硝唑尼特医学讨论贴

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硝唑尼特在山羊体内的药物代谢动力学及毒理学研究
Investigations on Pharmacokinetics and Toxicology of Nitazoxanide in Goats【作者】赵占中
【导师】薛飞群
【作者基本信息】中国农业科学院，基础兽医学，2009年，博士

【中文摘要】：硝唑尼特(nitazoxanide, NTZ)是一种硝基噻唑苯胺类化合物,具有广谱抗微生物活性,对寄生虫,细菌以及病毒有效。体内活性与其脱乙酰基衍生物替唑尼特(tizoxanide, T)有关,具体包括细胞内外的原虫,蠕虫,需氧与厌氧菌,以及病毒。因此,进行硝唑尼特的药理学与毒理学研究将对其进一步开发及应用会产生重要的作用。我们首先建立了一种用于山羊粪便中硝唑尼特代谢物鉴定的敏感、特异的液相色谱电喷雾串联质谱(liquid chromatography–electrospray ionization tandem mass spectrometry, LC–ESI–MS–MS)方法,并且采用了ESI阴离子模式。样品经前处理后注入XTerra MS C8柱,试验过程中使用的流动相为乙腈(acetonitrile)与10 mM乙酸铵(ammonium acetate),以0.2 ml/min的流速进行线性梯度洗脱(linear gradient elution),随后进行MS–MS检测。代谢物鉴定以及结构解析通过比较原药或其它可用标准的保留时间(retention times, Rt),全扫描,子离子扫描,母离子扫描与中性丢失扫描的MS–MS质谱图来完成。山羊按200 mg/kg的剂量经口给予硝唑尼特后,在其粪便中发现原药(nitazoxanide)及其脱乙酰基代谢物(替唑尼特,Tizoxanide)。给药96 h后,在山羊粪便中仍能检测到替唑尼特。在上述方法的基础上,建立了一种用于山羊血浆及尿液中硝唑尼特代谢物鉴定的快速,敏感与特异的液相色谱–串联质谱方法。纯化的样品使用XTerra MS C8柱进行分离,流动相为乙腈与10 mM乙酸铵(pH 2.5),采用梯度洗脱的方式,样品检测使用MS–MS。代谢物鉴定以及结构解析通过比较原药或其它可用标准的保留时间(retention times, Rt),全扫描,子离子扫描,母离子扫描与中性丢失扫描的MS–MS质谱图来完成。山羊按200 mg/kg的剂量经口给予硝唑尼特后,在其血浆及尿液中发现并鉴定了四种代谢[替唑尼特(tizoxanide),替唑尼特葡萄糖醛酸化物(tizoxanide glucuronide),替唑尼特硫酸酯化物(tizoxanide sulfate)以及羟基替唑尼特硫酸酯化物(hydroxylated tizoxanide sulfate)]。此外,我们首次提出了硝唑尼特在山羊体内可能的代谢途径。研究结果提示,建立的该方法简单,可靠及敏感,证明适合于硝唑尼特活性代谢物的检测及其结构鉴定,从而有助于更好地理解硝唑尼特的体内代谢。建立山羊血浆中测定硝唑尼活性代谢物替唑尼特的简单且特异的HPLC–UV方法。血浆样品用乙腈去蛋白提取,选用Diamonsil C18 (250 mm×4.6 mm, 5μm)为反相色谱柱,乙腈–0.02 mol/l KH2PO4(65:35, v/v)为流动相,流速1.0 ml/min,检测波长360 nm。替唑尼特线性范围为0.2–10μg/ml,检测限为0.02μg/ml (S/N>3),定量限为0.04μg/ml (S/N>6)。样品平均回收率在94.5%以上,日内、日间精密度的RSD均小于10%,准确率的相对误差在1.42到9.05%之间。其它物质干扰替唑尼特的检测。确证方法成功应用于山羊经口给予硝唑尼特后,其血浆中替唑尼特的药物动力学研究。研究了硝唑尼特活性代谢物替唑尼特在山羊体内的药物代谢物动力学及其在山羊血浆、白蛋白(albumin)与α-1-酸-糖蛋白(α-1-acid-glycoprotein)溶液中的结合能力。体外蛋白质结合能力研究结果表明,4μg/ml的替唑尼特在山羊血浆与白蛋白(albumin)溶液中的结合率可达95%以上,而在α-1-酸-糖蛋白溶液中的结合率仅为49%。这一结果表明,替唑尼特以其酸性特征,同α-1-酸-糖蛋白相比,可能与白蛋白具有较强的结合能力。最后,进行了硝唑尼特体内外毒理学以及潜在作用机制的研究。按照200 mg/kg的剂量给口给予山羊硝唑尼特。通过11项尿常规分析与心脏,肝脏,脾脏,肺脏,肾脏,膀胱及胆囊的组织学检查评价了硝唑尼特的系统毒性。结果证实,硝唑尼特无毒,尿常规分析的11项指标正常,而且无器官组织病变出现。MTT试验证实,低于10μg/ml的硝唑尼特对Chang氏肝细胞与Vero细胞的生长无影响,而对两种细胞的敏感性不同。然而,当浓度为10~100μg/ml时,对两种细胞的生长均有量效相关的抑制作用,且对Chang氏肝细胞与Vero细胞的IC50分别为37μg/ml与41μg/ml。同空白细胞对照相比,药物处理特别是较高剂量的硝唑尼特作用可以使293T细胞数量减少,皱缩明显,凋亡增多。用Western blot进一步分析,结果发现,硝唑尼特可以促进p53表达,且作用剂量为10μg/ml时不影响细胞周期。总之,硝唑尼特具有良好的耐受性,而且能促进p53表达,从而导致细胞凋亡。'
　p53是一种肿瘤抑制基因（gene）。在所有恶性肿瘤中，50%以上会出现该基因的突变。
　　由这种基因编码的蛋白质（protein）是一种转录（transcription）因子，其控制着细胞周期的启动。许多有关细胞健康的信号向p53蛋白发送。关于是否开始细胞分裂就由这个细胞决定。如果这个细胞受损，又不能得到修复，则p53蛋白将参与启动过程，使这个细胞在细胞凋亡（apoptosis）中死去。有p53缺陷的细胞没有这种控制，甚至在不利条件下继续分裂。像所有其它肿瘤抑制因子一样，p53基因在正常情况下对细胞分裂起着减慢或监视的作用。 细胞中抑制癌变的基因“p53”会判断DNA变异的程度，如果变异较小，这种基因就促使细胞自我修复，若DNA变异较大，“p53”就诱导细胞凋亡。

　　因此，Levine 等学者提出了P53 基因网络的概念：
　　他们认为不能孤立地观察各个基因的生物学功能，而应该将它们组合起来看待. 1 阻滞细胞周期 2 促进细胞调亡　　对p53促进细胞凋亡的功能研究进行得比较深入。通过bax/bcl2, Fas/Apol，IGF-BP3 等蛋白，p53可完成对细胞凋亡的调控作用。Bcl-2 可阻止凋亡形成因子如细胞色素C等从线粒体释放出来，具有抗凋亡作用，而Bax可与线粒体上的电压依赖性离子通道相互作用，介导细胞色素c 的释放，具有凋亡作用，p53可以上调Bax的表达水平，以及下调Bcl-2的表达共同完成促进细胞凋亡作用。P53还可通过死亡信号受体蛋白途径诱导凋亡，TNF 受体和Fas蛋白。有学者认P53 还可直接刺激线粒体释放高毒性的氧自由基来引发凋亡。 3 维持基因组稳定 4 抑制肿瘤血管生成　　肿瘤生长到一定程度后，可以通过自分泌途径形成促血管生成因子，刺激营养血管在瘤体实质内增生。P53蛋白能刺激抑制血管生成基因Smad4 等表达，抑制肿瘤血管形成。在肿瘤进展阶段，P53基因突变导致新生血管生成，有利于肿瘤的快速生长，常是肿瘤进入晚期的表现。         
激活P53的上游事件　　１离子辐射造成的DNA 损伤激活．

　　主要有：ATM,Chk2参与
　　２化学药物，紫外线，蛋白激酶抑制剂诱导
　　主要有：ATR ,Casein参与
　　３异常细胞生长
　　主要有：p14ARF参与
　　三条途径最终都会抑制蛋白的降解，使P53维持高水平，P53通过调节周围基因的表达，行使抑制细胞分裂和促进细胞调亡的功能． 关于荧光蛋白标记法对p53基因的研究　　Oscillationsin the nuclear levels of fluorescently tagged p53 and Mdm2 inindividual MCF7, U280, cells following gamma irradiation.
　　在过去的10年里面，有更多的基金开始研究p53基因治疗。
　　根据《基因药物杂志》（Journal of Gene Medicine）数据截至2005年1月世界上有1020中基因治疗药物批准进行临床实验。在这些药物中66％是治疗癌症的。
　　在这些癌症基因治疗临床实验中58种是利用重组腺病毒编码人类p53。
　　有数据显示超过20种癌症可以利用rAd-p53进行治疗，包括颈部鳞癌、肺癌、乳腺癌、肝癌等。


[ 本帖最后由 1212521 于 2010-6-22 17:43 编辑 ]



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虽然是羊的,药的作用机理应该是一样的吧

hackxx

一切用动物做实验  没有看到人体实验  都是空想
   大家 自己安慰自己一下