乙肝病毒基因检测必须重视的几个问题（转载）-->可可转移

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来源： http://www.sh120.com/medinfect/patient/information/detail.asp?ID=105 乙肝病毒基因检测必须重视的几个问题 长征医院感染科 缪晓辉 孔宪涛 乙型肝炎病毒基因检测技术（包括定性和定量）尚不完善，有些问题甚至比较严重，亟待解决。近年来，随着基因检测技术临床应用范围的不断扩大，尤其是在病毒性肝炎的诊断和疗效观察方面，基因检测所发挥的作用越来越大，因此，对基因诊断技术本身的要求也越来越高。本文根据我们的研究积累和临床实践，对乙型肝炎病毒基因检测技术方面存在的几个问题提出一些个人看法，希望引起重视。 一、要合理选择基因检测方法 最常用的基因检测方法是杂交法和PCR法，两种方法各 有优势，但各又有不尽如人意之处。比较肯定的是：杂交法的特异性优于PCR法，PCR法的敏感度胜过杂交法。 目前在检验方面，膜斑点杂交技术正逐步被微孔板杂交技术取代，也正是由于在微反应板上操作要比在硝酸纤维膜或尼龙膜上简便和精确得多，杂交法基因检测技术再次受到青睐。美国原Chiron公司发明的bDNA定量检测技术在很短时间内得到普遍认可就是很好的例证。bDNA技术不仅操作简便，而且由于采用了信号放大探针，提高了灵敏度；更由于检测系统中的夹心探针系化学合成的寡核苷酸，特异性进一步提高[1,2]。由于成本过高，目前国内主要将bDNA技术用于HBV、HCV基因的定量分析。更多的检验部门仍采用膜斑点杂交法定性检测HBV基因。 作为一种分子生物学研究手段，自90年代初以来，PCR技术对生命医学的贡献和还将发挥的作用是无法估量的，大家熟知的、目前进展十分迅速的人类基因组计划，如果不依靠PCR技术来完成基因筛选、克隆和测序的工作，要在限定的时间内完成这样一个庞大的计划是不可能的。PCR技术不仅是一种研究手段，更是一类多功能的检验技术。在用于临床实验室诊断方面，PCR有其独特的优势。相对而言，近几年来基因定量PCR发展速度更快，其中竞争PCR和荧光PCR似成为当前的焦点话题。国内已有数个试剂公司开发了定量PCR的产品（包括定量PCR仪）。 无论是基因定性还是定量检测，是选择杂交法还是PCR法，我们应当避免人为的好恶，从技术条件、临床需要、检测成本等多方面综合考虑。由于经验和知识的局限性，临床医生更多关心的是检测的结果，对检测过程或检测技术本身可能存在问题缺乏了解。就HBV基因检测而言，有一个重要问题需要在此特别提出：基因组和基因检测的差别及其对临床诊断可能带来的影响。基因组和基因的关系可以简单地理解成基因组是一个整体，它由多个功能不同的基因组成，决定生物体的遗传性状；而基因是个体，表达某一种产物发挥作用，或具有调节功能。PCR法只能检测某一个基因，或某一个基因的一部分（称之为基因片段）。比如，HBV基因组全长3.2kb左右，PCR法一般只是选择S或C基因300~ 500bp的片段进行扩增。以后还将谈到，由于扩增时必须使用引物，引物3’端一个碱基的突变将导致假阴性结果。而杂交法（bDNA或酶联夹心杂交）检测的则是HBV的基因组[3]。48组短的寡核苷酸（碱基数30个左右）在不同位点与HBV DNA杂交，其中10组是捕获探针，其余为信号检测探针。在有点突变的情况下，通过杂交法仍能保证有效地捕捉到目的基因，包括不同HBV基因亚型，在敏感度范围之内，完全可以避免发生假阳性和假阴性的结果。 二、要重视血清标本的正确处理 蛋白酶裂解后酚氯仿抽提，已经成为分离和提取血清标本中HBV DNA的“经典”方法。最近几年，为简化操作过程，有人采用柱抽提法，更有一些试剂公司提供某种“保密”试剂（大多是蛋白酶之类的裂解物），投入血清后再煮沸数分钟，即可获得用于PCR的模板。我们认为，无论是经典方法还是各种改良法，都必须关注以下三个要点：第一，目的基因的得率；第二，操作程序的简繁程度；第三，材料和时间的消耗。 我们比较了包括蛋白酶裂解-酚氯仿抽提、碱变性、柱抽提、加蛋白酶K裂解后煮沸和血清直接煮沸等7种血清标本处理方法，对PCR扩增效率的影响，结果发现，血清直接煮沸法的扩增效率最高；经典的蛋白酶裂解-酚氯仿抽提法，不仅操作过程烦琐，而且目的基因的得率较低；柱抽提法虽然简化了一些步骤，但耗材昂贵，而且得率明显低于直接煮沸法。我们也尝试了用血清标本直接作为模板进行PCR，结果扩增效率最差，可能是血清中未经灭活的某些成分抑制了Taq酶活性的缘故[4]。上述结果表明，血清直接煮沸法，不仅操作十分简便、省材省时，而且HBV DNA的得率最高（大于70%），是HBV基因检测过程中血清标本处理的最佳选择。 从上述结果引出这样两个问题：第一，有没有必要采用套式（亦称巢式）PCR，以提高血清HBV DNA的检测率。如果能首先解决好处理标本过程中目的基因的得率问题，那么我们就可以取得事半功倍的效果，在一定范围内还可以提高PCR法的特异性。第二，由于不同的抽提方法，HBV DNA的得率不同，因此，如果没有统一的血清标本处理方法，那么基因定量检测的准确性如何得到保证呢？这个问题在作PCR定量时显得尤为突出（杂交法定量若采用血清抽提物来检测，同样存在这个问题）。定量PCR法的原理是把“反应管”中的目的基因指数级地扩增到一定水平，再通过产物杂交，并与设定的内参照对比，推算“反应管”内的目的基因含量，并不等于原待测标本内的真正含量，因此血清标本处理过程种的目的基因的丢失及丢失量均无法计算。荧光PCR同样会因标本处理不当，使得定量结果不可靠。 综上所述，任何基因定量手段必须采取统一的标本处理方法，同时还必须对确认的最佳方法进行反复比较，以确定其目的基因的得率。我们推荐血清直接煮沸法，优越性已如前所述。 三、要解决由于基因突变所致PCR法假阴性的问题 1998年以前，在PCR技术普遍应用于HBV DNA定性检测的一段时间内，我们常发现，某些HBsAg（+）、HBeAg（+）、抗HBc（+）病人，血清HBV DNA检测阴性，似与病情不符。最近，我们将这部分标本采用酶联杂交法，以及多对引物PCR法复测，发现绝大多数标本HBV DNA阳性，少数与敏感度不够有关，过去的结果是假阴性。为进一步探讨假阴性的原因，我们改变了原来用于PCR扩增的引物序列，即同时或分别去除两根引物3￠ 端的最后一个碱基，再对上述HBV DNA阴性标本行PCR扩增，结果阳性。 众所周知，PCR引物设计必须遵循一定原则，选择待测目的基因的保守区序列来设计引物，是首先要遵循的原则之一。乙型肝炎病毒基因组的S区基因最保守，C基因次之。我们曾比较过S区和C区引物，对乙肝病人血清标本扩增结果，发现C区引物的阳性率为S区的70%左右。但即使是S区基因，也有一些突变频率较高的区域或位点。最早确认HBV基因扩增引物的作者，采用了经验性的方法，即选择多对S区基因引物，扩增大量乙肝病人的血清标本，筛选出阳性率最高的一对引物。因为是“最高”，不是全部，所以不可避免地存在漏检或假阴性。从整体上看，PCR的漏检率可能很低，但漏检如果发生在某一个具体病人则是100%。这里也同样产生了两个问题：第一，如果某一项检测技术不能百分之百地避免假阴性，那么我们还有没有可能采取更积极的措施，以最大限度地减少假阴性？第二，临床医生是否对HBV DNA检测技术的局限性有足够的认识？是不是仅凭一张检验报告的阳性或阴性结果，作出HBV感染是与否的判断？ 与经验医学不同，现代医学要求临床医生必须不断更新知识，必须随时掌握各种现代诊断技术的基本原理和应用范围；同时，保持与临床检验人员的经常性沟通也是提高和体现临床医生诊疗水平的一个重要方面。就HBV基因检测技术而言，我们认为，对有疑问的阴性结果，应当采用杂交或多对引物PCR等方法来补救。 四、如何处理PCR产物污染的问题 PCR技术因灵敏度很高和操作相对简便而在临床上被广泛应用。理论上，每一反应管内只要有一个基因存在就可能被扩增至可观察水平，而在实际用于HBV基因检测时，灵敏度也达到了100个基因/ml的水平。灵敏度过高可能会导致假阳性率增加，这是任何检测技术无法避免的事实。在导致PCR假阳性的因素中，产物污染是最严重、但又是可以避免的因素之一。在如何正确使用PCR技术，以提高临床诊断水平这个问题上，我国曾为之付出过沉重的代价。防止PCR产物污染，以避免假阳性和提高PCR诊断技术的稳定性已成为急待解决的问题。因噎废食，禁止使用PCR技术显然是不明智之举，但良策是什么？出路在哪里？ 采用一种能识别核酸双链分子中的UTP并降解核酸的UNG酶，在下一次PCR之前对模板及其它反应物进行处理，可以防止因产物污染所致的假阳性。目前我国国家药政部门在接受PCR相关检测试剂盒申报时，已经把是否采用了UNG酶作为审批条件之一。但在现阶段还存在一些技术问题，其中UNG酶的活性保存非常重要。如果使用了失活的UNG酶，同时检验人员因为知道使用了UNG酶系统，而放松PCR产物的常规处理，将会导致更为严重的后果。另外，目前UNG酶的造价不低，每一检测人份的费用上升比较明显。但随着重组UNG酶生产和纯化技术的成熟，造价将会降低。今后，UNG酶及其相应的系统将成为常规PCR检测试剂盒的组份。 然而，我们不能因为UNG酶系统的应用，而疏于PCR操作过程的规范化。事实上，自PCR技术诞生之日起，为保证实验研究的顺利开展和临床检测的精确可靠，发明人就已经明确规定了应用PCR技术必须具备的实验室条件、人员技能和各种防污染措施。比如：具备三间可通风、进出有序和功能不同的工作室；各室配备专用移液器并不得互换使用；使用带过滤芯的一次性移液头；每次反应均要设置阴、阳性对照；检验人员必须接受专门训练，等等。我们的实践经验表明，只要严格按照上述规定操作，就完全可以避免产物污染所造成的假阳性。因此，我国今后仍必须在实验室管理方面加大力度，除了对试剂盒严格把关外，还要坚决取缔缺乏条件（包括实验室和人员条件）的检验机构开展常规PCR检测。 五、基因定量检测不应该对灵敏度提出过高要求 与反映机体疾病严重程度的某些生化指标不同，病原体基因检测结果的“有”和“无”（定性）要比“高”和“低”（定量）的意义更大。目前，对许多感染性疾病而言，血液和组织内病原体含量的高低与组织损伤程度、对治疗的反应性以及预后的关系等都未完全阐明。病原体基因定量分析只有在HBV、HCV、HIV等病毒感染方面的应用价值得到了肯定[5，6]。 从技术角度考虑，灵敏度、特异性和精确度是考核基因定量分析方法的重要指标，最理想的是这三项指标均优；但从临床工作的需要来看，针对不同病人和疾病的不同阶段，对检测技术参数的要求有所侧重。以HBV基因定量为例，使用干扰素抗病毒治疗的病人，判断疗效的重要手段之一是观察HBV基因含量的变化：在治疗后的最初1~ 3个月，病毒基因呈对数级地下降，往往预示有反应性；继之，至某一阶段降至杂交法的敏感度以下，最终病毒可能被完全清除。PCR定量技术可以把敏感度提高到检测每毫升100个拷贝的水平[7，8]，但低于杂交检测cut-off值（如bDNA为700000拷贝/ml）的HBV基因量，即足以充分反映抗病毒治疗的效果，再进一步量化的意义不大，在一定时间内作定性检查即可。因此，我们认为，在建立和开发各种基因定量分析技术的过程中，不要脱离临床实际过于强调灵敏度。 六、基因检测和免疫学检测技术具有互补性 诊断HBV感染的免疫学试验是著名的“两对半”，又称之为HBV免疫标志物。过去由于无法对HBV感染作病原学检查，曾一度经津津乐道于分析“两对半”检测结果及其各种组合形式与感染状态、传染性及对治疗的反应性等问题之间的关系。最典型的例子莫过于把所谓“血清转化（serum conversion）”，即HBeAg消失，出现抗-HBe看作抗病毒治疗有效的标志，后来发现在这些发生了“血清转化”的病人中，有部分病人系病毒在药物（如干扰素）的选择或免疫压力下产生了前C基因突变，不表达HBeAg，但血清HBV DNA则阳性，甚至含量很高。病毒基因变异所致的一系列病毒表型的改变，向免疫学诊断提出了严峻的挑战。基因诊断（包括突变基因分析），技术很好地解决了这个问题。有人甚至捕捉到这样一个重要信息：在约6%的抗-HBs阳性HBV感染者的血清中，检出HBV DNA。使我们认识到，HBV S基因变异形成突变的包膜蛋白，使一贯被认为是保护型抗体的抗-HBs失去中和病毒的作用。 以上我们从一个侧面阐述了基因检测的重要性，但我们不能因此而断言病毒基因检测可以取代免疫学检测。基因检测所显示的优越性也恰恰是它的缺陷之所在，因为我们只能通过它来判断病原体的有无和量的多少，至于病原体进入体内之后，机体作出了何种反应？程度如何？反应的结果如何？等等，基因检测结果不能对此类问题作出全面的回答。众所周知，感染后的免疫应答，包括体液和细胞免疫应答，是感染病学和免疫学的重要研究内容，也是判断被感染者病情、治疗反应、预后，以及流行病学调查的重要依据。客观地讲，基因检测和免疫学检测技术在目前应当互补共存，绝大多数情况下两者缺一不可。 参 考 文 献 Urdea MS, Running JA, Horn T, et al: A novel method for the rapid detection of specific nucleotide sequence in crude biological samples without blotting or radioactivity: application for the analysis of hepatitis B virus in human serum. Gene 1987;61:253~ 264 Hendrickl DA, Stowe BJ, Hoo BS, et al: Quantitation of HBV DNA in human serum using a branched DNA(bDNA) signal amplification assay. Am J Clin Pathol.1995；104:537~ 546 缪晓辉，孔宪涛，戚中田：微反应板酶联夹心杂交定量检测乙型肝炎病毒基因组. 中华传染病学杂志 2000；18(1):37~ 40 徐文胜，缪晓辉，潘怡，等：不同血清抽提方法HBV DNA得率的比较。本期 缪晓辉，戚中田：HBV基因定量分析技术的原理和方法.肝脏 1999；4（1）:46~ 48 缪晓辉，孔宪涛：HBV基因定量分析技术的应用价值、存在问题及展望.肝脏 1999；4（3）：172~ 174 缪晓辉，戚中田，孔宪涛：非竞争PCR及其产物酶联杂交定量检测乙型肝炎病毒基因. 第二军医大学学报 2000；20（1）：21~ 24 缪晓辉，孔宪涛，戚中田：竞争PCR及其产物酶联杂交定量检测乙型肝炎病毒基因.中华肝脏病杂志 2000；8(3):179 发表于：10/25/2001 8:45:00 AM 【推荐给朋友】?【我要评论】?【我要咨询】?【打印此信息】?【关闭窗口】 相 关 信 息 ·你了解酒精性肝病吗？ 〔9/4/2001 5:40:00 PM〕 ·乙肝病毒基因诊断芯片问世 〔9/4/2001 5:43:00 PM〕 ·登记刚刚三天丈夫乙肝病发 新娘请求判婚姻无效 〔9/4/2001 5:54:00 PM〕 ·疫苗发展小史〔9/5/2001 9:33:00 PM〕 ·为肝病患者搭健康桥 上海市组建肝病研究中心 〔9/4/2001 5:56:00 PM〕 Copyright ? 上海市第二军医大学附属长征医院感染科 2000－2001 联系电话021)66540109-8603 Email：[email protected]