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国外医学消化系疾病分册1999年第19卷第4期



乙型肝炎病毒感染基因治疗的进展



上海第二医科大学附属仁济医院、上海市消化疾病研究所（20001）　陈萦晅　李继强（综述）　曾民德（审校）



　　摘要　利用基因技术治疗慢性乙型肝炎病毒感染的研究进展迅速，如反义寡核苷酸、核糖核酸酶及显性失活突变体等。本文就这些技术近年来在抗HBV方面的研究进展进行综述。



　　关健词：乙型肝炎病毒感染　基因治疗　基因技术



　　乙型肝炎病毒（HBV）感染是世界上一个严重的健康问题，由于现有的治疗方法疗效都比较有限，新的抗病毒方法正在不断的探索中。基因治疗是其中较有前景的一种，指将治疗性基因导入发生病变的细胞内，以替补突变基因的功能或封闭异常基因表达的治疗方法。随着对HBV基因组的序列、结构蛋白的功能及其生命周期的进一步了解，产生了一系列针对阻断病毒基因的表达或功能的基因治疗方法。以下简述近来应用反义寡核苷酸、核糖核酸酶及显性失活突变体治疗慢性乙型肝炎病毒感染的机制、应用效果及前景。



1　反义寡核苷酸



　　反义寡核苷酸指合成的20个碱基左右的一小段核苷酸，按照Watson-Crick碱基配对原则，与特定的靶序列杂交，从而抑制基因的表达。HBV具有逆转录病毒的特性，其3.5kb前基因组既是合成DNA的模板，又是指导蛋白合成的模板。当反义寡核苷酸特异地与HBVmRNA结合形成RNA-DNA（反义DNA）或RNA-RNA（反义RNA）杂交体，可定向抑制和阻断其复制和表达。



1.1 反义DNA



　　近年来，反义DNA已成功地在体外实验系统抑制HBV的复制，并甄选了HBV基因组中易于受其攻击并产生最佳抑制效应的关健区域，如S基因翻译起始位点、SPⅡ增强子区、前S2基因起始位点[1]、多聚腺苷酸信号区[2]、HBV衣壳化（encapsidation）信号的茎环区域[3]等。在HBV感染的动物模型如鸭[4]、裸鼠[5]、土拨鼠[6]的研究显示了该策略在体内的适用性和有效性。最近，Moriya等[7]采用转HBx基因鼠肝癌模型的研究发现，针对HBx基因起始区的硫代磷酸反义DNA能特异性地抑制转基因鼠肝组织中HBx基因的表达，从而阻止肝脏癌前损害的发生，这既表明反义DNA能抑制HBV基因的表达，又为其可阻止HBx反式激活作用而防止肝细胞癌的发生提供了证据。Nalazona等[8]设计了针对HBV多聚腺苷酸信号和5‘-上游序列21聚硫代磷酸反义DNA，导入Huh7细胞，再将HBV adwR9质粒转染Huh7细胞，结果发现HBV DNA的复制几乎被完全抑制，对病毒RNA转录物及HBsAg的抑制率也分别达60%和97%。该实验为利用反义DNA避免HBV感染的的肝移植患者新移植的肝脏再次受感染提供了依据。



　　反义DNA要在体内达到显著的抗病毒作用，高效的肝细胞-特异性传递系统的设计是个关健。大多数反义DNA是多阴离子分子，不能自由地透过细胞膜。一些体内、体外实验利用肝细胞特有的无唾液酸糖蛋白受体（ASGP-R）介导的细胞摄粒作用将反义DNA传递到靶细胞[2]，并获得了成功。最近，Madon等[9]用ASGP-R配体的N-氯化乙酰-葡萄糖胺-牛血清白蛋白与链霉亲和素、多聚L-赖氨酸交联，再与未修饰的人类5型腺病毒复制缺陷突变体dI312以及针对HBV前基因组衣壳化结构的硫代磷酸反义DNA结合构成基因传递系统，在禽类肝细胞LMH中进行导向性和抗病毒活性的研究。结果发现，DNA转导效率＞95%，对HBV复制抑制率达80%，没有明显的细胞毒作用。上述研究表明，将腺病毒载体引人受体介导的基因传递概念，将显著提高传递效率；用与靶细胞种属相距较远的腺病毒载体可以避免有复制能力和（或）转录能力的腺病毒突变株所引起的毒性作用。



　　反义DNA治疗HBV感染的另一个值得注意的问题是“非反义效应”的影响。许多研究发现，并不是所有的抗病毒效应都是由反义DNA的反义作用引起。RNA-DNA杂交体除了直接阻断翻译外，也可通过激活RNaseH，使杂交体中的RNA降解而抑制基因的表达；而RNaseH对非靶mRNA的降解显示了非反义效应。此外Krieg等[10]发现含有CpG序列的反义DNA以非序列依赖方式在体外和体内诱导鼠B淋巴细胞的增生，并促进其分泌免疫球蛋白。因而，反义和非反义效应的系统研究对反义DNA抗HBV的应有具有重要意义。



1.2 反义RNA



　　反义DNA具有抗HBV的作用，但其作用短暂，需要反复多次给药。与反义DNA不同，反义RNA在细胞外以DNA形式存在，通过病毒传递系统如逆转录病毒、腺病毒、腺相关病毒传递到靶细胞，稳定整合到宿主基因组的转录单位并持续表达，产生长期的抗病毒效应。Wu等[11]构建针对HBsAg mRNA全部编码区、5＇区域1.0kb和582kp的3个哺乳类反义RNA表达载体，转染Hcp 3B细胞，结果转染的Hcp 3B细胞均有反义RNA转录表达，并几乎完全抑制HBsAg的产生，作用持续时间长达10个月余。病毒靶序列选择是反义RNA抗HBV治疗的关健因素之一。Putlitz等[12]针对HBV基因组5个不同片段构建了不同的HBV反义PNA重组表达载体，发现AS4（基因组2721-2433核苷酸序列）对HBV复制和抗原表达的抑制率达60%～75%；不影响鸭HBV的复制，表明反义RNA的抗病毒作用是种属和序列特异性的。令人惊奇的是，针对HBV衣壳化信号E的AS2对HBV复制没有影响。可能的解释是，HBV前基因组RNA在E区域有高度复杂的二级结构，病毒多聚酶和一些宿主蛋白因子亦结合于该位点，影响了AS2的结合；另外，AS2大部分靶序列在HBV其他转录物中也存在，以致效-靶比例降低。反义RNA抗HBV的作用机制与反义DNA不同，可能为:（1）在翻译期间阻止核糖体的附着和（或）延长（翻译终止）；（2）激活双链特异性RNaseⅢ,使RNA-RNA降解，减少了病毒复制的模板mRNA的数量；（3）通过脱氨酶作用，降低双链稳定性和（或）编辑RNA序列；（4）激活干扰素相关抗病毒途径的酶：2＇，5＇-寡腺苷酸合成酶、PKR蛋白激酶，前者通过合成的2＇，5＇-寡腺苷酸激活正常情况下处于非活性状态的RNase L，后者通过自身磷酸化，介导eIF-2磷酸化而产生抗病毒作用。



2　核糖核酸酶



　　核糖核酸酶是一类具有催化活性的小分子RNA，能特异地结合于靶RNA上，形成RNA-RNA杂交体，催化特定序列RNA分子的切割。从结构上主要分为两类：锤头状核糖核酸酶和发卡状核糖核酸酶。它们正被作为病毒基因表达和病毒复制的抑制物来进行研究，并在HIV中取得较大进展[13，14]。一些研究也已清楚地显示核糖酸酶可以特异性地切割HBV RNA。



　　Von  Weizsacker等[15]发现HBV RNA在体外可被核糖核酸酶切割，从一条DNA模板转录而来的3个核糖核酸酶同时具有剪切活性，多个核糖核酸酶同时表达将有益于对抗高的病毒靶序列变异。Beck等[16]的报道指出，锤并没有状核糖核酸酶介导的对HBV衣壳化ε的有效切割可以发生在体外及细胞抽提物中，而在完整细胞中则无该作用。并发现共转染细胞经蛋白酶K处理、酚抽提、Mg2+浓度从1mM增至5～10mM时切割效率最高，这表明与靶RNA和（或）核糖核酸酶结合的细胞蛋白以及低浓度Mg2+抑制了细胞内核糖核酸酶的活性。核糖核酸酶对细胞内HBV  DNA的低效切割作用部分是因为用共转染技术来进行分析的，这一系统中，HBV前基因组的转录是由外源性启动子所启动，从而导致HBV DNA的特续复制。但在重叠感染的细胞系中，RNA前基因组的切割会阻断共价闭环（ccc）DNA的扩增。近来Welch等[17]设计了几个针对HBV基因组不同保守区域的发卡状核糖核酸酶，在人tRNAvalpolⅢ启动子控制下，克隆到逆转录病毒载体，率先在培养的人肝癌细胞中的研究其在细胞内的作用。结果发现，发卡状核糖核酸酶能减少HBV病毒颗粒的产生达66%，而结构高速后的这些核糖核酸酶抑制HBV的产生可达83%。这表明这些核糖核酸酶能在复杂的细胞环境中，如在生理条件下切割HBV RNA；他们还证实了核糖核酸酶效应由序列特异性切割引起，而非反义效应。以上研究结果证实了核糖核酸酶介导的人类乙型肝炎病毒基因治疗的可行性。



　　核糖核酸酶基因能通过多种病毒（如逆转录病毒、腺病毒、腺相关病毒）载体传递系统被传递，并在靶细胞中持续表达。由于其可以不可逆的使靶RNA失活，可在体外循环利用，催化效率高，能避免重复给药，可能产生终生保护，所以前景看好。



3　显性失活突变体（DN突变体）



　　细胞内干扰性多肽蛋白的合成能干扰其正常对应物的生理功能。例如，表达HIV gag和Rev突变蛋白的细胞能抑制“野生型”HIV的复制[18，19]，它代表一种细胞内免疫作用[20]。一些研究也已清楚地显示，显性失活突变体在体外可特异性抑制HBV复制，是值得研究的新型抗病毒剂。Scaglioni等[21]设计了5个不同的土拨鼠HBV（WHBV）和HBV核心蛋白突变体，发现表达核心蛋白N端71-171aa的pCN1、pCN2、pCN3、对WHBV的抑制率分别为36%、38%、12%；而融合了S蛋白pCN4、pCN5对WHBV和HBV的抑制率可达85%～90%。上述实验证明，DN突变体能强烈抑制WHBV和HBV的复制，DN核心突变体通过核心序列氨基端的结合域与野生型分子相互作用，S蛋白融合可使突变体更为稳定，并产生阻止核心蛋白单体正常装配的突间阻碍。Von Weizsacker等[22]将多种长度不同的多肽融合到病毒核心蛋白的羧基端产生显性失活突变体，在效靶比例为1:10时抑制病毒复制的效率可达90%。DN突变体并不影响野生型病毒核心蛋白的生物合成，所以其是在翻译后水平抑制病毒复制。目前认为DN突变体抗病毒的机制可能是：（1）干扰野生型病毒颗粒的装配；（2）抑制病毒前基因组RNA的衣壳化；（3）在早期阶段阻断病毒DNA的成熟。这些显性失活突变体有病毒核心蛋白本身所介导的种属专一性。



　　目前已经建立了表达HBV DN核心突变体的重组逆转录病毒载体和腺病毒载体作为基因转移的工具。Scaglioni等[23]用HcpG2和HepG2.2.15作为HBV知暂或持续感染的细胞模型证实，这两个细胞传递系统能有效地导入肝细胞，导入率分为别为90%和100%，并几乎完全抑制嗜肝病毒DNA的合成。



　　显性失活突变体优于核糖核酸酶、反义寡核苷酸的潜在优势在于它与病毒序列变异无相关性，从而减少了形成或累积成“治疗逃逸突变株”的危险；而且产生抗病毒作用所需的细胞内浓度相对较低；再者，DN突变体不影响细胞的转录，所以对转染的细胞没有直接的毒性作用。



4　结语



　　总之，病毒感染是获得性的遗传病，抗病毒基因治疗具有广阔的应用前景。反义寡核苷酸、核糖核酸酶、显性失活突变体在体外实验系统和一些体内模型中对HBV有明显的抑制作用。但是由于基因突变或同一病毒不同亚型的存在，细胞内多种酶的存在，以及体内外RNA二级结构不一致、敏感靶位点的选择、基因传递的肝导向性、外来基因植入后肝细胞的免疫原性的变化等问题，使得它们的应用受到了相当的限制。随着对其性质研究的进一步深入以及化学修饰、靶位点体外筛选程序的建立，腺相关病毒载体、阳离子脂质体HBV感染动物模型等的应用，基因治疗可能将为抗HBV的临床治疗开辟新的途径。



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