《Nature》文！最热的基因编辑技术有难了：或可引发强烈

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寻找新的方法来实现基因编辑，一朝失败，又得用多年来研究了

SK蜗牛

我今天刚看了一篇文章，是说已解决基因药物脱靶的问题

齐欢畅

SK蜗牛 发表于 2018-9-20 20:29
我今天刚看了一篇文章，是说已解决基因药物脱靶的问题

文章呢？可以转载过来吗？

齐欢畅

暗添弓箭力——应对CRISPR脱靶危机的正确姿势
【字体： 大 中 小 】 时间：2018年06月19日 来源：上海纳昂达

编辑推荐：

　　虽然这场让研究人员们“草木皆兵”的风波暂时平息，但也从侧面反映出CRISPR-Cas9的主要限制。本文将重点介绍检测CRISPR脱靶效应的方法和应对策略，希望助广大CRISPR领域研究者一臂之力。
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2017年5月发表在Nature Methods杂志上，题为“Unexpected mutations after CRISPR-Cas9 editing in vivo”的研究轰动了整个学术圈。该文章声称CRISPR/Cas9基因编辑系统会引入大量不可预估的突变到小鼠基因组中，由此引发了关于CRISPR/Cas9系统潜在脱靶效应的一系列激烈的讨论。后续调查结果发现，所谓大规模的脱靶现象是作者使用了基因背景不明确的小鼠对照而产生的错误判断，该文章也在2018年3月被正式撤稿1。


图1. Nature Methods杂志最终单方面决定，在通讯作者全都不同意的情况下强行撤稿这篇有争议的论文，打破了学术界的惯例2。

虽然这场让研究人员们“草木皆兵”的风波暂时平息，但也从侧面反映出CRISPR-Cas9的主要限制：不仅在其目标序列切割，还对相似序列进行切割。而脱靶切割可能发生在整个基因组中，导致产生潜在的突变及危害。这对CRISPR的各种应用，尤其是临床上遗传疾病或癌症治疗提出了尖锐的挑战。本文将重点介绍检测CRISPR脱靶效应的方法和应对策略，希望助广大CRISPR领域研究者一臂之力。

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1、 算法预测验证

CRISPR脱靶效应的关键因素之一是向导RNA（gRNA），即结合引导Cas9核酸酶在基因组上特定位置切割的RNA序列。在设计gRNA时，我们可通过特定算法预测潜在脱靶位点，尽可能的选择脱靶效应低的gRNA。在基因组切割之后再进行靶向测序，验证这些位点突变情况，以评估脱靶效应。

现在已有基于各种算法的预测工具，总结详见表1：

表1. gRNA设计和脱靶效应分析工具



但是这些预测工具并未进行过生物信息学的系统性比较，每种算法都有自己的特点，且结果并不总是一致。对于基础研究用途，如制作基因突变的细胞系，算法预测验证可快速、简单、低成本的对数个位点进行脱靶分析。即使有误判或者漏掉脱靶位点，只要能排除对实验结果的影响，均属于可接受范围。

而在治疗药物开发、临床前研究等临床用途中，任何的潜在脱靶效应都可能对患者产生潜在的有害影响，必须进行全基因组范围的CRISPR脱靶效应检测。

2、 体外基因组测序

Cas9核酸酶和gRNA在体外可结合形成具有切割功能的核糖核蛋白复合物（RNP ，Ribonucleoprotein complex），RNP与提取的基因组DNA（gDNA，gnomic DNA）孵育即可进行切割，造成双链断裂。利用这一特性，可通过全基因组DNA测序来检测脱靶效应。目前常见的方法有以下3种：

表2. 体外基因组测序分析脱靶效应



这3种方法均可在全基因组范围内检测低至0.1%的脱靶位点，适合大规模筛选或用于临床分析。但考虑到gDNA与RNP直接反应，与细胞内真实发生的切割情况可能会有所区别。目前还需要更多与体内数据的对比，进一步研究完善。

3、 基于细胞的基因组测序

对被CRISPR基因编辑过的细胞进行基因组测序，使得实验不局限于RNP系统，也可检测特定条件下的特定细胞。但是这种检测方式的灵敏度与实验方式、细胞类型等有关。常见的方法详见表3：

表3. 细胞基因组测序分析脱靶效应



利用二代测序（NGS）从基因组水平上全局衡量脱靶效应是一个重要的议题。但是有两个直观的困难：一是测序成本，当样本数量和测序深度增加时，不同检测方法成本差异巨大，可能从几百元到几万元不等；二是生物信息学分析，目前暂时没有专业软件对测序结果进行脱靶效应分析。虽然有一些实验室已经编写了部分脚本代码分享，但并不具备通用性。

IDT内部则采用基于细胞的基因组测序分析潜在脱靶位点，再使用自有专利的rhPCR扩增子测序技术对脱靶位点进行进一步比较和研究。

解决方案

Cas9酶本尊，是CRISPR脱靶效应的关键因素。IDT提供的两种Cas9 核酸酶：野生型S.p. Cas9 和高保真型S.p.HiFi Cas9，两者均有高效的编辑效率。前者为通用型，是大众首选；后者因其高保真性适用于对于脱靶效应十分敏感的场景。具体介绍介绍详见：工欲善其事必先利其器—CRISPR的“扳手”与“螺纹钉”。

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IDT对不同形式的野生型Cas9脱靶效应分析显示，RNP模式（体外组装tracrRNA-crRNA+Cas9）转染，虽然会引起剂量相关的脱靶，但仍远低于crRNA:tracrRNA转染进稳定表达Cas9的细胞系引起的脱靶效应（图2.）9。其主要原因在于RNP在一定时间后被细胞降解，并不会长时间持续切割DNA，因而脱靶效应也较低。


图2. RNP形式的野生型Cas9可降低脱靶效应。RNP形式的脱靶效应远低于稳转Cas9的细胞系。IDT针对EMX1靶向位点设计Alt-R crRNA，与通用的Alt-R tracrRNA构成gRNA，分别进行如下实验：1）电转至稳定表达Cas9的HEK-293细胞系；2）与野生型Cas9形成RNP，随后使用Nucleofector系统 (Lonza)电转进HEK-293细胞系。之后对靶向位点和脱靶位点进行测序分析。

而Alt-R S.p. HiFi Cas9的RNP形式或以其构建的稳转细胞系（图3，第二列和第四列），脱靶比例都显著低于野生型（图3，第一列和第三列）。HiFi Cas9 RNP形式的脱靶效率则是最低的：在四个测试基因中都有高达99%的中靶率（图3，第四列）10。


图3. AR、EMX1、HBB和HPRT基因的靶向编辑NGS分析结果。不同的gRNA逆转染至稳定表达野生型和高保真型Cas9的细胞系中（第一列与第二列）和体外组装的RNP模式（第三列与第四列）。使用GUIDE-Seq检测所有的脱靶位点；之后利用rhPrimer扩增子测序方式分析每个位点的indel频率（具体分析方法可点击此处获取）。

具体案例

镰刀型贫血症是由编码β-血红蛋白的基因HBB点突变而引起的遗传病。以往骨髓移植的疗法成功率低且难以解决排斥反应。CRISPR-Cas9介导的精确同源重组（HDR）可修复病人自身造血干细胞的突变，但是基因编辑效率低，同时也存在脱靶的问题11。2018年4月接收的一项最新研究里，来自美国斯坦福大学的研究团队则在Alt-R S.p. HiFi Cas9的基础上优化，并建立了RNP结合同源重组修复HBB点突变的实验条件和方法。该方法拥有高效编辑效率的同时解决了脱靶的问题，为治愈镰刀型贫血症以及其他多种血液遗传病提供了坚实的基础12。部分结果如图4所示，ALT-R HiFi Cas9在CD34+的造血干祖细胞（HSPC）中实现对HBB基因稳定精确的靶向编辑，效率与野生型相对，同时脱靶效应又显著降低13。


图4. ALT-R HiFi Cas9 RNP在CD34+的HSPC中实现对HBB基因稳定精确的靶向编辑，同时脱靶效应显著降低。（A）野生型和高保真型Cas9 分别以1:2.5的摩尔比与HBB特异的gRNA结合形成RNP，电转至CD34+HSPC。72～96小时后提取基因组DNA，PCR扩增靶向区域和已知的脱靶区域。使用TIDE软件计算INDEL的频率。（B）Sanger测序表明，ALT-R S.p. HiFi Cas9酶（底部迹线）与WT Cas9（顶部迹线）相比，脱靶效应显著减少。（C）将CD34+HSPC按上述方法电转后进行同源重组，通过流式细胞仪（FACS）分析插入GFP表达。可见HiFi Cas9酶与WT Cas9酶相比，同源重组率接近。（D）流式细胞仪分离GFP阳性的细胞考察同源定向修复（HDR）的频率。（E）对HBB（R02）编辑效果进行NGS分析，GS1-4为GUIDE-Seq的排名前四的脱靶位点，COS1-3、MIT分别指的是COSMID和 MIT CRISPR 预测的脱靶位点。可见HiFi Cas9酶几乎无显著的脱靶位点13。

除了使用快速方便外，IDT的Alt-R S.p. HiFi Cas9酶的超低脱靶率已经过二代测序验证和多项研究证实，也是在临床相关应用中解决CRISPR的脱靶问题的关键。如果你希望尝试，请与我们联系。联系方式 [email protected] 或 400 8717 699 。

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1. https://www.nature.com/articles/nmeth0518-394a
2. https://www.weibo.com/ttarticle/p/show?id=2309404238192034373160
3. Kim, D. et al. Digenome-seq: genome-wide profiling of CRISPR-Cas9 off-target effects in human cells. Nat Methods 12, 237-43, 1 p following 243 (2015)
4. https://doi.org/10.1038/protex.2017.147
5. https://www.nature.com/protocolexchange/protocols/5889
6. Tsai, S.Q. et al. GUIDE-seq enables genome-wide profiling of off-target cleavage by CRISPR-Cas nucleases. Nat Biotechnol 33, 187-197 (2015).
7. Frock, R.L. et al. Genome-wide detection of DNA double-stranded breaks induced by engineered nucleases. Nat Biotechnol 33, 179-86 (2015).
8. Yan, W.X. et al. BLISS is a versatile and quantitative method for genome-wide profiling of DNA double-strand breaks. Nat Commun 8, 15058 (2017).
9. Kleinstiver, B.P. et al. High-fidelity CRISPR-Cas9 nucleases with no detectable genome-wide off-target effects. Nature 529, 490-5 (2016).
10. Slaymaker, I.M. et al. Rationally engineered Cas9 nucleases with improved specificity. Science 351, 84-8 (2016).
11. Dever, D.P. et al. CRISPR/Cas9 β-globin gene targeting in human haematopoietic stem cells. Nature 539, 384-389 (2016).
12. Charlesworth, C.T. et al. Priming Human Repopulating Hematopoietic Stem and Progenitor Cells for Cas9/sgRNA Gene Targeting. Molecular Therapy - Nucleic Acids 12, 89-104 (2018).
13. Christopher Vakulskas et al. , A novel Cas9 mutant confers reduced off-target gene editing while maintaining on-target potency

齐欢畅

张燕：新CRISPR-Cas9工具可精确编辑RNA和DNA
【字体： 大 中 小 】 时间：2018年03月01日 来源：生物通

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　　CRISPR-Cas9技术在短短五年内风靡全球实验室，成为了生物科学领域最炙手可热的研究工具，它可以对基因进行定点的精确编辑，但是大多数CRISPR工具只能编辑基因组DNA，并不能在RNA上编辑。
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生物通报道：CRISPR-Cas9技术在短短五年内风靡全球实验室，成为了生物科学领域最炙手可热的研究工具，它可以对基因进行定点的精确编辑，但是大多数CRISPR工具只能编辑基因组DNA，并不能在RNA上编辑。

来自密西根大学的一组研究人员发现了一种单一蛋白，能同时对DNA和RNA进行CRISPR精确可编程切割，这一新技术未来有望用于治疗与RNA相关的疾病-例如局灶性癫痫、杜氏肌营养不良症以及帕金森病等。

相关研究成果公布在Molecular Cell杂志上。



文章的通讯作者是密西根大学生物化学系助理教授张燕（Yan Zhang），她表示：“我们发现的脑膜炎细菌Cas9有多重功用，让我们有机会进行双重靶向——可以一次性在RNA和DNA上同时做基因编辑，又或者可以选择只进行单一的RNA编辑，而不会影响相应的基因组位点。这赋予科学家更多的灵活性。”  

NmeCas9

在细胞中，染色体中含有的DNA可作为制造细胞所需物质的永久性百科全书。但要真正完成生物进程，细胞需要从染色体转录RNA。

RNA最重要的功能之一，就是在细胞里“复印”DNA片段，细胞内的机制就可以解读指令，然后制造蛋白。很多疾病的产生是源自RNA。

这种最新发现的Cas9来自脑膜炎细菌，这种细菌每年会引发一些最严重和致命的脑膜炎病例。

研究人员利用他们新发现的NmeCas9构建了新型CRISPR系统，而且NmeCas9比CRISPR中使用的其他Cas9蛋白质小得多，更有利于临床上使用。

张燕与文章一作：Beth A. Rousseau和Zhonggang Hou博士在密歇根大学医学院的实验室中检测了NmeCas9蛋白。结果证明“CRISPR-Cas9完成的所有操作都可以在RNA水平上操控染色体。”

意外发现

其实NmeCas9的发现是偶然发生的，当时RNA是作为对照样本的，但研究人员发现它也在减少。通过深入挖掘，研究人员发现了NmeCas9的双重切割功能，并开始对其进行生物化学测试。

除了他们的发现之外，张燕也知道另外两个小组正在准备报告或刚刚报道了来自其他细菌的Cas9蛋白，它们可以在没有任何刺激辅因子的情况下进行RNA靶向，而不像以前的RNA编辑CRISPR-Cas9技术。

“如果NmeCas9能够在活细胞中发挥作用，我们可以将其开发为编辑信使RNA转录本的工具，这意味着我们可以在不操纵基因的情况下阻断基因产物，”张燕说，“我们也可以利用它作为一种研究工具，将荧光标记物标记到特定的RNA序列，或阻止事件如RNA剪接的发生。”

这一研究团队希望将来可以将其应用到人类细胞，如果成功的话，将能干预因RNA变异或者RNA剪接，运输等过程异常而导致的疾病。

（生物通）

作者简介：

Yan Zhang

Appointments
Assistant Professor

Areas of Interest
CRISPR-Cas is a RNA-guided, genetic interference pathway in prokaryotes that enables acquired immunity against invasive nucleic acids. Nowadays, CRISPRs also provide formidable tools for facile, programmable genome engineering in eukaryotes. Cas9 proteins are the “effector” endonucleases for CRISPR interference; and have recently begun to be also recognized as important players in other aspects of bacterial physiology (e.g. acquisition of new spacers into CRISPRs, endogenous gene regulation, and microbial pathogenesis, etc.).My laboratory is broadly interested in CRISPR biology and mechanism. We will use Neisseria species as our model system, and E. coli and human cells as additional platforms. We employ complementary biochemical, microbiological, genetic and genomic approaches. We are also interested in working with the broader scientific community to develop and apply novel CRISPR-based tools to tackle diverse biological questions.

原文标题：
Programmable RNA Cleavage and Recognition by a Natural CRISPR-Cas9 System from Neisseria meningitidis

齐欢畅

Editas再次突破基因编辑的“脱靶效应”，向临床应用迈进一大步！
2016-1-10 作者：MedSci   来源：MedSci原创 我要评论0
Tags: 基因编辑  临床  
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J. Keith Joung（图片来源：Editas Medicine官网）
在CRISPR系列的基因编辑系统中，Cas9酶是一个非常关键的组成部分，但是CRISPR/Cas9的脱靶效应是一直急需攻克的难题，它严重制约了基因编辑系统的实际临床应用的可能。因为脱靶效应，使得基因编辑的特异性可能不高，会产生异想不到的“副作用”，脱靶效应严重制约了CRISPR/Cas9基因编辑技术的广泛应用。攻克脱靶效应，是科研人员一直追求的梦想。在上个月Editas另一位创始人张锋也采用了一种新技术解决脱靶问题，见报道：Science：基因编辑脱靶效应被张锋攻克，有望应用于临床精准基因修复
有关脱靶效应，在2013年张锋团队就意识到这一重大的问题，并提出初步解决方案：Nat Biotech：新方法可消除CRISPR-Cas的脱靶效应，实现完美基因编辑，在2015年成功地实现把脱靶效应控制在不可检测的范围。相信，接下来还会进一步提高，希望形成更精准的基因编辑系统。
1月6日，发表在Nature杂志的一项研究中，麻省总医院（MGH）的研究人员J Keith Joung开发出一个新版本的Cas9酶或将强有力的解决这一困扰CRISPR/Cas9系统的障碍，使脱靶效应降低到无法检测的水平。该成果阐述了经改版的Cas9酶是如何降低与靶DNA（target DNA）的非特异性作用，这将大大扩大基因编辑技术的应用可能性。J Keith Joung也是Editas创始人之一。
新版本的Cas9酶是如何形成的？
MGH团队的研究一直基于这样一个事实，即Cas9酶自身的某些部分可以与靶DNA分子的骨架（backbone）相互作用。J Keith Joung博士称，研究小组一直在针对CRISPR/Cas9系统的脱靶效应进行研究。他们猜测，降低Cas9酶与靶DNA的之间的互相作用或许可以更加完全的消除脱靶效应，且保留所需的靶向互作（on-target interaction）。
基于参与该研究的Vikram Pattanayak博士的前期研究成果，研究小组将能够绑定DNA骨架的长氨基酸侧链替换成了较短的、使绑定不能进行的短链，改变了Cas9酶介导的4个连接（Cas9-mediated contact）。
随后，研究人员检测了15种Cas9酶可能的变异体（通过任意改变1条链、2条链、3条链、4条链），最终发现了一个替换3条链和一个替换了4条链的变异体 显示出巨大的潜能，在人类细胞中既能够区别出错误的靶点，还可以保留完整的正确靶向活性。研究小组进一步对替换了4条链的变异体进行了充分表征，他们将其称之为SpCas9-HF1（SP代表酿脓链球菌，是广泛使用的野生型cas9的来源，HF代表高保真度）。
改版后的CRISPR/Cas9系统效果如何？
与野生型SpCas9相比，这一突变体在他们检测的37种不同的导向RNAs中，与其中超过85%的导向RNAs形成了靶向效应（on- target effect）。通过Joung实验室2014年开发的检测CRISPR/Cas9脱靶效应的高敏感系统GUIDE-Seq，研究小组发现，野生型 SpCas9与7种导向RNAs结合引发了25个脱靶突变，而使用SpCas9-HF1与其中6种导向RNAs结合并未产生可检测到的脱靶效应，与第7种 导向RNAs结合形成了1个脱靶位点。
研究小组还发现，当靶向非典型DNA位点（有1个或2个核苷酸重复序列， 通常会产生许多脱靶突变）时，SpCas9-HF1也能够降低脱靶效应。科学家们还开发出了SpCas9-HF1的系列衍生物，包括HF2、HF3 和 HF4。这些衍生物能够消除HF1变异体和少数导向RNAs结合时剩余未解决的脱靶效应。
Joung系Editas Medicine的创始人之一
据 xconomy网站报道，Joung其实是已经在纳斯达克挂牌上市申请的基因编辑公司Editas Medicine的创始人之一。他说：“这项研究成果中的变异体可以很容易地替代野生型SpCas9，为脱靶突变降低至无法检测到的水平提供了一种高效的 方法，可被目前使用CRISPR/Cas9技术的所有人广泛地使用。”同时，他也强调，证明这一研究能都使CRISPR/Cas9变得足够精准、足够安全还需要更多的工作。他说：“我非常看 好CRISPR-Cas9疗法的前景。然而，如果基于CRISPR的治疗需要将数以百万的CRISPR/Cas9拷贝放入人体细胞中，那么目前的精准度还 不够好。对我来说，现在的挑战是如何开发更加敏感的方法。”
另一创始人张锋的同类研究成果
脱靶效应是基因编辑领域主要的一个障碍，尤其是对于那些希望将该技术应用到人类疾病治疗中的科学家和管理者。Editas Medicine另一创始人张锋曾于去年11月30日的《科学》上发表了同类研究成果，有效改善了该系统的脱靶效应（Science：基因编辑脱靶效应被张锋攻克，有望应用于临床精准基因修复）。
张锋的团队通过改变构成化脓性链球菌Cas9酶的约1，400个氨基酸中的3个氨基酸将“脱靶编辑”显著减少至无法检测到的水平。研究人员利用了Cas9蛋 白的结构知识来降低脱靶切割（off-target cutting），即带负电荷的DNA是结合到带正电荷的Cas9蛋白的凹槽。基于这样的原理，他们预测，相较于“靶向”序列，用一些中性氨基酸来替代正 电荷的氨基酸，可以减少Cas9与“脱靶”序列的结合。
从论文发表来看，张锋与Joung虽然同在一个公司，但是分属不同团队，完全独立进行攻克基因脱靶等难关，而且几乎是同时取得突破性进展。
Editas Medicine是基因编辑领域在临床实验上进展较快的公司。去年11月，Editas的CEO Katrine Bosley 表示，公司计划在明年开启CRISPR治疗一种先天性黑朦症失明的临床试验，这个疾病是一种单基因疾病，非常合适基因编辑进行。如果计划顺利，那么这项研究将是CRISPR编辑人类DNA的首例。详细见：两年内基因编辑将应用于眼科先天性黑朦治疗
原始出处：
Benjamin P. Kleinstiver,Vikram Pattanayak,Michelle S. Prew,Shengdar Q. Tsai,        Nhu T. Nguyen,Zongli Zheng        & J. Keith Joung.High-fidelity CRISPR–Cas9 nucleases with no detectable genome-wide off-target effects.Nature (2016) doi:10.1038/nature16526
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齐欢畅

Nature亮点丨活体基因编辑的脱靶突变或可有效避免
2018-09-13 06:53 胆固醇
责编丨迦溆

当前，基因编辑技术走向临床应用面临最大的问题可能就是其脱靶风险了。关于CRISPR–Cas9基因编辑技术的脱靶问题，近期有多篇论文的报道引发了强烈关注。

去年，5月30日，Nature Methods发表的一篇文章声称“CRISPR-Cas9技术可引发基因组上发生数百个意想不到的的基因突变”（【聚焦】CRISPR可致数百个位点突变，引入基因治疗需谨慎），引起轩然大波，不过该论文在今年3月份被撤稿（争议热门论文遭撤稿丨特别关注）；然后今年5月份，Genentech公司的研究团队在Nature Methods杂志上发表文章，详细分析了编辑的小鼠和大鼠身上的脱靶位点（重审CRISPR的脱靶效应，Nature Methods发文全面分析基因编辑鼠的脱靶位点）；今年7月份，Bradley及其同事在Nature Biotechnology上发文探讨了CRISPR/Cas9在目的编辑位点附近所造成的大片段缺失及其它复杂的重组，该工作也显示了CRISPR–Cas9技术面临的另一个安全隐患（CRISPR编辑技术面临新的安全隐患——胡家志点评）。但是不管怎么样，进一步深入评估CRISPR–Cas9技术的脱靶风险当前仍然是十分必要的，因为当前并没有一个充分可靠的能够鉴定活体脱靶效率的方法。

9月13日，来自瑞典阿斯利康制药公司的Marcello Maresca与麻省总医院的J. Keith Joung等人合作在Nature上发表了题为In vivo CRISPR editing with no detectable genomewide off-target mutations的研究成果，针对CRISPR–Cas9基因组编辑的全基因组脱靶效应的高效检测系统在小鼠身上完成了测试，发现使用正确设计的gRNA并不会带来任何可检测到的脱靶突变。该研究成果有望促进基因组编辑从研究到临床的转化。



在这项研究中，研究人员描述了一种灵敏度较高的“体内脱靶验证”（verification of in vivo off-targets，VIVO）系统，可以高效检测CRISPR–Cas9在生物体中的脱靶突变。

VIVO系统主要分两步（下图），第一步是称为“发现”阶段，使用麻省总医院的J. Keith Joung等人在2017年报道的CIRCLE-seq（ circularization for in vitro reporting of cleavage effects by sequencing）方法检测体外切割效应【1】，第二步称作“确认”步骤，小鼠活体中注射gRNA后取出肝脏组织DNA对第一步体外检测到的可疑脱靶突变进行进一步测序确认是否存在突变。



整个VIVO系统中可会事先识别出潜在的脱靶位点，在基因组编辑后再确认这些位点中是否有位点发生了改变。作者在小鼠肝脏中检测了该系统的准确度。针对PCSK9基因（Proprotein convertase subtilisin/kexin type 9，前蛋白转化酶枯草溶菌素。该基因发现于2003年，其功能获得性突变可导致常染色体显性的家族性高胆固醇血症，使得LDL受体水平下降，进而导致LDL平升高【2】），研究人员设计了不同的向导RNA（gRNA），包括混杂性(可以靶向多位点)的gRNA和特异性更高的gRNA进行实验。最终研究发现，VIVO系统在使用混杂性gRNA是基因编辑体系中检测到了gRNA诱导的数十种脱靶突变（包括发生率仅为0.13%的突变，最高检测的突变率为41.9%），而正确设计的特异性更高的gRNA并不会带来任何可检测到的脱靶突变。

值得注意的是，没有检测到脱靶带来的突变并不意味着染色体没有出现重排，这个风险本文并没有触及，该Nature论文在文末的Note added in proof中提及了不久前那篇NBT论文，详见BioArt此前的报道：CRISPR编辑技术面临新的安全隐患——胡家志点评。

作者认为，VIVO 为定义基因组编辑在实际应用中的脱靶效应设立了重要标准，并证实了设计出特异性极高的gRNA的重要性。

总的来说，这篇论文在方法上的创新性或许不够，算得上是2017年那篇Naure Methods的升级版，从体外升级到活体小鼠。然而从其亮点来看，主要有以下几点：第一，首次证明活体（区别于体外细胞实验）CRISPR–Cas9基因编辑能够很强的诱导脱靶导致的突变；第二，证明了CIRCLE-seq测序方法预测的位点有很大的参考价值；第三点就是Cas9位点的优化确实能有效规避脱靶位点。

这篇文章的出现或许对促进基因组编辑从研究到临床的转化起到推动作用（是不是又会影响股票市值？），但是回到本文的原点，围绕CRISPR–Cas9基因编辑技术的脱靶问题仍然需要更多的研究和评估。

感谢北京大学胡家志研究员对本文的帮助！

参考文献：

1. Tsai, S. Q., Nguyen, N. T., Malagon-Lopez, J., Topkar, V. V., Aryee, M. J., & Joung, J. K. (2017). CIRCLE-seq: a highly sensitive in vitro screen for genome-wide CRISPR–Cas9 nuclease off-targets.Nature methods, 14(6), 607.

2. Abifadel, M., et al., Mutations in PCSK9 cause autosomal dominant hypercholesterolemia. Nat Genet, 2003. 34(2): p. 154-6.

齐欢畅

找到一些文章，关于基因编辑的脱靶效应。

newchinabok

齐欢畅 发表于 2018-9-20 23:02
找到一些文章，关于基因编辑的脱靶效应。

值得注意的是，没有检测到脱靶带来的突变并不意味着染色体没有出现重排，这个风险本文并没有触及，该Nature论文在文末的Note added in proof中提及了不久前那篇NBT论文，详见BioArt此前的报道：CRISPR编辑技术面临新的安全隐患——胡家志点评