肝病进展及肝细胞癌的发生呈正相关，但BCP及前C区突变也是干扰素抗病毒治疗的指征。有人认为BCP突变加上HBV-DNA低载量、ALT升高是诱导HBeAg血清学转换的最佳条件，而前C区突变是干扰素治疗有应答的必要条件。另有研究显示，B基因型感染抗病毒治疗的反应优于C基因型，HBeAg阳性慢性乙型肝炎中20%～40%对干扰素治疗反应良好，其中基因型为B的患者40%～50%对干扰素治疗有良好反应。
由于医院就诊的患者多为严重肝病，影响了对抗病毒治疗客观疗效的观察，另外多数临床观察设计的初衷并不在于乙型肝炎病毒基因型对抗病毒治疗的影响，严重肝病患者乙型肝炎病毒基因型间的差异可能被医生忽略，因此研究结果有许多不确定因素需排除，基因型分层研究可能有助这些矛盾结果的澄清。我们认为慢性乙型肝炎病毒感染的患者需获得病原学、临床和病毒学的全面研究才能制定个体化治疗方案。
[ 本帖最后由 张医生 于 2008-4-21 14:45 编辑 ] | 
发表于 2008-4-21 14:37
