2017年5月发表在Nature Methods杂志上,题为“Unexpected mutations after CRISPR-Cas9 editing in vivo”的研究轰动了整个学术圈。该文章声称CRISPR/Cas9基因编辑系统会引入大量不可预估的突变到小鼠基因组中,由此引发了关于CRISPR/Cas9系统潜在脱靶效应的一系列激烈的讨论。后续调查结果发现,所谓大规模的脱靶现象是作者使用了基因背景不明确的小鼠对照而产生的错误判断,该文章也在2018年3月被正式撤稿1。
Areas of Interest
CRISPR-Cas is a RNA-guided, genetic interference pathway in prokaryotes that enables acquired immunity against invasive nucleic acids. Nowadays, CRISPRs also provide formidable tools for facile, programmable genome engineering in eukaryotes. Cas9 proteins are the “effector” endonucleases for CRISPR interference; and have recently begun to be also recognized as important players in other aspects of bacterial physiology (e.g. acquisition of new spacers into CRISPRs, endogenous gene regulation, and microbial pathogenesis, etc.).My laboratory is broadly interested in CRISPR biology and mechanism. We will use Neisseria species as our model system, and E. coli and human cells as additional platforms. We employ complementary biochemical, microbiological, genetic and genomic approaches. We are also interested in working with the broader scientific community to develop and apply novel CRISPR-based tools to tackle diverse biological questions.
原文标题:
Programmable RNA Cleavage and Recognition by a Natural CRISPR-Cas9 System from Neisseria meningitidis作者: 齐欢畅 时间: 2018-9-20 22:58
9月13日,来自瑞典阿斯利康制药公司的Marcello Maresca与麻省总医院的J. Keith Joung等人合作在Nature上发表了题为In vivo CRISPR editing with no detectable genomewide off-target mutations的研究成果,针对CRISPR–Cas9基因组编辑的全基因组脱靶效应的高效检测系统在小鼠身上完成了测试,发现使用正确设计的gRNA并不会带来任何可检测到的脱靶突变。该研究成果有望促进基因组编辑从研究到临床的转化。
在这项研究中,研究人员描述了一种灵敏度较高的“体内脱靶验证”(verification of in vivo off-targets,VIVO)系统,可以高效检测CRISPR–Cas9在生物体中的脱靶突变。
VIVO系统主要分两步(下图),第一步是称为“发现”阶段,使用麻省总医院的J. Keith Joung等人在2017年报道的CIRCLE-seq( circularization for in vitro reporting of cleavage effects by sequencing)方法检测体外切割效应【1】,第二步称作“确认”步骤,小鼠活体中注射gRNA后取出肝脏组织DNA对第一步体外检测到的可疑脱靶突变进行进一步测序确认是否存在突变。
整个VIVO系统中可会事先识别出潜在的脱靶位点,在基因组编辑后再确认这些位点中是否有位点发生了改变。作者在小鼠肝脏中检测了该系统的准确度。针对PCSK9基因(Proprotein convertase subtilisin/kexin type 9,前蛋白转化酶枯草溶菌素。该基因发现于2003年,其功能获得性突变可导致常染色体显性的家族性高胆固醇血症,使得LDL受体水平下降,进而导致LDL平升高【2】),研究人员设计了不同的向导RNA(gRNA),包括混杂性(可以靶向多位点)的gRNA和特异性更高的gRNA进行实验。最终研究发现,VIVO系统在使用混杂性gRNA是基因编辑体系中检测到了gRNA诱导的数十种脱靶突变(包括发生率仅为0.13%的突变,最高检测的突变率为41.9%),而正确设计的特异性更高的gRNA并不会带来任何可检测到的脱靶突变。
值得注意的是,没有检测到脱靶带来的突变并不意味着染色体没有出现重排,这个风险本文并没有触及,该Nature论文在文末的Note added in proof中提及了不久前那篇NBT论文,详见BioArt此前的报道:CRISPR编辑技术面临新的安全隐患——胡家志点评。
1. Tsai, S. Q., Nguyen, N. T., Malagon-Lopez, J., Topkar, V. V., Aryee, M. J., & Joung, J. K. (2017). CIRCLE-seq: a highly sensitive in vitro screen for genome-wide CRISPR–Cas9 nuclease off-targets.Nature methods, 14(6), 607.
2. Abifadel, M., et al., Mutations in PCSK9 cause autosomal dominant hypercholesterolemia. Nat Genet, 2003. 34(2): p. 154-6.作者: 齐欢畅 时间: 2018-9-20 23:02