NUC治疗下较短的cccDNA半衰期或给“乙肝治愈”点燃希望

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前  言





近日，以南方医科大学南方医院感染内科孙剑、侯金林和Richard Clonno为通讯作者，美国Assembly bioscience公司黄琦和该院感染内科周彬为共同第一作者，在 《Hepatology》在线发表了一篇有关核苷（酸）类药物治疗下cccDNA半衰期的研究论文。该研究有助于我们在真实的临床条件下重新认识cccDNA的稳定性，并重新思考慢性乙肝“病毒学治愈”的可能性。









阐明核苷（酸）类药物治疗下患者肝组织cccDNA的半衰期，有助于我们重新认识临床上正在使用的核苷（酸）类药物的价值，对乙肝抗病毒新药研发策略也十分关键。该研究团队通过测序证明血清HBV RNA准种与肝组织cccDNA准种高度相关，创新性地以抗病毒治疗过程中血清HBV RNA拉米夫定耐药突变LAMᴿ （rtM204V）准种的动态变化反映cccDNA池的更新速度，计算出总的cccDNA半衰期在6个月左右，而不是过去认为的10~16年。这意味着通过多靶点、联合治疗的手段，更加快速、彻底地抑制乙肝病毒复制，从而阻断新的cccDNA合成，就有望通过有限疗程达到耗竭cccDNA的目的，最终实现乙肝治愈。







cccDNA在HBV感染的建立和维持过程中起着关键作用。了解cccDNA池的半衰期有助于设计新的策略完全阻断cccDNA的从头合成来清除HBV。这项研究中回顾性地监测了肝脏活检中cccDNA和纵向血清样本中rtM204I/V突变体的出现和消失。纳入EFFORT队列替比夫定单药治疗患者5例和ML18376队列的患者9例（阿德福韦单药治疗组的4例（均在基线时进行了肝活检），Peg-IFN治疗组5例），所有患者在基线时HBeAg阳性。患者选择流程如图1所示。






图1. 病人选择流程图。



01. 从肝脏活检组织中选择性分离肝内HBV cccDNA、HBV DNA和HBV RNA方法的验证。

通过改良的Hirt法从细胞核中提取HBV cccDNA和细胞质提取rcDNA，然后再使用T5外切酶消化去除cccDNA中可能的rcDNA的污染。研究团队进一步优化了该方法，可从冰冻的肝组织提取HBV cccDNA、HBV DNA和HBV RNA。图S2A和S2B分别表示肝组织和血清实验流程。然后进行RT-PCR扩增和测序。


图S2. CHB患者血清和肝脏活检样本中HBV cccDNA、HBV DNA和HBV RNA的提取和LAMᴿ 变异检测。（A）分析CHB患者活检肝组织HBV cccDNA、HBV DNA和HBV RNA的实验流程图。（B）分析CHB患者血清HBV DNA和HBV RNA的实验流程图。



评估去除cccDNA提取液中rcDNA污染方法的有效性（图S3）。结果表明，优化后的T5酶能有效去除Hirt提取液（cccDNA）中过量（40倍）的LAMᴿ （rtM204V）rcDNA污染。对于CHB血清样本，首先提取病毒DNA/RNA总核酸，HBV DNA直接扩增， DNase I去除HBV DNA后进行HBV RNA扩增，然后进行测序。通过以上方法密切监测CHB肝脏活检和血清配对样本中HBV cccDNA、HBV DNA和HBV RNA LAMᴿ 变异的出现，用于研究HBV基因多态性和cccDNA池更新动力学。


图S3. T5核酸外切酶能有效消化过量rcDNA。



02. 血清与肝组织HBV DNA/RNA及cccDNA序列的相关性。

当肝组织活检的时间与血样采集时间间隔较长（27天和56天），血清RNA与肝脏活检cccDNA的LAMᴿ 百分比存在显著差异。因此，该研究团队选择了肝组织活检与血样采集间隔不到两周的患者进行相关性分析（EFFORT队列5例， ML18376队列2例）。

测序结果显示，EFFORT队列5例患者（7、17、20、26和31）的104周血清和ML18376队列2例患者（3和29）的基线血清中HBV DNA的LAMᴿ （rtM204I/V）突变均是100%（图2）。值得注意的是，如图2A所示，血清HBV RNA、肝组织HBV RNA和HBV cccDNA中发现LAMᴿ 突变（rtM204I/V）百分比均为40%~90%。图2B显示血清HBV RNA和肝组织HBV RNA的LAMᴿ组成密切相关（R² = 0.95, P  < 0.01）。并且血清HBV RNA、肝组织HBV RNA与cccDNA的基因序列组成高度相关，R²系数分别为0.90和0.96（图2C和2D）。与此相反，肝组织HBV DNA与cccDNA的LAMᴿ 组成无相关性（图2E）。总体来说，血清和肝脏活检的配对数据表明血清HBV RNA与肝组织HBV RNA和cccDNA的 LAMᴿ 占比有很强的相关性，从而证明了血清HBV RNA测序可以反映cccDNA的基因序列组成。



图2. HBV cccDNA、HBV DNA和HBV RNA的rtM204I/V突变的百分比。EFFORT队列5例患者104周和ML18376队列2例患者基线的血清和肝脏活检样本中LAMᴿ 突变（rtM204I/V）的百分比（2A）；肝组织HBV RNA、HBV DNA、cccDNA和血清HBV RNA 中LAMᴿ 突变（rtM204I/V）百分比的相关性（2B-2E）。



研究团队通过监测CHB治疗患者LAMᴿ 突变的出现和消失，建立了一种创新的灵敏的方法来研究HBV cccDNA池的更新。通过评估肝组织活检和血清配对样本，首次证明了血清HBV RNA和肝组织cccDNA基因序列的高度相关性。



03. EFFORT队列发生病毒学突破患者中血清HBV RNA的 LAMᴿ突变的动态变化。

血清HBV RNA和肝组织cccDNA基因序列组成相关性强，因此可以通过监测血清样本HBV RNA的序列来分析cccDNA更新动力学。分析来自EFFORT队列的5例HBeAg阳性、替比夫定耐药的CHB患者（7、17、20、26、31）的样本，以血清HBV RNA序列作为肝组织cccDNA序列替代指标，研究病毒学突破过程中cccDNA的更新动力学。测序结果显示，所有5例患者的血清HBV DNA中的LAMᴿ （rtM204I/V）突变均出现在64周和88周之间。血清HBV RNA中LAMᴿ 突变的检出与血清HBV DNA的相比有所推迟，但最终在104周时血清HBV RNA的LAMᴿ 突变累积超过40%-90% （图3）。如表1所示，血清HBV RNA的LAMᴿ 突变出现需要16-28周，治疗结束时成为优势准种。从这些结果中推断出的cccDNA的半衰期在6.9到21.7周之间。这些结果表明， LAMᴿ 突变的 cccDNA在替比夫定治疗期间可以快速补充野生型（WT）的cccDNA池。在一些患者治疗期间， ALT水平适度波动（图3），不影响HBV RNA准种的更替。


图3. EFFORT队列中发生病毒突破患者血清HBV RNA和HBV DNA中WT转为LAMᴿ （rtM204I/V）突变的动态变化（患者7、17、20、26和31）



表1. 血清pgRNA序列动态变化推测cccDNA的更新




04. 更改治疗方案（LAM转到Peg-IFN）的患者LAMᴿ突变恢复到WT。

5例对Peg-IFN无应答的患者（13、46、50、53、194）血清中HBV DNA和HBV RNA经RT-PCR扩增并测序。5例患者的血清HBV DNA和HBV RNA的测序均显示基线时存在100% LAMᴿ 突变（图4）。此外， 72周时，血清HBV DNA和HBV RNA均出现LAMᴿ 突变（rtM204）向WT的逆转。值得注意的是，尽管样本的时间点有限（只有4个时间点，间隔24周），但HBV RNA从LAMᴿ 到WT的完全转换在24至48周内完成（图4）。测序方法的检测下限为2.5%序列占比，认为所有患者的HBV突变在该时间段内100% 转化为WT，保守估计cccDNA的更新速率介于5.6到11.1周之间（表1），两个队列中血清HBV RNA /cccDNA更新动力学结果一致。ML18376患者在治疗期间ALT的轻微波动也不会影响HBV RNA的准种变化，这与EFFORT队列患者的情况类似。


图4. ML18376队列血清HBV RNA和HBV DNA中LAMᴿ （rtM204I/V）突变到WT的动态变化（患者13、45、50、53和194）。



基于血清HBV RNA纵向观察LAMᴿ 突变动力学，该研究团队估计cccDNA更替发生在几个月内，这明显比之前的估计（几十年）更短。

我们之前对cccDNA半衰期的了解主要来源于细胞和动物模型。体外对cccDNA稳定性的研究表明，HBV cccDNA在细胞中的半衰期小于10天，而在感染动物中对非人类嗜肝DNA病毒的体内研究估计cccDNA的半衰期为几周。长期核苷（酸）类似物（NUC）治疗的CHB患者很少发生cccDNA耗竭，导致人们认为cccDNA可能需要数十年才能完全清除。这也表明长期的NUC治疗期间，即使qPCR检测不到血清HBV DNA，但在肝细胞内HBV DNA复制和cccDNA池补充仍然持续存在。因此，NUC治疗患者cccDNA难以耗竭，导致了肝组织cccDNA的半衰期被高估。

南方医科大学南方医院侯金林、孙剑教授课题组利用cccDNA准种的更替来代替cccDNA水平的定量预测cccDNA池的半衰期。在该研究中，利用LAMᴿ 突变作为遗传生物标志物，在替比夫定治疗期间出现病毒学突破CHB患者的配对血清和肝脏活检样本中，对病毒核酸（HBV DNA、HBV RNA和cccDNA）进行测序鉴定。选择rtM204I/V作为准种标记是基于几个原因：首先，rtM204I/V是LAMᴿ 的高频突变位点，特别是在接受拉米夫定或替比夫定抗病毒治疗的患者中。其次，随着抗病毒治疗的继续或停止，血清中rtM204I/V突变的出现或逆转都能迅速发生（几个月内）。这为在相对较短的时间窗口内观察LAMᴿ 的动态变化提供了机会。最后，携带rtM204I/V发生病毒学突破的患者病毒载量相对较高，有利于血清样本中LAMᴿ 的PCR扩增和测序。

通过分析肝组织活检和血清配对样本，该研究团队发现血清HBV RNA中LAMᴿ 突变的百分比组成与肝组织HBV RNA和cccDNA的百分比组成有很好的相关性，但与肝组织HBV rcDNA没有相关性，说明血清HBV RNA序列在临床应用中是肝组织cccDNA基因序列的可靠替代指标。值得注意的是，肝组织活检和采血时间间隔超过2周，血清HBV RNA与cccDNA的序列相关性下降，进一步支持了在抗病毒治疗期间，cccDNA和HBV DNA/RNA的快速动态更新。

以血清HBV RNA的LAMᴿ 突变作为cccDNA的基因标记，该研究团队从两个不同的临床队列中研究LAMᴿ  CHB患者的cccDNA更新动力学。在EFFORT和ML18376队列中，血清HBV RNA中LAMᴿ 突变的出现和消失表明患者的cccDNA半衰期分别为6.9~21.7周和5.6 ~ 11.1周。值得注意的是，一些病人能够在16-48周内达到95%-100%的cccDNA池的更替。该研究表明，肝细胞内cccDNA池更新速度较以前的观点更快。根据研究的结果，该研究提出了一个cccDNA更新模型（图5），该模型显示WT cccDNA准种被LAMᴿ 突变准种全部更替发生在几个月内。


图5. cccDNA更新模型。血清HBV RNA rtM204I/V突变作为cccDNA更新的遗传标志物，其基因组成在几个月内发生了变化，其变化速度远远快于之前认为的观点。



从理论上讲，LAMᴿ 突变源于以pgRNA经逆转录合成rcDNA的HBV DNA复制过程。在NUC的选择性压力下， LAMᴿ 突变随着时间的推移，通过将突变的rcDNA感染新的细胞或进入原细胞核形成LAMᴿ 突变的cccDNA不断积累。随后，LAMᴿ 突变的cccDNA转录后在血清HBV RNA序列中得到反映。综上所述，该研究的数据表明，血清HBV RNA序列可作为评估肝组织cccDNA准种多态性的可靠的替代标志物。cccDNA池更新周期（几个月）可能会比之前预测（几十年）的更短。所以想要彻底清除感染肝细胞中的cccDNA，如果不能直接靶向cccDNA，则需要克服两个关键的障碍。首先，需要完全阻断病毒复制和cccDNA的补充，其次，必须在一个合理的时间内耗尽先前cccDNA池的库存。随着有效抗病毒药物的出现，病毒复制和cccDNA补充可能被完全抑制。在未来有效抑制病毒复制的条件下，如NUC与siRNA或衣壳抑制剂的结合，cccDNA的彻底清除将成为可能。





片警微述评






感染肝细胞内cccDNA的持续存在是乙肝难以治愈和停药后复发的根本原因。目前临床上仍然缺乏直接靶向cccDNA的药物。近期，通过与清华大学长庚医院魏来教授团队、中国医科大学附属瑞金医院和美国 Baruch S. Blumberg Institute的郭巨涛教授团队合作，我们的一项共同的研究显示，目前应用最广的核苷（酸）类药物主要是通过与体内的dNTP竞争抑制病毒P蛋白的逆转录活性，使掺入了NUC的子代病毒DNA链不可逆终止，从而导致子代病毒颗粒失去感染性（温故知新09）。与此同时，由于这些在核衣壳内新合成的“rcDNA”新链被不可逆终止，这也阻断了新合成rcDNA的内补充机制，即转换为cccDNA的途径。我们与德国Dandri教授实验室的一项研究从另一方面与近期的另外一项合作研究揭示了增殖状态的肝细胞一方面因细胞增殖过程cccDNA不断被稀释和丢失，另一方面因HBV受体蛋白NTCP的表达和膜定位在细胞增殖状态受到显著抑制而形成对HBV感染的的抵抗（温故知新12）。

但是，核苷（酸）类药物治疗最终是否能够耗竭cccDNA，与其在药物治疗下的半衰期有着重要的关系。很久以前，人们一度认为cccDNA的半衰期长达14年之久。但近期有多个研究显示， cccDNA的半衰期仅为数月之久。考虑到这些研究多是基于体外细胞和动物实验结果推算出来的，cccDNA的半衰期、特别是NUC治疗下真实的衰减时长一直是人们关注的问题。而此时，此文报导的cccDNA在NUC治疗下数月之久的“rapid turnover”，重新点燃了我们“以耗竭cccDNA的方式来实现乙肝治愈”的希望。

除此之外，测序结果揭示了血清RNA的序列与患者肝组织cccDNA序列具有一致性。最近，来自法国Zoulim实验室的慢乙肝患者血清HBV RNA的5'端RACE全长测序结果也印证了血清HBV RNA为pgRNA转录本及其剪接变异体。近期的这些研究再次说明，血清中的pgRNA的确是肝组织cccDNA的一个很好的Surrogate marker！

未济

newchinabok 发表于 2020-6-24 17:13
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还有哪些学术性比较强的有关乙肝治疗的公众号推荐下，谢谢

newchinabok

未济 发表于 2020-6-24 18:46
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