细胞的主宰

tonychant

TheScientist.com - April 6, 2010

Master of the Cell
细胞的主宰
by Judy Lieberman
（本文是作者研究生涯自述，值得慢慢品味）
RNA干扰（现象）不但在许多疾病的治疗方面有着广阔的应用前景，而且也是（就算不是全部）绝大多数细胞内生命过程的主要调节者之一。

在最近的十年中，生物学最大的惊喜之一就是发现人类拥有的蛋白编码基因与蠕虫一样多！这一令人困惑的发现在我们意识到自己忽略了（基因组DNA中）一个重要部分后开始变得合理，即很多DNA转录出的RNA，从未被翻译成蛋白质！【注：以前过于关注蛋白编码基因】当我们对这些RNA了解的越多，意识到它们增加的复杂性也就越多。其中一些非编码RNA，如microRNA（因其只有22nt左右，故名）可通过“砍断”蛋白编码基因的转录本或抑制其翻译成蛋白质而阻止蛋白表达。它们对细胞命运和功能的影响远比我们当初想象的要大得多。近年来，这一点已经研究的比较清楚：microRNA作为主要的开关调控着巨大的基因网络。

本人（作者Judy Lieberman）选择研究microRNA工作可谓是一波三折。起先我是一名高能粒子理论物理学家，但8年后决定改学医学，这样可更直接的帮助人们。在学习血液学和肿瘤学期间，我开始在麻省理工学院Herman Eisen实验室做博士后。这是在（20世纪）80年代早期，分子生物学开始独立成科：刚刚发现了T细胞受体（Eisen实验室也参与了），同时，HIV也即将被确认为AIDS的病原体。由于没有有效的治疗方法，AIDS患者死的很惨。Eisen实验室研究了细胞毒T细胞，它们被认为可以保护人类免受病毒的感染，如HIV。

做完博士后，我在Tufts（血液科，带有实验室）——新英格兰医学中心得到一个工作，从此决心专注于弄懂HIV诱发的T细胞应答及它们为何控制感染失败，这也是瞄着开发出基于免疫的疗法。另外，我们还研究细胞毒T细胞启动各种感染细胞发生凋亡的机制。

1998年，当我还埋头于HIV和T细胞免疫的工作中时，读到了Fire和Mello的文章，他们首次描述了线虫中RNAi的现象。我被深深地吸引了，并且困惑不解：一段双链RNA怎么可能沉默一个基因的表达呢？于是，我经常询问一个研究蠕虫的同事——Keith Blackwell，期望他能解释这一奇怪的现象。

3年后，当Carl Novina（Phillip Sharp实验室的博士后，我在Tufts时认识他，当时他还是一个研究生）跑来给我看他准备发表的新闻（即哺乳动物细胞中也存在类似的RNA干扰现象）时，我的好奇心得到了极大的满足。Tom Tuschl已经发现细胞内一些基因可以被导入的一小段双链RNA沉默。Carl想探究这一方法能否被用于抑制HIV感染免疫细胞。想到我们如果能用这些小干扰RNA来阻断HIV感染人类，这前景太诱人了！

因为T细胞（HIV天然的靶细胞）很难被转染，起先我们利用改造的上皮细胞（能表达CD4和CCR5，HIV感染必需的受体）来尝试阻断效果，当转染一段针对CD4 mRNA的小干扰RNA后，HIV感染率真的下降了4~10倍！于是我们再接再厉，设计了针对编码HIV衣壳基因的siRNA，结果宿主和病毒的mRNA都下调了，并且，任何一个基因的下调均能阻止HIV在培养细胞中传播。这是一个很大的进展，这是首次发现siRNA有用于治疗人类疾病的潜力。当然，当时无人明白RNAi实际上是最基本的一种反病毒机制。一些没有适应性免疫系统的生物，如植物和那些更低等的动物，利用RNAi来攻击和降解病毒的mRNA。现在回想起来，我们做的这些HIV实验真是太有意义了！

【注：为与Knock-out（基因）敲除相区别，Knock-down在本文中译为“敲低”，特指用siRNA下调靶基因的表达】

RNAi不仅仅是细胞的一种抗病毒的技巧，而且是基因表达最主要的调控者，指引细胞对发育和环境的提示作出反应。

我非常希望我们那前景诱人的体外实验结果能转化成治疗方法，但在2001年，还没有理想的小动物作为HIV感染模型。在我不知情的情况下，我的博士后在Erwei Song领导下，决定先检验RNAi能否保护小鼠不感染肝炎病毒。两组小鼠在快速大量静脉注射（所谓“动力进样”）siRNA后，一些器官中带有荧光素酶的转基因出现下调。下调效果最明显的是肝细胞，表明RNAi可能真的能起保护作用。Erwei和他非常善于动力进样的中国朋友试图沉默一个caspase的转录本，实际上所有的嗜肝病毒都能利用这个酶启动肝细胞发生凋亡，但是，这次RNAi没有效果，且全部的小鼠都死亡了。最后当Erwei告诉我这些情况时，我肯定了他们的方法，但建议换一个靶基因。

由于我一直研究免疫系统的凋亡和抗病毒免疫，知道不管何种原因，肝炎时肝细胞死亡是由于一个叫Fas的死亡受体被活化所致。HBV或HBC感染后，不直接杀伤肝细胞，而是先引发炎症，诱导肝细胞表达Fas，然后吸引带有FasL（Fas的配体）的杀伤淋巴细胞，后者能攻击肝细胞。也就是说，Fas通路活化是肝脏损害的常见原因。因此，将靶基因改为Fas应该是个好主意。

通过动力进样针对Fas的siRNA后，整个肝脏Fas的表达下降了80%，结果，肝细胞损伤明显减轻。另外，这一方法不仅能预防慢性肝炎模型的肝脏损伤，而且对急性肝炎也有效，如一般所有的小鼠都会在3或4天死亡，但经siRNA下调Fas的表达后，大部分小鼠能耐受致死剂量的病毒并康复。很明显，“敲低”Fas受体能有效预防各种肝炎发生的肝脏损害。这个实验给人印象最深的就是做起来太容易了！从我们开始选择Fas（作为靶基因），到完成所有的实验，只有1~2个月！当所有的工作都顺利时，感觉你在观看一个真正的基础性的过程，而不是一条古怪的旁路。我特别兴奋且乐观的认为小RNA可开发成一种新药。

随后不久，研究表明开发RNAi药物并非易事。活性小RNA，又叫小干扰RNA或siRNA，需通过结合匹配的mRNA序列并切断它来沉默基因。但研究人员发现siNRA能沉默其它（基因）的mRNA，不仅仅是靶基因。这一“脱靶效应”可用2种机制来解释：（1）其它基因的mRNA上有类似的序列；（2）siRNA触发了细胞内的免疫感受器，后者能识别病毒双链RNA，引起炎症和播散免疫刺激。这些问题很快就有人研究清楚：对siRNA的糖骨架进行化学修饰可阻止大部分的脱靶效应，而不影响基因“敲低”的效果。另一个障碍，也是目前还未解决的最大问题，就是让细胞摄取裸RNA太困难了。肝细胞相对容易是因为肝脏是身体的过滤器官，血流丰富、且有日常摄取颗粒的习性。

我们试图研制基于siRNA的杀微生物药预防病毒在小鼠间通过性传播（尤其是HIV）来阐明这几点，因为当时没有适合HIV传播的小动物模型，我们决定先用疱疹病毒（注：常见的性传播病毒）来试试。为了将siRNA导入上皮细胞，我们对原来的方法进行了改进：将siRNA与脂质体混合，或者在siRNA末端加上胆固醇标签（注：增加脂溶性）。结果显示疱疹病毒感染上皮细胞所需受体的基因被有效沉默了。这一方法实际上能保护小鼠耐受阴道内致死剂量的HSV-2而不会引发对siRNA的免疫识别。然而，上述方法对HIV感染的T细胞无效，我们至今还在尝试通过改进siRNA来预防HIV传播，并且有了一些好的苗头。

2004年，Erwei Song完成了在我实验室的博士后工作回到中国，成为一名乳腺外科医生。2005年，我来到北京参加中美HIV综合性研究计划的年会（本人也参与了组织工作），Song来见我并带来了令人兴奋的消息。他一直在广州中山大学做自己的项目并发明了培养乳腺肿瘤干细胞的方法。当时，肿瘤干细胞学说认为乳腺癌源自极小一部分肿瘤干细胞，这一提法至今还存在争论，其中部分是因为这些（肿瘤干）细胞很难鉴别，而且人类肿瘤的小鼠模型不能准确反应人类肿瘤起源的真实情况。相对来说，这些（肿瘤干）细胞对现今的化疗和放疗具有更强的抵抗能力，当化疗和放疗把普通的肿瘤细胞杀死后，这些（肿瘤干）细胞能存活下来，补充“空缺”，从而导致肿瘤复发。虽然某些肿瘤的起始细胞并不像干细胞，但具有干细胞样的肿瘤细胞有更强的侵袭性、更高的复发和转移率。



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tonychant

看到Song成功培养了这些难以捉摸的细胞（注：Song认为是肿瘤干细胞，但作者比较谨慎），我不禁想知道这些细胞的microRNA表达谱与其它细胞有何不同。microRNA是一类内源性的小RNA，能天然的介导RNA干扰，由Victor Ambros 和 Gary Ruvkun在1993年研究精液时首次鉴定出来，比Fire 和 Mello发现RNAi早了5年。Victor Ambros 和 Gary Ruvkun的研究提示小RNA在调节发育上是能起作用的，后来在其它模式生物中也确认了这一点。据此，我预感到乳腺肿瘤干细胞的microRNA表达谱将不同于分化更高的肿瘤细胞和正常组织细胞，并且这一表达谱在肿瘤干细胞发生分化、形成肿瘤的过程中会发生改变。

通过我们的共同努力，发现乳腺肿瘤干细胞表达的microRNA远远少于分化更高的肿瘤细胞，尤其是let-7家族（人类有11个成员）。let-7是进化上最古老的microRNA之一，Ruvkun实验室发现它能调控蠕虫从幼虫到成虫的转化（蜕变）。我们对let-7的功能分析越多，越对它感兴趣。let-7在肿瘤干细胞中不表达，但随着细胞的分化，它的表达水平逐渐增高。当我们用腺病毒转染外源性的let-7到肿瘤干细胞时，可促使它分为为对治疗敏感的肿瘤细胞。惊奇的是，过表达let-7减少了小鼠形成肿瘤的数目、并且转移也降低了。

似乎我们不仅发现了一种潜在的治疗载体，而且发现了控制肿瘤细胞“干细胞化”的因子。实际上，let-7控制着一定数量的干细胞属性，包括自我更新和分化成不同细胞类型（多潜能分化）的能力，要做到这些，必须调控不止一个的靶基因。Frank Slack先前将癌基因RAS鉴定为let-7的靶基因，David Bartel鉴定了另外一个靶基因，也是癌基因，HMGA2。我们发现，let-7对RAS的调控使干细胞丧失自我更新能力，对HMGA2的调控促进多潜能分化。我们的研究提示let-7可能是一个肿瘤干细胞属性最主要的调控者。综合以前的蠕虫研究成果，let-7是“干细胞化”最主要调控者的结论可能更具有普遍意义，而当时研究人员认为小RNA只是对基因表达和细胞功能进行精细的调整（注：“量”的水平，作者的提法属于“质”的水平）。当我在一篇关于let-7的文章中将其称为控制干细胞本质属性的“主要调控者”时，我被要求改变这一称谓，但是，我确信这些小RNA的作用远远超出了我们当时对它的了解。

当我们在乳腺肿瘤干细胞中检测这些microRNA时，我也关注它们在血细胞分化过程中的作用，比较这是我的老本行（血液学）。我们逐渐对一个microRNA产生了特别的兴趣，miR-24，它之所以突出是因为它在多潜能血细胞分化成各种成熟细胞的过程中表达上调了。这些成熟细胞是没有增殖能力的，当把miR-24导入增殖中的正常细胞和肿瘤细胞时，它们都停止了分裂。为了弄清miR-24的作用机制，必须鉴定出它的靶基因，这是一个挑战。因为microRNA仅有22nt，它们与靶基因mRNA上的互补序列结合并不严格（容许有几个碱基不匹配），这样，基于序列匹配的预测microRNA靶基因的算法会产生数千个潜在靶基因（假阳性），并且有时会漏掉一些重要的靶基因（假阴性），如预测let-7的靶基因时就漏掉了RAS。这些算法特别重视靶mRNA 3’UTR区的7~8个碱基序列，它们与microRNA中2~8个碱基匹配，也称“种子”序列。相反，我们在细胞（平时不表达miR-24）中过表达miR-24后观察了所有microRNA，发现有248个下调的mRNA，与软件预测的靶基因比，并不重叠（注：实际的与预测的吻合性不好）

为了弄明白这一大堆的靶基因，必须先有目的的挑选几个来做实验，我们开始了与哈佛公共卫生学院从事生物信息学的Winston Hide合作。我们发现miR-24不仅抑制重要的调节细胞周期的转录因子——E2F2和MYC，也能对E2F2和MYC活化后许多转录本的表达进行微调。我们在实验中关注的下游基因供miR-24识别的是非“种子序列”。现在，我们认为miR-24是说明小RNA是细胞最主要调控者的又一个例子，能直接抑制信号互联网络中许多基因的表达。

导入microRNA，如let-7或miR-24，促使肿瘤干细胞分化，或使其停止分裂，可被用来治疗肿瘤。let-7可使肿瘤对常规的化疗和放疗更敏感。特别是以肿瘤干细胞为标靶，可能将彻底解决复发肿瘤高度恶性和耐药的问题，这也是我们目前正在研究的方向。
【注：至今在技术层面上将小RNA转入T细胞的难题仍未解决】

转而研究RNA干扰，使我开始得到格外的回报。然而，当我转向新的领域时，我从未放弃要弄明白在开始实验室生涯时提出的问题。虽然我完全放弃了理论粒子物理学，我仍然深深的埋头于研究HIV应对和突破抗病毒免疫、抗病毒杀伤淋巴细胞破坏靶细胞的机制。作为一名内科医生，我希望能解决这些问题，而且弄清楚microRNA发挥作用的机制并利用来提高HIV和肿瘤治疗的效果。在我研究RNAi的工作中，事实上，我从事生物医学研究已有25年了，一方面立足于基础研究，另一方面着眼于转化（医学）工作，寻求将生物学最新的研究成果用来改善病人的治疗效果。RNAi必将被用来生产一类新的药物而治疗多种疾病，对此我很乐观。

富贵数字

太复杂了 看不懂

走遍四方

看到很多RNA

lanwj

通过特定的RNA干扰让特定的基因沉默，RNA干扰技术应该是大有可为的。

[ 本帖最后由 lanwj 于 2010-5-4 18:19 编辑 ]