中国西南地区丙型肝炎病毒6a亚型病毒株的传播速率

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【摘要】  目的  探讨HCV 6a病毒株进入中国后在中国西南部地区的播散速率。 方法  收集西南医院感染病专科医院2004年1月-2009年9月存留的HCV 6型感染患者血清，采用逆转录巢式PCR方法获取患者血清HCV CE1区序列，绘制系统进化树进行HCV亚型鉴定；用BEAST v1.6.1软件绘制时间系统进化树。 结果  本研究获取的HCV 6a病毒株共祖起源于1968年左右，至少存在4个主要的流行株，在静脉吸毒和非静脉吸毒患者人群中均已分离到起源较早的流行株。理论倍增曲线显示，1997年以后HCV 6a病毒传播速率加快，2007年以后加速明显。 结论  HCV 6a病毒株在中国西南部地区播散迅速，在未来有可能成为本地区主要的HCV亚型，并有由静脉吸毒人群向非静脉吸毒人群传播的趋势。
【关键词】  肝炎病毒，丙型； 基因型； 序列分析


The velocity of HCV subtype 6a transmission in southwest China    HONG Guo-hu, TAN Zhao-xia, GUO Yan, MAO Qing. PLA Institute of Infectious Diseases, Southwest Hospital, the Third  Military Medical University, Chongqing 400038, China
Corresponding author: MAO Qing, Email: [email protected]


【Abstract】    Objective: To estimate the velocity of HCV subtype 6a transmission in Southwest China. Methods   The HCV CE1 region from 61 patients infected with HCV genotype 6 were amplificated by RT-PCR and sequenced. The subtypes were identified, and the period of HCV 6a strains originated in southwest china was estimated by using molecular clock phylogenetic analysis. The velocity of HCV subtype 6a transmission in southwest China was estimated by BEAST v1.6.1 and Tracer v1.5 software theoretically. Reslut    Most of HCV 6a strains distributed in Southwest China orgined around the year 1968 and at last 4 epidemic strains existed. The earlier orgined strains could be isolated both in intravenous drug users (IDU) and non-IDU patients. After 1997, the HCV 6a strains transmission in southwest China accelerated and the trend intensified in 2007. Conclusion    HCV 6a strains spread fastly both in IDU and non-IDU patients, which might be the main HCV subtype distributed in Southwest China in the future.
【Key words】Hepatitis C virus; Genotype; Sequence analysis


HCV基因型可以影响丙型肝炎患者的病程转归和干扰素的治疗效果[1-2]；HCV基因型分布与地域和传播途径密切相关[3]。探明HCV各病毒株的起源时间及播散速率有利于预测未来HCV基因型的分布模式，进而指导预防和临床治疗，其意义重大。Pybus等[3]证实HCV 6型病毒株大约在1000年以前起源于东南亚地区，而中国早期HCV 6型感染患者的报道多见于中国香港和中国台湾地区，大陆地区仅上海有数例报道[4]。中国西南地区毗邻东南亚各国，且静脉吸毒人员（intravenous drug user，IDU）比例较高[5]；可以估计HCV 6型病毒株的入侵将对西南地区HCV基因型分布模式产生较大影响，前期研究结果也证实，近年HCV 6a型感染患者明显增加[6]。但是侵入中国西南部地区的HCV 6a亚型病毒株起源时间和其传播速度仍然未能得以明确，也难以估计HCV 6a亚型病毒株的入侵对该地区未来的影响。本研究旨在探明HCV 6a亚型病毒株在西南地区的传播速度，为该地区HCV感染的防治提供理论依据。

资料与方法
1. 血清收集：查阅本院2004年1月-2009年9月HCV感染患者基因型分型结果，收集其中HCV 6型感染患者资料；查阅所有患者门诊及住院病历，同时在存留血清库标本中选取存留血清，为排除抗HCV治疗对HCV序列的影响，将未经抗HCV治疗或至少超过半年未经抗HCV治疗患者纳入研究。同时详细记录血清标本采样时间及患者主要高危因素。

2. PCR扩增及序列测定：用逆转录巢式PCR方法扩增HCV CE1区447bp长度的核苷酸序列[7]；切胶纯化后送华大基因公司直接测序。（1）HCV RNA抽提：采用QIAamp Viral RNA Mini试剂盒（购自德国Qiagen公司），按说明书操作。（2）引物序列：首轮引物CE1_ESP：5′-GCAACAGGGA ACCTTCCTGGTTGCTC-3′，CE1_EAP：5′-CGT AGGGGACCAGTTCATCATCAT-3′；第二轮引物CE1_ISP：5′- AACCTTCCTGGTTGCTCTTTCT CTAT-3′，CE1_IAP：5′-GTTCATCATCATATC CCATGCCAT-3′。由华大基因公司合成。（3）逆转录及PCR反应体系：逆转录及首轮PCR同时进行，配制50μl反应体系：10×PCR反应液5μl，50mmol/L MgCl2 1.5μl，10μmol/L CE1_ESP、CE1_ASP各2μl，10mmol/L dNTP 1μl,40IU/μl Rnasin 0.25μl，200IU/μl MMLV 0.4μl，5.0IU/μl Taq聚合酶0.3μl，RNA 10μl，DEPC水27.55μl。循环参数：42℃逆转录40min；94℃预变性2min；94℃ 15s，60℃ 15s，72℃ 30s，扩增30个循环；72℃延伸5min。第二轮PCR配制50μl反应体系：10×PCR反应液5μl，50mmol/L MgCl2 1.5μl，10μmol/L CE1_ISP、CE1_ISP各2μl，10mmol/L dNTP 1μl，5.0IU/μl Taq聚合酶0.3μl，首轮PCR产物2μl，DEPC水36.2μl。PCR循环参数与首轮相同。以上试剂均购自美国Invitrogen公司。（4）序列测定：采用MinElute试剂盒（购自德国Qiagen公司），切胶纯化PCR产物。以CE1-ISP作为测序引物，送华大基因公司直接测序。

3. HCV分型确定、系统进化树绘制：用ClustalX2和Mega4.0软件绘制系统进化树以对采集到的序列进行HCV亚型鉴别，参考序列取自美国国立生物技术信息中心（NCBI）：6a: AY859526、Y12083，6b: D84262，6d: D84263，6g: D63822，6h: D84265，6k：AY878650、D84264。经1000次重复bootstrap检验后，与HCV 6a亚型参考序列同簇且bootstrap评分＞99的HCV序列被确定为HCV 6a亚型；在进化树6a亚型分支中同簇排列且bootstrap评分＞60的HCV序列被判定为同簇。

4. 时间系统进化树绘制：采用BEAST v1.6.1软件绘制时间系统进化树[8]；采用松散的时间系统进化树模型分析序列[3, 9]。确定入侵中国西南地区6a亚型HCV进化树分歧时间，同时确定各簇病毒株进化树的分歧时间。采用Tracer v1.5软件判读结果，并绘制入侵中国西南地区HCV 6a亚型群体理论倍增曲线。

结    果
1. 患者血清HCV亚型鉴定：共收集HCV 6型感染患者78例，符合要求的血清标本61份。其中59位患者血清经RT-PCR扩增成功（96.72%），获得59条HCV CE1区序列。绘制进化树后5条序列无法准确区分亚型，1条序列被归类为6d亚型，53条序列最终被纳入本研究（血清采集时间：2004-2009年，重庆患者31例、四川患者10例、贵州患者12例；38个IDU患者和15个非IDU患者）。成簇聚集的HCV序列共38条，被分为4个簇，其余15条序列分散排布（图1）。各簇中序列多来源于IDU患者，但是在簇 1、3、4中也均可以发现非IDU患者。
2. 中国西南部6a亚型病毒株起源时间：Tracer v1.5判读BEAST v1.6.1计算结果，叠加运算后，有效抽样值（effective sample size）＞500判定为模型收敛，结果有效。中国西南部地区HCV 6a亚型病毒株共祖起源于1968年。主要流行的病毒株起源时间分别为：2002年（簇1）、2004（簇2）、1994年（簇3）、1991年（簇4），见表1。起源最晚的簇2病毒株中仅包含IDU患者分离出的HCV序列，尚未发现非IDU患者，而其他3簇均可见来源于非IDU患者的HCV序列；在起源较早的两簇（簇3、簇4）病毒株中非IDU患者所占比例较大，分别为60.0%（簇3）和22.7%（簇4）。

3. 中国西南部6a亚型病毒株播散速率估计：采用Tracer v1.5软件Demographic Reconstruction工具估算中国西南部地区6a亚型HCV病毒株理论倍增时间曲线（图2）。理论倍增时间曲线显示，1997年以前曲线较为平坦，1997年以后HCV 6a亚型病毒株理论群体倍增时间开始出现缩短的趋势，2007年以后理论倍增时间缩短趋势更加明显。由于感染患者数量与病毒群体倍增时间曲线有一定的相关性，病毒群体倍增时间缩短可能提示HCV 6a亚型感染患者总体人数有上升趋势。

讨    论
针对HCV各亚型病毒株起源的研究在最近几年成为学界的研究重点。Van de Laar等[8]以NS5B区一段436 bp的序列作为靶序列探讨了欧洲四国及澳大利亚HCV/人类免疫缺陷病毒混合感染的男同性恋患者人群中主要HCV亚型的起源时间。同年，Pybus等[3]对来源于东南亚各国的HCV 6a亚型序列进行时间系统进化树分析，结果显示HCV 6a亚型病毒株大约起源于公元1500年左右。

本研究获取的HCV 6a病毒株共祖起源于1968年左右，至少存在4个主要流行株，其中两个流行株起源于20世纪90年代初期，另外两个流行株起源于21世纪前5年。其间大约有10年时间没有新型病毒株入侵，可能是由于本研究采集样本限制未能捕获所有可能存在的HCV 6a亚型病毒株，在53例6a亚型患者中存在15例患者不属于这4个流行株，也提示尚有其他流行株存在。

Flamm[10]认为不同的HCV病毒株可能具有不同的主要传播途径，大量的分子流行病学研究结果证实，HCV 6a亚型病毒主要通过IDU传播。本研究中簇 1、3、4的三个簇中均发现非IDU患者，在起源较早的簇中非IDU患者比例较高，2002年起源的簇 1也已经播散到非IDU人群。提示在未来，IDU以外的其他传播途径可能成为HCV 6a亚型病毒传播的主要方式。

我们对Pubmed上1995年以后发表的中国境内HCV分子流行病学研究进行了系统性回顾（待发表），将西南部地区相关的4篇论著报道HCV各基因型分布模式与采样时间进行曲线拟合，发现在2000年之后，HCV 2型患者比例出现下降，同时6型患者比例急速上升，与本研究结果中拟合的HCV 6a亚型理论倍增曲线拐点接近。基本可以判断大约在1997-2000年 HCV 6a亚型病毒株在中国西南部地区出现了较大规模的播散。

尽管HCV 6a亚型患者干扰素联合利巴韦林治疗效果优于HCV 1型患者[11]；但仍应受到重视，近年来HCV 6a亚型病毒株在中国西南部地区广泛传播，同时有由IDU患者向非IDU患者播散的趋势，未来可能成为中国西南部地区乃至中国更大范围地域内的主要优势HCV亚型之一，针对HCV 6型病毒的研究应该得到更广泛的重视。
志谢  第三军医大学西南医院中心实验室李彦教授、第三军医大学生物信息中心邹凌云教授

参  考  文  献
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（收稿日期：2011-01-31）
（本文编辑：朱红梅）
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