HBV基因变异与临床关系-->可可转移

可可

望龙　姚集鲁

510080广州铁路（集团）公司中心医院（邱望龙）；中山医科大学附属第三临床学院（姚集鲁）



关键词:





　　随着聚和酶链反应(PCR)产物直接测序技术的应用发展，使人们能从分子生物学水平来认识一些病毒感染的临床问题。发现乙型肝炎病毒(HBV)基因变异与临床关系密切。现对近年来国外乙型肝炎病毒基因变异临床研究的几个热点进行归纳，综述如下。

　　一、乙型肝炎表面抗原(HBsAg)阴性的HBV变异株感染

　　(一)　免疫接种个体HBV的“突破”(breakthrough)感染［1］　Carman等首先发现1例接种了乙肝疫苗并产生保护性抗-HBs的意大利婴儿被感染了HBV，其核苷酸序列第587位碱基发生了G→A的变异，导致HBsAg第145位甘氨酸被精氨酸替代。HBsAg第124～147位氨基酸残基构成a抗原决定簇表位，其在第124和137、139和147位各有一个半胱氨酸残基，借其硫基间二硫键而形成一个双环结构来维持HBsAg的抗原性，有实验表明HBsA′g的第145位氨基酸被替换可显著降低HBsAg的抗原性，使之不能与单克隆抗a抗体及疫苗接种后抗体或恢复期血清抗体结合或结合力下降，从而产生免疫逃避株感染。这种变异株多在同时接种乙肝疫苗和注射免疫球蛋白的儿童中检出。除此在肝移植后用大剂量单克隆抗-HBs静滴来阻止HBV再发的患者中可检测到同样的变异株，提示这种变异株与宿主的免疫压力有关。在冈比亚的一组研究报告中发现在接种乙肝疫苗的儿童中有一部分尽管产生了高滴度的抗-HBs，但还是发生了HBV的突破感染，其特征是141位赖氨酸被谷氨酸替换，这一变异株导致单克隆抗体试剂不能检出伴有141位变异的HBsAg颗粒。

　　(二)　HBsAg阴性抗-HBc和/或抗-HBs阳性的HBV变异株感染［2］　日本学者报告从1例HBsAg阴性但抗-HBs阳性患者中克隆出HBV DNA，发现HBsAg在第126、131或133位氨基酸被替换，同时伴有前S基因缺失变异而无读框移位，也有学者报告在1例HBsAg阴性抗-HBc阳性的中国患者中检出了S基因a决定簇编码区前的插入变异，由于改变了HBsAg的抗原性，使现行的多克隆试剂不能检出。

　　(三)　HBV感染标志物全阴的HBV变异株感染［3］　有学者报告2例临床诊断为非甲、乙、丙、丁、戊型肝炎患者的HBV全基因序列测定，结果显示在X区核甘酸(nt)位置1770-1767处8个碱基的缺失，导致读框移码，产生一个新的终止密码，使X蛋白在C末端截断，只有长134个氨基酸，比全长序列X蛋白短20个氨基酸，另外还发现DR2有一T→C的变异。X区是病毒复制的基础，X区包含C区启动子及上游调节序列和反向调节序列，另外，增强子Ⅱ和DR1、DR2也跨越X区。X蛋白本身也可以作为增强子Ⅱ和C区启动子的反式激活因子。因此，X区变异在病毒复制中起关键作用。C末端X蛋白的截断使之丧失了其反式激活活性。缺失的8个核苷酸也正位于增强子Ⅱ和C区启动子序列内，而增强子Ⅱ主要是调节S区启动子的活性，因此，X区8个nt的缺失负面影响增强子和启动子活性，导致HBsAg和HBcAg前基因的合成下降。DR2T→C的点变异也可降低HBV DNA的复制，因为，DR1和DR2与HBV DNA复制的始期有关。因此，“静息”HBV感染是由于这些变异抑制了HBV DNA的复制和表达，导致低水平HBsAg和抗-HBc，用常规免疫学方法不能检出。

　　二、HBV变异株的母婴传播与新生儿暴发性肝炎

　　大多数HBV垂直传播发生在HBeAg阳性携带者母亲，感染的婴儿大多数是无症状携带者，出生于抗-HBe阳性母亲的婴儿多趋于清除病毒，多伴有严重的HBV感染过程，包括暴发性肝炎，而新生儿暴发性乙型肝炎的发病机制至今尚不清楚。HBV变异株是否与此有关是近来研究的热点。早期Teruzawa等报道两名出生于抗-HBe阳性母亲患暴发性肝炎的婴儿都伴有HBV前C终止变异，认为前C终止变异株在新生儿暴发性肝炎中起重要作用。但最近来自台湾的报道在小儿暴发性肝炎仍以野生株HBV感染为主［4］。有学者对3例新生儿暴发性肝炎的母亲和小孩HBV核苷酸序列进行分析，在3位母亲中都发现有与adw2和ayw亚型相同的HBV序列，在1例存活者小孩中这两例亚型都被传播，而只出现ayw亚型的另外两例小孩都发生了致死的重症肝炎。对其中一例进一步分析发现在母亲的病毒池中只有一个分支被传播，并在小孩中出现了多种新的变异株［5］。这些资料提示来自母亲的占次要的HBV亚群(subpopulation)可以在小儿中成为优势株。新生儿暴发性肝炎可能与这种选择病毒株传播有关。

　　三、HBV前C/C基因变异与临床不同的肝脏疾病谱

　　HBV感染临床可产生不同的肝脏疾病谱，以往认为主要与宿主的不同免疫应答有关，近来的研究发现与病毒本身密切相关。前C区基因的变异包括启动子的丢失、终止密码的产生、信号肽裂解部位附近核苷酸的误义变异以及缺失和插入变异导致读框移码等都可产生HBeAg合成和分泌的障碍，但不影响病毒的复制。其中研究较多的是前C区密码28终止变异(nt1896G→A)，早期的研究发现主要发生于地中海及远东国家的一些较严重的慢活肝和重症肝炎患者中，因此被认为具有地方流行性和与肝损害严重程度相关。近来的文献表明在无症状携带者及HBeAg阳性者中也可检出前C终止变异，而且，不仅可在年龄大感染时间长者中检出，也可在年轻者感染时间较短者中检出。因此，前C终止变异可能并不是长期承受体内免疫压力而产生的一种免疫逃逸，因为血清HBeAg消失反而使更多的CTL进入肝组织对感染肝细胞进行攻击，前C终止变异可能仅是前基因组RNA转录错配的结果。已有研究表明在前基因组RNA的茎襻结构中nt1858与1896碱基配对，nt1896G的变异受nt1858碱基的限制。如果1858位碱基为C，则不易发生前C区nt1896G→A的终止变异，像西欧和北美人携带的HBV毒株nt1858为C，故少见前C终止变异，要发生前C终止变异，须1858位同时发生C→T的变异。近越来越多资料提示前C区终止变异与肝损害严重性无相关［6］。

　　而几组研究都显示C基因变异与肝病活动及严重性有关。在慢性HBV感染HBeAg阳性免疫耐受期，早期常无肝病活动，C基因序列显示保守，在e抗原转换前期，HBeAg仍阳性，但可有肝病活动，C基因出现随意变异，推测起激发CTL应答的作用，在血清转换成抗-HBe阳性后肝病仍可活动，C基因产生聚集变异，提示可能是CTL免疫压力下产生的一种免疫逃逸的结果。有作用报道了C基因的两个重要的聚集变异区：密码48-60和密码84-101，推测其为CTL识别的表位。最近有作者对抗-HBe阳性慢活肝患者C基因序列分析，发现变异主要聚集在CD+4辅助性T细胞和B细胞的表位，因此推测可能是CD+4辅助性T细胞和B细胞对HBV产生选择性体液免疫压力的结果［7］。

　　四、HBV基因变异与干扰素应答的关系

　　近来对前C区基因变异的研究显示干扰素治疗并不增加前C区基因变异的机会，但对HBeAg阴性而HBV DNA阳性的前C区终止变异株感染者是否可用干扰素治疗及治疗应答如何?目前尚无定论，早期的报告认为其对干扰素的应答率显著降低，Brunetto等报告前C变异株的近期应答率不低，但缺乏持久应答。Lok等发现前C1896变异株者干扰素应答显著高于野株组，但同时变异株组治疗前转氨酶一般较高，因此认为前C1896变异株对干扰素应答高可能是间接的，最近的研究结果显示前C终止变异并不影响干扰素治疗应答，但在干扰素治疗过程中产生前C变异往往可预示病毒清除失败［8］。

　　关于C基因变异与干扰素治疗应答的关系，Naoumov等发现干扰素治疗无应答或治疗后又复发的患者C基因变异显著多于治疗应答者，复发者有新的变异出现，作者认为C基因变异通过干扰T细胞功能而影响干扰素应答。Fattovich的研究也认为C基因变异可影响干扰素治疗应答，特别是辅助性T细胞表位的变异，但在治疗过程中，C基因的B细胞和辅助T细胞表位未见有进一步变异发生，且在治疗中出现C基因碱基置换并不影响治疗结果［9］。

　　综上所述，HBV基因变异与临床的关系仍未清楚阐明，HBV基因变异受诸因素的影响，如方法学上的限制，PCR产物的克隆测序，费用昂贵，费时长，操作繁杂，难以对较多数目的临床标本进行检测。PCR产物直接测序只能检出占病毒群体10%以上的变异毒株，含量较低的弱势将被漏检。通过错配PCR或等位基因PCR技术可检测已知的点突变，操作简便，敏感度高，但不能检出其它部位的变异，不能分析变异点之间的补偿关系。另外，HBV复制时经过逆转录产生前基因组RNA的中介体，RNA的反转录缺乏读码确认，故HBV具有较高的自发变异率，每年每个核苷酸的转换率约为2×10-4。因此，分析变异株的临床意义最好以同一个体开始感染时的序列为参照，但事实上慢性HBV感染要找到何时为HBV开始感染往往较困难。因此，分析基因变异的临床意义须全面考虑。



参考文献



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2　Feitelson MA,Duan LX,Guo J,et al.Precore and X region mutants in hepatitis B virus infections among renal dialysis patient.J Viral Hepat,1995,2:19-31.

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4　Hsu HY,Chang MH,Lee CY,et al,Precore mutant of hepatitis B virus in childhood fulminant hepatitis B:an infrequent association.J Infect Dis,1995,171:776-781.

5　Weizsacker F,Pult I,Geiss K,et al.Selective transmission of variant genomes from mother to infant in nenonatal fulminant hepatitis B.Hepatology,1995,21:8-13.

6　Lindh M,Furuta Y,Vahlne A,et al.Emergence of precore TAG mutation during hepatitis B e seroconversion and its dependence on pregenomic base pairing between nucleotides 1858 and 1896.J Infect Dis,1995,172:1343-1347.

7　Carman WF,Thursz M,Hadziyannis S,et al.Hepatitis B e antigen negative chronic active hepatitis:hepatitis B virus core mutations occur predominantly in antigenic determinants.J Viral Hepat,1995,2:77-84.

8　Talbodec N,Loriot MA,Gigou A,et al.Hepatitis B virus precore mutations and HBeAg negative reactivation of chronic hepatitis B after interferon therapy.Liver,1995,15:93-98.

9　Fattovich G,Mcintyre G,Thursz M,et al.Hepatitis B virus precore/core variation and interferon therapy.Hepatology,1995,22:1355-1363.