HBV 病毒学和免疫学诊断进展

brucexm

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（1）血清HBV DNA水平的临床应用

通常乙型肝炎的诊断可通过检测血清乙肝表面抗原（HBsAg）加以肯定，近年来发展了标准化定量的HBV DNA 分析，可进一步确定乙型肝炎的病毒血症。此外还可通过HBV DNA水平分析疾病活动，预测发生肝细胞癌（HCC）的风险或肝脏疾病相关病死率，分析乙肝患者是否需要接受抗病毒治疗，评估和预测药物疗效、发生耐药的风险以及评估患者发生临床耐药的突发事件等。

预测疾病严重性和预后

慢乙肝患者主要可以分成二组：乙肝e抗原（HBeAg）阳性和HBeAg（-）。林德（Lindh）等的分析表明，HBeAg(+)患者中86%和HBeAg(-)患者中5%的病毒载量>107 copies/ml，提示HBeAg(+)患者较HBeAg(-)者HBV DNA载量更高。

研究还发现，在HBeAg(-)患者中，HBV DNA水平与组织学的关系较HBeAg(+)患者更强，但未见HBeAg(+)患者中HBV DNA水平与肝损伤的相关性，只是发现HBeAg(-)个体HBV DNA水平>2×105 copies/ml者较病毒载量更低的HBeAg(-)患者更易发生严重肝病。

研究发现，持续的病毒血症与肝脏疾病进展相关。除了HBV DNA水平，与慢性乙肝进展到肝硬化相关的其他因素包括：年龄较大，基因型C型和B型，丙氨酸氨基转移酶（ALT）周期性急性上升，进展性纤维化，酒精消耗量，合并感染HCV、HDV或HIV。

近期一项长期研究（平均随访11.4年）显示，高病毒载量与肝硬化的发生、失代偿肝硬化和HCC导致的死亡相关。在随访13年时，基线HBV DNA水平检测不到（<300 copies/ml）者HCC累积发生率为1.3%，≥1×106 copies/ml者为14.9%，提示HBV DNA持续存在是HCC发生的高危因素。

参加研究的患者来自癌症筛查中心，在入组后没有接受抗病毒治疗，因而他们代表了自然病史队列。HBV DNA水平与HCC发生的危险度和致死率的相关性独立于基线ALT、肝硬化和HBeAg血清状态，也未表明有短暂或持续的活动性肝炎会增加HCC的危险度。这些数据表明了抗病毒治疗的重要性。

HBV DNA水平与肝组织学

研究发现，不能通过HBV DNA水平区分肝脏轻度组织学异常与重度组织学异常。胡夫纳格尔（Hoofnagle）等评估了167例患者（1980－2003年）。结果显示，组织学活动指数（HAI）≥12（严重）时，HBV DNA的平均水平是8.4log10copies/ml；HAI为0-3（轻微）时，HBV DNA平均水平是7.7log10copies/ml。丙氨酸氨基转移酶（ALT）更适合预测组织活动度。综合考虑，以上结果提示，单纯检测HBV DNA或ALT不能精确描述疾病的炎症活动度。

HBV 在抗病毒治疗中的应用

治疗适应证

美国肝病研究学会（AASLD）指南及我国2006年《慢性乙肝防治指南》明确指出：HBeAg(+)慢性乙肝，若血清HBV DNA水平≥105 copies/ml，伴ALT升高或组织学活动，需要考虑抗病毒治疗。

HBeAg(-)慢性乙型肝炎HBV DNA水平为≥104 copies/ml伴ALT升高时也考虑治疗，若有疑问，可行肝活检加以判断，因此血清HBV DNA水平是决定是否需要抗病毒治疗的重要指标之一。

疗效评价

病毒学应答是评价疗效的主要指标。这是由于抗病毒治疗后病毒载量下降到104 copies/ml与ALT正常、HBeAg消失和血清转换相关，并可降低耐药风险。

在临床试验中，通常应用两个指标：①与基线相比，治疗结束时HBV DNA水平下降均值或中位数，通常以log10 copies/ml表示；②治疗结束和随访结束时HBV DNA水平下降至<1000 copies/ml或<300 copies/ml的百分比，分别被称为治疗结束时应答（ETR）和持续病毒学应答（SVR）。

治疗应答的评估与预测

HBeAg（＋）慢乙肝患者，基线HBV DNA低水平（＜5x107copies/ml）与持续病毒学应答相关；在干扰素治疗时，基线HBV DNA＜109copies/ml可预测高的血清HBeAg转换率。

核苷类药物的早期病毒学应答，在预测持续病毒学应答和低耐药发生率方面具有重要意义。元（Yuen）等的研究表明，拉米夫定（LAM）延迟治疗时发生HBV DNA突破的相关预测因素是治疗早期HBV DNA水平，若患者治疗6个月时血清HBV DNA水平＞200 IU/ml，可预测随后发生耐药的概率为63％。

最近研究表明，若4周时血清HBV DNA水平＜2000 IU/ml，可预测5年后的理想应答（血清HBV DNA水平＜400 IU/ml，HBeAg血清转换，ALT复常和无YMDD变异）。相似的研究结果提示，HBeAg（＋）患者接受替比夫定（LdT）治疗6个月时，血清HBV DNA水平达到检测水平以下（＜60 IU/ml），预测2年后HBeAg血清转换率为49%，ALT正常率为85%，持续病毒应答率为86%，耐药率仅为2%；在HBeAg（－）患者中也获得相似结果，治疗2年的ALT正常率为83%，持续病毒应答率为88%。

总之，在治疗中监测HBV DNA水平，可确定早期病毒学应答（在检测水平以下），并预测治疗应答和可能出现的耐药风险。

HBV DNA定量检测方法与标准化

测HBV DNA试剂，包括信号扩增试验和基于靶扩增的实时荧光PCR试验，其检测灵敏度及范围不完全相同，范围101～109copies/ml（表1）。为了使各种商业公司所生产试剂检测结果具有可比性，WHO专门设立了血清HBV DNA的标准单位，以IU/ml表示，若将copies/ml转换为IU/ml，一般可以以copies/ml÷5＝IU/ml计算。国内公司的检测范围为103-108 copies/ml，均经我国食品与药物管理局（SFDA）批准，与国外相比灵敏度较低，检测范围偏小。

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（2）与HBeAg阴性相关的HBV突变

乙肝病毒e抗原（HBeAg）是乙型肝炎病毒（HBV）产生的重要抗原之一，虽然HBeAg并非病毒复制所必须，但核苷酸序列变异导致HBeAg低表达或不表达在疾病进展中的作用不容忽视。

HBeAg的免疫调节作用

HBeAg由HBV前C基因区 和C基因区共同编码，是一种非壳体化分泌形式的核心蛋白，它自肝细胞分泌，最终进入血液循环。HBeAg对于HBV感染和复制并非必不可少，它主要起到免疫调节作用，以帮助病毒建立持续性感染。HBeAg的免疫调节作用体现在，它可通过抑制HBV前基因组mRNA进入核衣壳的壳体化过程，对DNA复制进行负调控，最终使病毒抗原表达和呈递不易被T细胞发现。此外，作为一种免疫耐受原，它还可以弱化宿主针对病毒感染肝细胞的免疫应答作用。

在临床检测时，血清HBeAg阳性反映肝脏中HBV活跃复制，但HBeAg阴性则有两种可能：①
如果HBV慢性感染者的丙氨酸氨基转移酶（ALT）正常，且HBV DNA阴性，则HBeAg阴性提示为非活动性乙肝表面抗原（HBsAg）携带者；②
如ALT升高，且HBV DNA阳性，提示体内HBV可能发生突变，导致HBeAg阴性， 为HBeAg阴性慢性乙型肝炎（CHB）。

与HBeAg阴性相关的HBV突变

最常见的导致HBeAg阴性的HBV突变有两类 ，一类是发生在基本核心启动子（BCP）区内的A1762T和（或）G1764A突变，使HBeAg表达水平降低，当血清HBeAg水平低于试剂检测下限时，即出现HBeAg阴性结果；另一类是发生在前C区的G1896A突变，导致第28位密码子上的色氨酸密码子（TGG）变为终止密码子（TAG），使HBeAg前体蛋白合成停止，血清HBeAg阴性。

在同一毒株上可发生A1762T、G1764A和（或）G1896A单位点突变、双位点或三位点联合突变。

与HBeAg阴性相关的HBV突变与HBV基因型有关。BCP双突变虽在A-D基因型中都能发现，但在基因型A和C中更为流行。G1896A突变见于B、D、E、G基因型和某些C基因型感染，但与基因型B和D的相关性更密切。因为我国最流行的HBV基因型是B型和C型，因此，与HBeAg阴性相关的HBV突变在我国HBeAg阴性CHB患者中流行率很高。

BCP和前C突变检测的临床意义

首先，BCP和前C突变与疾病的进程和预后有关。BCP和前C突变是导致HBeAg阴性CHB的原因之一，在亚洲，这种类型的HBeAg阴性CHB的临床表现已占主导地位。BCP区1762和1764位点突变在肝硬化 (LC) 和原发性肝细胞癌 （HCC）患者中检出率很高，在基因B型中，BCP突变已被认为是发生LC或HCC的危险因素之一。

但是，关于基因C型的研究结果差异较大，有的结果显示，C基因型BCP突变与疾病向终末期肝病方向发展有关，但也有报告显示，在非终末期肝病患者甚至非活动性肝病患者中，1762和1764位点突变的发生率也很高。这些相互矛盾的结果，反映了不同研究在实验设计和研究群体等方面的差异，尚需更多更严谨的研究加以澄清。

前C区G1896A突变多见于暴发性肝炎、慢性活动性肝炎、LC和HCC患者，但在无症状携带者中也可检出，其与终末期肝病的相关性目前尚未有定论，甚至有研究显示，此类突变可降低HCC发生的风险。进一步的研究需要排除基因型和BCP变异等混杂因素的影响。

其次，具有前C和（或）BCP变异的CHB患者可能是发生对某种核苷（酸）类似物耐药突变的高危人群。这是因为，这些突变可弥补一些耐药变异株在复制能力上的缺陷。体外研究表明，前C或BCP变异可增强rtA194T（替诺福韦耐药）突变株被减弱的复制能力。

BCP和前C突变检测的检测方法

目前检测BCP和前C区突变的工具既有商品化试剂，也有各个实验室自己建立的方法，主要原理是基于靶序列扩增、扩增产物杂交或直接测序。常用的商品化试剂有应用线性探针杂交技术的INNO-LiPA HBV PreCore试剂和基于聚合酶链反应（PCR）和微孔板模式的Affigene HBV Mutant VL19试剂等。

此外，PCR产物直接测序法应用也较为广泛，还有基因芯片法、寡核苷酸连接测定法（OLA）和特异性探针实时荧光PCR法等。测序法适用于检测优势毒株，杂交法及OLA法在检出小比例突变株时更为灵敏。

总之，目前人们对BCP和前C突变在HBV感染相关终末期肝病发展中的致病作用及其对抗病毒治疗的可能影响等方面的认识尚不全面和统一，因此，采用这些突变或突变组合的特点来指导临床实践的时机尚不成熟，需要更为深入和广泛的研究。期待在不远的将来，结合HBV基因型、前C和BCP突变等指标的检测，能为患者提供更优化的防治方案。



（3）HBV cccDNA检测与应用

乙型肝炎病毒cccDNA检测技术介绍乙肝病毒共价闭合环状DNA （cccDNA）的发现与检测方法的建立始于上世纪80年代，当时米勒（Miller）等采用DNA电泳及Southern 杂交检测技术，证实慢性乙肝患者肝组织内存在一种电泳带位置为2.0 kb 的HBV DNA分子，并在电镜下证实为一种约3.2 kb的超螺旋DNA分子。随着聚合酶链反应（PCR）技术的发展，相关技术开始应用于乙肝病毒cccDNA检测。目前HBV cccDNA的定量检测技术主要有以下3种。

选择性荧光定量PCR
乙肝病毒的松弛环状DNA分子（rcDNA）的正链和负链上均存在缺口，故可设计跨越两个缺口的引物，使rcDNA不会被扩增。同样，对于细胞内以双链线性DNA（dsl-DNA）或单链DNA（ssDNA）形式存在的病毒基因，由于两条引物的方向相反，也不会被扩增。而cccDNA是完整的双链环状结构，故可以被选择性扩增（见图）。

嵌合引物法

嵌合引物由两个片段连接而成，3’端的片段A与HBV DNA正链DR2区的序列互补，5’端的片段B是与HBV基因组没有同源性的一段序列。引物与正链杂交后，在DNA聚合酶的作用下进行单链延伸。对于rcDNA，由于缺口的存在，引物的延伸停止于DR2区。但如模板为cccDNA，因为正链完整，引物能够顺利延伸形成一条新生链。随后，以第一轮单链延伸形成的产物为模板进行荧光PCR扩增和定量检测。

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侵入分析法

侵入分析法的设计也是利用rcDNA正链不完整这一特征，但其使用的是侵入探针技术，而非PCR技术。该方法设计了2个探针，分别为初始探针和侵入探针，前者与正链DR2上游区域的特定序列互补，后者与正链DR2区域的特定序列互补。显而易见，只有正链完整的cccDNA分子，才能同时与两个探针互补。侵入探针的作用是切割初始探针上的一段翼DNA片段，该片段被一个荧光共振能量转移（FRET）盒接受，从而发出荧光信号，进行定量检测。

值得注意的是，上述方法均存在特异性不强的问题。如采用选择性PCR方法，在反应体系中rcDNA模板量较高时，以不完整的两条链为模板形成的单链延伸产物片段之间可以互为引物而出现自身退火，从而形成一定量的扩增产物，导致假阳性结果。而嵌合引物法和侵入分析法则可以扩增dsl-DNA，后者约占全部乙肝病毒基因组的5%-10%。因此，必须高度重视检测方法的特异性，不恰当的检测方法有可能导致错误的结论。

例如，有学者采用套式选择性PCR方法，“证实”外周血单个核细胞内存在cccDNA，显然存在放大选择性PCR“非选择性扩增”的可能。为提高检测的特异性，可采取细胞核抽提技术、沉淀法或酶切法去除rcDNA等措施，以尽可能得到较纯的cccDNA模板。

如何提高cccDNA检测的灵敏度是另一个需要解决的问题。有学者最近提出，可采用滚环扩增技术（RCA）检测cccDNA。实验结果表明，该技术可有效区分rcDNA和cccDNA。





图 HBV cccDNA 的选择性PCR
HBV cccDNA检测技术的应用

评价慢性乙肝抗病毒治疗疗效

目前考核干扰素和核苷类药物抗病毒效果的标准通常分为主要标准和次要标准。这些标准都是建立在乙肝病毒被抑制或可能被清除的间接评价指标之上，比如，病毒DNA达到不可测水平、HBeAg消失或血清转换、HBsAg消失或血清转换等。鉴于乙肝病毒cccDNA是乙肝病毒在肝细胞内复制的初始模板，而且在肝细胞内的含量相对稳定（每个细胞约5～50 拷贝），因此公认，HBV cccDNA是乙肝病毒难以被清除和停止抗病毒治疗后乙型肝炎复发的分子基础。

只有彻底清除细胞核内的cccDNA，才是真正意义上治愈了乙型肝炎，只要细胞核内的cccDNA被彻底清除，就有理由认为乙肝病毒复制的基础不复存在了。可见，考核抗乙肝病毒药物疗效的指标，或者评价抗病毒治疗的最终疗效标准，应该是清除cccDNA，其他任何指标与之相比只能是“次要”标准。有研究表明，在血清HBsAg被清除的HBV感染者中，肝细胞内仍有cccDNA存在。

清除cccDNA这一过程比较漫长，需要较高的社会、经济成本。此外，在现有条件下进行长期治疗，伴随的必然是药物不良反应的增加以及病毒耐药突变等。因此，是否把清除cccDNA作为治疗终点，还需要进行更多的研究。

筛选抗病毒药物

对抗病毒药物的不断研发，给慢性乙肝患者提供了更多治疗选择。但如前所述，目前的抗病毒药物均不能有效清除cccDNA，因此，开发新的、能清除cccDNA的药物是患者和医生共同的期待。鉴于cccDNA的形成是在细胞核内进行的，因此，能清除cccDNA的药物必须能干预细胞核内cccDNA形成。由于核苷类药物只能干预细胞浆内前基因组RNA逆转录形成病毒DNA负链和以负链为模板进行正链延伸的过程，自然就不能清除cccDNA。

遗憾的是，cccDNA分子在细胞内形成的一些关键环节，目前还不清楚或存在争论，例如：① rcDNA分子究竟是如何通过核转位从细胞浆进入肝细胞核内的？② rcDNA在细胞核内被去掉负链的末端蛋白和正链寡RNA帽是如何实现的？③
补齐rcDNA两条链的缺口，所需要的DNA聚合酶来自于病毒自身还是宿主？④ cccDNA从环状双链分子进一步折叠形成超螺旋分子，显然需要具有解旋、拓扑异构等生物学活性酶的参与，这些酶是来自病毒还是宿主？上述过程的阐明，将有助于指导开发新的、可能清除cccDNA的抗病毒药物。

评价乙肝病毒复制的模型

一种细胞或动物模型能否支持乙肝病毒复制，cccDNA显然可以作为一个较好的评价指标，因为cccDNA是病毒在细胞内进行复制的初始模板。最典型的例子是HBV转基因小鼠，尽管能检测到rcDNA 和各种病毒抗原蛋白，并且能合成大量的HBV，但在其肝细胞核内未能检测cccDNA，因此，转基因鼠不能作为乙肝病毒感染的动物模型。相反，有学者发现用HBV去感染原代培养的树肝细胞，其细胞核内存在HBV cccDNA，因此，树可能是支持HBV复制的小动物模型。

评价肝组织损伤程度

乙肝病毒cccDNA分子虽存在于肝细胞核内，但从理论上推测，如果乙肝患者变性坏死的肝细胞较多，血清中是完全有可能检测到cccDNA的，而且理论上讲，肝细胞变性坏死越严重（如肝衰竭大面积肝坏死时），外周血中检测到cccDNA的机会也应该越大。

应用于肝移植

HBV cccDNA检测技术在肝移植中的应用至少包括2个方面：即肝脏移植供者的筛查和受者HBV感染或再感染的早期发现。因不排除抗-HBc阳性供体肝脏中存在乙肝病毒可能，有学者主张对受者进行预防性抗病毒治疗，以防止受体感染或再感染HBV。笔者认为，完全可以对此类供体进行肝内cccDNA检测，如阴性则没有必要进行过度的预防性抗病毒治疗。同样，如受者原为HBV感染者，也可以定期对其肝组织进行HBV cccDNA检测，判断肝细胞内有无乙肝病毒复制，以便在血液中出现大量病毒之前早期发现HBV感染或再感染，甚至有可能指导抗病毒药物的使用疗程和乙肝免疫球蛋白剂量的调整。关于cccDNA检测技术在肝移植中的应用，还有待于进一步临床研究。

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（4）HBeAg定量检测的预测意义HBeAg蛋白的结构与功能

乙肝e抗原（HBeAg）由HBV前C区或C区编码产生，其与乙型肝炎核心抗原（HBcAg）的氨基酸序列几乎一致，但长度略长于HBcAg。HBeAg属非结构蛋白，不参与构成病毒颗粒，合成后经内质网分泌至肝细胞外，在血清中以可溶性二聚体蛋白形式存在。HBeAg的生物学功能尚未完全研究清楚，它不是病毒复制的必需成分，可能主要发挥免疫调节作用，例如，诱导T细胞产生对乙肝病毒（HBV）的免疫耐受，还可刺激Th2细胞因子分泌，并通过Fas与Fas配体（FasL）介导的机制清除Th1细胞，并引起Th1/Th2失衡，从而与HBV感染的慢性化有关。临床上，通常将血清HBeAg作为HBV复制、传染性、病情严重程度以及对治疗应答进行评价的重要标志物。

HBeAg定量检测方法

目前HBeAg检测方法主要有酶免疫法、化学发光法（如微粒子化学发光、电化学发光）等，大部分属于定性或半定量检测，定性结果表示为“阴性”或“阳性”，半定量结果以样本吸光度与临界值比值（S/CO）或临界值指数（COI）等形式表示。随着实验技术的进展，近年来出现了定量HBeAg检测试剂。根据HBeAg S/CO值或COI值在一定范围之内与HBeAg含量呈线性相关的原理，以德国保罗埃利赫研究所（PEI）提供的HBeAg参考物质制定标准曲线，从而实现HBeAg定量检测，结果以PEI U/ml表示。

HBeAg定量检测对抗病毒治疗的预测

抗病毒治疗是慢性乙型肝炎最基本的治疗，目前公认有效的抗病毒药物是干扰素类，如α干扰素和聚乙二醇干扰素α以及核苷类似物。HBeAg阳性患者抗病毒治疗的终点是HBeAg血清学转换，这可能需要长期的有效治疗。HBV DNA水平降低或低于检测水平提示抗病毒药物治疗有效，但并不一定能反映机体对HBV免疫状况的恢复，更多的可能是由于病毒被暂时抑制，特别是在应用核苷类似物出现HBV DNA降低时。因此，停用抗病毒药物后往往容易出现反弹，相比而言，在自然免疫清除或者在干扰素治疗后所出现的HBeAg血清学转换，往往标志着持续的HBV抑制，丙氨酸氨基转移酶（ALT）正常，组织炎症坏死减轻，肝硬化发生的可能性降低。因而，血清HBeAg被认为能够反映更为稳定的治疗效果，HBeAg血清学转换标志着患者免疫系统开始发挥作用。

近年已有研究报告，HBeAg定量检测是预测抗病毒疗效的潜在有效指标，如果在抗病毒治疗中定量检测HBeAg水平的变化，就有可能间接地了解机体免疫状态的变化和对抗病毒治疗的应答情况，这对于决定下一步的治疗十分重要。

HBeAg定量检测有助于预测干扰素类药物的疗效。海茵廷克（Heijtink ）等对139例接受α干扰素治疗16周或32周的慢性乙肝患者进行了治疗前、治疗期间及治疗后的血清HBeAg定量检测，多变量分析结果显示，治疗前HBeAg水平可作为16周治疗应答的预测因子，同时，前8周内HBeAg水平的变化也可预测患者治疗16周是否产生应答，若HBeAg在前8周治疗期内降低幅度小于40%，则16周干扰素治疗不会产生应答，同样，前8周HBeAg变化也与干扰素延长治疗是否有效相关。因此，每月检测HBeAg水平有助于预测α干扰素的疗效。

2008年，福瑞德（Fried）等实施了一项大型、随机、多中心Ⅲ期临床试验，对271例HBeAg阳性慢性乙肝患者进行48周的聚乙二醇干扰素α-2a治疗，治疗后继续追踪观察24周。治疗期间对血清HBeAg进行系列定量检测，发现产生血清学转换患者的血清HBeAg水平持续降低，并且在治疗结束后24周内保持最低水平，治疗24周后，在HBeAg高水平(>100 PEI U/ml)的72例患者中，只有4%（3/72例）发生了血清学转换，阴性预测值为96%，高于HBV DNA (86%)。

通过观察治疗后有无持续HBeAg水平降低，还可区分患者对聚乙二醇干扰素α-2a治疗是存在迟发应答还是无应答，而HBV DNA水平变化并不明显。由此看来，在预测干扰素类药物治疗患者是否出现血清学转换或是否出现应答方面，HBeAg动态定量具有重要作用。

在核苷类似物治疗研究中，也有类似报告。韩国釜山大学实验小组的研究表明，HBeAg定量检测不仅可预测拉米夫定治疗后的HBeAg血清学转换，还可先于病毒学突破之前预测对拉米夫定耐药，但该结论尚须进一步验证。

HBeAg定量检测的局限性

由于HBeAg定量检测技术是近几年发展起来的技术，有关HBeAg定量的临床资料还较少。总体看，血清HBeAg水平与HBV DNA载量有相关性，但相关性较弱（相关系数r为0.41-0.51），HBeAg水平与cccDNA相关性亦较弱，而HBV DNA与cccDNA呈强相关（r =0.81）。原因之一在于，慢性乙肝患者体内HBV准株中存在核心区启动子(BCP)或前C区(PC)变异，从而造成HBeAg表达减少或缺失，虽然其血清HBeAg水平低，甚至为阴性，但并不能准确反映病情进展程度及预后。因此在采用HBeAg定量检测作为预测治疗效果的指标时，建议同时进行BCP或PC区的序列检测。此外，HBeAg定量检测也不适用于HBeAg阴性的慢性乙肝患者。

从方法学上讲，相比HBV DNA 聚合酶链反应（PCR）定量检测，HBeAg检测操作相对简单，耗时短，成本低，易于实现自动化，不同检测方法之间差异较小（定性检测的符合率可达98%以上），但是，HBeAg定量方法学尚不成熟，目前还仅局限于科研领域，尚未推广到临床。

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（5）HBV 耐药相关变异的诊断与监测

目前国内批准用于治疗慢性乙型肝炎的药物已从一种普通干扰素增加到包括聚乙二醇干扰素、拉米夫定、阿德福韦酯、恩替卡韦、替比夫定在内的6种药物。尽管与干扰素相比，核苷（酸）类药物服用方便、副作用少，但需要长期应用且往往伴有病毒耐药风险的增加。HBV耐药及患者依从性差是导致乙型肝炎治疗失败的两个最重要原因，因此，有必要加强对HBV耐药相关变异的诊断与监测，以期最大程度地预防和减少耐药的发生。

HBV 耐药相关的定义及其临床意义

在2006年美国国立卫生研究院（NIH）的HBV工作会议上，学者们提出了对抗病毒治疗应答的标准定义。

初治无应答

初治无应答是指核苷（酸）类药物治疗6个月后，患者血清HBV DNA水平较基线下降小于1 log10 IU/ml。初治无应答可能与宿主、病毒以及药物因素有关。研究证明，治疗6～12个月后HBV DNA水平较高与病毒耐药的发生呈正相关。

病毒学突破

病毒学突破往往伴随着病毒耐药的出现，其定义为：在患者依从性良好且初治有效的情况下，连续2次相隔1个月以上的样本检测中，血清HBV DNA 水平较治疗过程中的最低点升高大于或等于1 log10 IU/ml。对伴随氨基转移酶升高的患者来说，无须证实第2次样本中血清HBV DNA水平升高。

与野生株相比，大多数HBV耐药变异株复制能力下降，所以发生病毒耐药初期，耐药HBV DNA水平比较低，但如果维持原有治疗，随着HBV代偿性变异的出现和累积，病毒的复制能力得以恢复，从而导致病毒学反弹，HBV DNA水平将会逐步增高，甚至超过治疗前的水平。

生化学突破

生化学突破是指患者获得初始应答，氨基转移酶正常后继续治疗，氨基转移酶再次升高。血清氨基转移酶可能在发生病毒学突破数周或数年后仍保持正常，生化学突破也可与病毒学反弹同时出现，某些病例出现氨基转移酶水平明显上升，提示病情恶化。

HBV耐药相关变异的诊断

HBV耐药相关变异的确定需要依靠实验室诊断。基因型耐药是指在药物靶基因（即HBV聚合酶基因）上出现特定的核苷酸以及相对应的氨基酸突变，且这种突变已被证明与病毒耐药有关。

理想状态下，为了鉴定潜在的基因型耐药，在发生病毒学突破时分离提取的HBV DNA序列及其推导的氨基酸序列应该与患者治疗前标本的序列相对比。当治疗前标本无法获得时，也可以与已经证实的同一基因型的HBV序列比较。

基因型耐药的确定基于两个方法即体外表型分析和虚拟表型分析，前者是确定基因型耐药的金标准，但需要消耗大量人力、物力和时间，后者是研究患者治疗及应答资料与HBV序列数据间相关性的一种方法，将受检表型与库中数据对比，可找到最相符的数据和最可能发生的治疗应答。

图
与核苷(酸)类似物耐药相关的乙型肝炎病毒变异位点

检测基因型耐药突变的方法

鉴定耐药突变的可用方法包括聚合酶链反应（PCR）产物的直接测序、PCR扩增产物的多重克隆序列分析、特异性探针实时PCR法、线性探针杂交法、限制性片段长度多态性(RFLP)以及最近开始应用的基质辅助激光解吸附电离飞行时间质谱测定法(MALDI-TOF MS)。MALDI-TOF MS法基于限制性酶切片段质量多态性(RFMP)，能检出在病毒准种中含量小于1％的突变株。

敏感的检测法能测定出在整个病毒准种中仅占5％～10％的编码耐药突变株的HBV DNA，从而能在患者发生病毒学突破时或更早时段确定基因型耐药的出现。虽然超敏测定法能检测出在病毒总体中含量低于1％的突变株，但它对于预测耐药发生的实际意义还不确定。目前，临床实践中最常用的方法包括直接测序法和线性探针测定法。

对HBV耐药的监测

对所有接受核苷（酸）类药物治疗的慢性乙型肝炎患者，治疗期间都应密切监测病毒学应答与突破，停药以后也应监测应答持续和病情复发情况。治疗开始前应该检测血清HBV DNA，治疗过程中至少每3个月检测1次。

对初治无应答的患者，应考虑替换治疗以获得临床应答，尽可能减少后续耐药。对发生病毒学突破的患者，应考虑其依从性，同时尽可能进行病毒耐药突变的检测，以确定基因型耐药的存在和病毒耐药突变的模式。目前越来越多的患者接受一种以上药物治疗，对病毒耐药突变的检测显得尤其重要。

对HBV耐药患者的治疗依赖于既往治疗史和既往疗法应答情况、病毒学突破时检测到的突变模式以及耐药突变株对不同药物敏感性的体外试验资料。最近的研究显示，与发生病毒学反弹和生化学反弹后应用补救治疗相比，在发生病毒学突破时就开始补救治疗更有效。

随着越来越多治疗方法的出现，耐药突变更加复杂，初始和补救治疗的选择也逐渐增加。因此，应该进一步规范耐药的检测方法，加强对耐药的监测，以期最大程度地预防和减少耐药的发生，提高抗病毒治疗疗效。

爱妻大元帅

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