肝脏免疫学研究进展

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来源：AASLD2008专题报道
作者：严伟明 宁琴
华中科技大学同济医学院附属同济医院研究所
发布时间：2008-12-26

文章导读：一年一度的全球肝病领域大规模盛会——美国肝脏疾病研究学会年会(AASLD)，今年于10月31日~11月4日在美国旧金山市举行。在紧张的5天会期中，来自世界55个国家和地区的8000多名知名专家共同分享了肝病领域前沿研究、治疗建议和治疗新趋势。作为研究热点，肝脏免疫学的交流内容极其丰富，几乎包括了天然免疫和特异性免疫的所有领域和分支，涉及到巨噬细胞、Toll样受体、NK细胞、NKT细胞、补体系统、细胞因子、T细胞、调节性T细胞等，专题讲座及壁报交流共计20余篇，本文即就相关内容做一综述，可望为肝脏免疫学基础应用研究的开展提供新思路。
   

     一年一度的全球肝病领域大规模盛会——美国肝脏疾病研究学会年会(AASLD)，今年于10月31日~11月4日在美国旧金山市举行。在紧张的5天会期中，来自世界55个国家和地区的8000多名知名专家共同分享了肝病领域前沿研究、治疗建议和治疗新趋势。作为研究热点，肝脏免疫学的交流内容极其丰富，几乎包括了天然免疫和特异性免疫的所有领域和分支，涉及到巨噬细胞、Toll样受体、NK细胞、NKT细胞、补体系统、细胞因子、T细胞、调节性T细胞等，专题讲座及壁报交流共计20余篇，本文即就相关内容做一综述，可望为肝脏免疫学基础应用研究的开展提供新思路。

    1. 巨噬细胞与Toll样受体

    美国罗切斯特 Travis J. McKenzie等探讨了巨噬细胞与TLR4在GalN/LPS诱导的小鼠急性肝衰竭中的作用。GalN/LPS腹腔注射可导致C3H/HeN小鼠发生急性肝衰竭，免疫组织化学证实氯化钆(IP)可使C3H/HeN小鼠体内的巨噬细胞减少53%，对C3H/HeN小鼠用IP预先处理后再行GalN/LPS腹腔注射发现，与未经IP处理的小鼠相比，前者血清ALT水平锐减。提示巨噬细胞在GalN/LPS诱导的急性肝衰竭中起到了重要作用。

    C3H/HeJ小鼠为TLR4功能缺陷的TLR突变小鼠，对C3H/HeJ小鼠腹腔注射GalN/LPS后，与C3H/HeN小鼠发生急性肝衰竭形成鲜明的对比，C3H/HeJ小鼠未表现出明显的临床症状，其血清 ALT水平大大降低（125 vs 2458U/L，正常值7-55U/L），肝脏组织学形态基本正常，肝细胞凋亡的数量也有所减少（TUNEL法）。提示TLR4是GalN/LPS诱导的肝细胞凋亡过程中的一个重要受体。

    IL-1?与IL-18水平的上调是对乙酰氨基酚（APAP)诱导的肝脏无菌性炎症发生的必备因素，而TLR-7的激活也可以上调IL-1?的水平。美国纽黑文Azuma Watanabe等将APAP同时作用于野生型及TLR-7基因敲除小鼠，研究发现与野生型小鼠相比，TLR-7基因敲除小鼠血清ALT水平升高的幅度显著降低， IL-1?和IL-18 mRNA水平升高的幅度显著降低（IL-1?：4.7倍 vs 10.2倍，P<0.04；IL-18：2.7倍 vs 4.7倍，P<0.01)，肝脏炎性坏死与出血区域明显减少，小鼠72h生存率显著提高（77% vs 20%，P<0.03）。提示TLR7可通过上调IL-1?和IL-18，进而激活无菌性炎症反应，在APAP诱导的药物性肝损伤中发挥重要作用。

    2. NK细胞

    美国贝塞斯达Golo Ahlenstiel等观察了NK细胞的活性与功能对于HCV感染疾病进程的影响，提出内源性IFN-α的慢性刺激可导致NK细胞活性与功能的变化，并与肝脏炎症反应程度相关联。NK细胞活化研究表明，从健康对照到ALT水平正常（<41U/ml）的HCV患者再到ALT水平升高的HCV患者，其NK细胞活性逐渐增强。NK细胞细胞毒功能研究发现，ALT升高的HCV患者其NK细胞脱粒水平显著高于ALT正常的HCV患者及健康对照，但各组间NK细胞IFN-γ分泌水平无差异。提示NK细胞细胞毒活性的增强归因于其脱颗粒效应，而与IFN-γ介导的抗病毒作用无关。

    中国武汉Yong Zou等系统探讨了肝脏NK细胞在MHV-3诱导的小鼠暴发型肝炎发生发展中的作用。该研究发现，MHV-3感染后48h，NK细胞在肝脏大量募集并活化，胞内细胞因子IFN-γ与TNF-α分泌水平显著增加。进一步体外细胞毒试验证实高度活化的肝脏NK细胞能够杀伤MHV-3感染的肝细胞，但该效应可被anti-FasL与anti-NKG2D单克隆抗体阻断。以上研究提示在MHV-3诱导的小鼠暴发型肝炎模型中，肝脏NK细胞可通过促进Fas-FasL与NKG2D -NKG2DL途径在肝细胞坏死的发生中发挥重要作用。

    3. NKT细胞

    天然β糖脂类可通过酰基链依赖的途径调节NKT细胞的活性。ALIB-97是一个新的β糖脂类似物，它的特征是具有一个大的酰基残端。耶路撒冷Tomer Adar等运用ALIB-97对ConA诱导的小鼠急性肝损伤进行治疗，同时设立地塞米松、天然糖脂类作为对照。研究发现给药后， ALIB-97显示出与地塞米松相似的强大抗炎效应，小鼠血清IFN-γ、AST和ALT水平均下降了50%。小鼠肝脏、脾脏NKT细胞的比例分别下降了60%和75%，IL-6水平亦下降了80%，同时STAT4的表达下降。进一步利用J-α-18 基因敲除小鼠(I型NKT细胞缺乏)和CD1d 基因敲除小鼠进行深入机制研究发现，ALIB-97在上述两种小鼠中不能有效降低肝酶水平及STAT4的表达水平。以上研究提示，ALIB-97可通过抑制1型NKT细胞和STAT4的表达来改善ConA诱导的急性肝损伤，作为一种新型的以肝脏为靶向的与甾体等效的有效抗炎剂，ALIB-97可能在多种NKT细胞介导的肝脏免疫损伤中发挥作用。

    4. 补体系统

    来自美国克里夫兰的Sanjoy Roychowdhury等利用小鼠模型系统探讨了酒精暴露早期宿主补体系统活性与肝损伤发生间的关系。该研究组观察到C57BL/6小鼠在酒精暴露4d之内出现了一个明显的促炎症细胞因子表达高峰，包括TNF-α，IL-6及IFN-γ。这些细胞因子水平的上调与肝脏中补体活化产物C3b-iC3b/C3c的积累发生相一致。C3b-iC3b/C3c的积累来源于补体C3的酶解，是酒精暴露激活补体级联反应的证据。进一步研究发现C3-/-小鼠、C3αR-/-小鼠及C5αR-/-的小鼠在给予酒精饮食早期其肝脏中TNF-α表达未增加，提示早期酒精诱导的肝脏炎性细胞因子的上调需要补体的激活以及C3α和C5α的产生。综上所述，酒精诱导的肝损伤进程中存在一个补体依赖的阶段，该阶段是早期肝脏TNF-α的产生所必需的。

    5. 细胞因子及受体

    已有研究表明， IL-17具有募集中性粒细胞的功能。比利时布鲁塞尔Arnaud Lemmers等系统探讨了IL-17通路在酒精性肝病中的作用。研究发现，与健康对照相比，酒精性肝病患者血浆IL-17水平明显升高，外周血分泌IL-17的CD4+T淋巴细胞比例明显升高，PBMC经PHA刺激后IL-17分泌细胞的比例也明显增加。组织学研究发现酒精性肝病患者肝组织中有大量IL-17表达阳性的细胞，包括T淋巴细胞和中性粒细胞，造成了肝脏组织的炎性浸润。以上研究提示，IL-17通路的活化是酒精性肝病的一个重要特征，IL-17阳性表达细胞的浸润及其诱导的中性粒细胞的募集是酒精性肝病患者肝脏炎症反应的重要表现。

    英国伦敦Charalambos G. Antoniades等评价了急性肝衰竭患者外周血/肝脏促炎症细胞因子（TNFα）与抗炎症细胞因子（IL-10）的水平。研究发现，与代偿期肝硬化患者相比，急性肝衰竭患者表现出更高的血清TNFα水平和IL-10水平，但其外周血HLA-DR阳性的单核细胞比例和绝对计数均下降。急性肝衰竭患者肝脏IL-10 mRNA水平显著高于TNFα。对急性肝衰竭患者PBMC用一组记忆性抗原进行体外刺激后发现，分泌IL-10的PBMC比例明显增加，而分泌IFNγ及TNFα的PBMC比例无明显变化。以上研究提示，IL-10水平在急性肝衰竭患者中的显著上调可对记忆性抗原产生反应并下调单核细胞HLA-DR的表达。这种特征性的IL-10反应可能是急性肝衰竭患者免疫麻痹和后续败血症发生的原因所在，因此对于IL-10反应的调控将是急性肝衰竭治疗的一个关键环节。

    慢性肝病患者对内毒素性并发症具有较高的易感性。Gp130是IL-6家族细胞因子的共同受体，在肝脏病理生理过程中发挥重要的功能。德国亚琛Leif E. Sander等利用基因敲除小鼠（gp130?hepa)靶向清除肝细胞内的gp130来研究gp130途径在败血症中的作用。gp130Stat?hepa或者gp130Ras?hepa小鼠为相应的肝细胞特异性gp130/JAK-STAT3或gp130/Ras-MAPK信号途径缺陷的模型。研究发现，利用CLP制备小鼠败血症模型后，gp130S?hepa和gp130Stat?hepa小鼠的死亡率明显提高，其血清IL-6,TNF和IFNγ水平也明显上升。但所有小鼠的腹腔、血液，脾脏和肝脏中均有细菌入侵，提示肝脏gp130/STAT3途径在感染过程中的作用是控制炎症反应，而非清除细菌。另一项FACS分析结果表明， gp130?hepa小鼠在CLP作用过程中其脾脏与肝脏不能成功积聚具有免疫抑制能力的CD11b+Gr1+细胞，这些细胞的缺失将上调炎性细胞因子的水平及CLP的死亡率。综上所述，该研究阐明了细菌感染/内毒素血症过程中依赖于gp130/STAT3信号途径的肝脏免疫调节作用，同时证明了gp130是败血症中CD11b+Gr1+骨髓衍生抑制性细胞扩增所必需的因子。

    固有免疫防御和α、β干扰素反应是机体抗病毒免疫反应的第一道防线。宿主的病原识别受体（PRRs）与病毒的病原相关分子模式(PAMPs)相互作用是激活固有免疫的最为直接的方式。其中细胞维甲酸诱导的基因-1（RIG-1）解旋酶所激发固有免疫反应即在急性HCV感染的控制中发挥重要作用。美国皮斯卡塔韦Takeshi Saito等利用RIG-1基因敲除小鼠在HCV基因组3’端非编码区鉴别出了RIG-1 PAMP 基序，研究结果表明，除了5’PPP外，有效的PAMP-RIG-1相互作用还需要pU或pA结构，RIG-1与之结合后可显著激活IFN-β启动子，触发肝脏的固有免疫防御。该研究对于鉴定其他RNA病毒基因组内RIG-1的PAMP底物具有借鉴意义。

    美国皮斯卡塔韦 Ahmed Lasfar等发现了一种新的具有抗肿瘤作用的干扰素，称为IFNλ。研究者利用基因治疗的途径比较了IFNα与IFNλ应用于小鼠肝细胞肝癌（HCC）模型后的抗肿瘤效应。结果表明，任何一种干扰素的单独使用均能通过相似的途径抑制肿瘤细胞的增长，但所有的小鼠最终死亡。如果注射同时表达两种干扰素的肿瘤细胞，小鼠则八周内均无肿瘤的发生。进一步研究者通过外科手术将荷瘤小鼠部分肿瘤切除后再联合或单用外源性的IFNα与IFNλ治疗2周。5周后发现，经联合治疗的小鼠其肿瘤均获得了完全清除，单用一种干扰素治疗的小鼠则仅获得部分抗肿瘤效应。该研究数据表明IFNα与IFNλ的联合应用为HCC的治疗提供了可能的新途径。

    6. T细胞

    随着HBV DNA检测敏感性的提高，献血人群中隐匿性HBV感染者（OBI）（HBsAg阴性，HBV DNA阳性，anti-HBc阳性，anti-HBc-IgM阴性）的检出率也大大增加。西班牙巴塞罗那Marta Bes等评价了OBI人群对于HBV重组抗原的细胞免疫反应。研究结果表明，与非活动性HBV携带对照组相比，OBI人群组针对HBV重组抗原产生了更为强烈的细胞免疫反应，表现为其PBMC体外接受HBV重组抗原（HBsAg，HBcAg，HBeAg）刺激后，分泌IFNγ的细胞比例显著增加。阴性健康对照组IFNγ分泌细胞的水平类似于非活动性HBV携带对照组，HBV疫苗接种对照组对于HBsAg的反应性类似于OBI组，对于HBcAg的反应性则远远低于OBI组。综上所述，OBI人群对于HBV重组抗原的细胞免疫反应并未减弱，且呈现多重特异性的Th1优势平衡。但是尽管拥有这种抗HBV的细胞免疫反应，OBI宿主体内仍然长期存在较低水平的HBV DNA复制。

    Glypican 3（GPC-3）是一种调控生长因子及其受体间相互作用的癌胚蛋白，用载有GPC-3 多肽的树突状细胞免疫BALA/c小鼠可抑制GPC-3阳性肿瘤的生长，提示GPC-3可作为一种肿瘤相关抗原。英国伦敦James O’Beirne等自体外PBMC分离树突状细胞，电穿孔方法转染GPC-3 mRNA表达载体，LPS刺激促进其成熟。胞内细胞染色发现该树突状细胞有大量表达GPC-3，并能在体外促进同系PBMC中产生功能性分泌IFNγ的CTL细胞。研究者进一步用标准f- moc 技术模拟合成6个与HLA-A2结合的多肽表位并进行体外实验，发现肽链522-530 FLAELAYDL可满足自然呈递的HLA-A2 限制性CTL表位的标准。该研究为进一步评估抗GPC-3 T细胞反应对于GPC-3依赖的肿瘤（如HCC）的治疗应用提供了基础和依据。

    在肠道经树突状细胞启动的淋巴细胞可表达肠道归巢受体CCR9 和α4β7，后者能够识别肠道相应配体CCL25和MADCAM-1。在小鼠这一过程依赖于维甲酸并且受可塑性影响以允许T细胞的发育以便在不同解剖部位对抗原发生反应。这一组织特异性在人类原发性胆管炎（PSC，一种肠道感染性疾病的肠道外表现）中消失，该类患者肝脏异位表达的MADCAM-1和CCL25促进了CCR9和α4β7+T细胞向肝脏的募集。加拿大卡尔加里Bertus Eksteen等通过大量体外研究证实，只有PSC患者肠道来源的树突状细胞才能够激活表达CCR9和α4β7的CD8+T细胞，肝脏或肝门淋巴结来源的树突状细胞不具备此功能，同时这一过程也依赖于维甲酸的存在并具有可塑性。该研究提示PSC患者肝脏浸润的α4β7+ CCR9+T细胞由肠道激发而来，也为肠道来源的淋巴细胞在PSC患者肝脏炎症中的作用提供了进一步的证据。

    7. 调节性T细胞

    德国汉堡Stefan Lüth等报道在体内可利用肝脏促进免疫耐受的能力来获得调节性T细胞（Treg）介导的对于自身免疫性疾病的控制作用。该研究通过神经自身抗原髓磷脂碱性蛋白（MBP）转基因小鼠或体内MBP基因瞬时转染使MBP在肝脏中异位表达，进而通过MBP特异性的CD4+CD25+Foxp3Treg细胞获得对于人多发性肝硬化小鼠模型诱导自身免疫性神经炎的免疫保护。研究者将CFSE标记的原始非调节性MBP特异性CD4+CD25-CD62Lhigh T细胞（＞99%，Foxp3-）转移到肝脏中表达MBP的小鼠或野生型的小鼠体内。七天以后，将CPSE+T从小鼠体内收回后进行Foxp3表达的分析或者进一步转移到非转基因小鼠中。结果表明转移到野生型小鼠中的CPSE+CD4+CD25-CD62Lhigh T细胞，未能获得Foxp3的表达，亦不能免于自身免疫性神经炎的发生。相反，转移到肝脏中能表达MBP的小鼠体内的CPSE+CD4+CD25-CD62Lhigh T细胞，获得了表达Foxp3的能力，而且保护相应的小鼠免于自身免疫性神经炎的发生。这种由非Treg向Treg的转变是TGFβ依赖性的，因为TGFβ信号传导损伤的T细胞不能转变成Treg。综上所述，肝脏自身抗原的表达可产生自身抗原特异性的Treg细胞，从而为自身免疫疾病治疗新方法的探讨提供了新的思路。

    尽管目前已经在人类肝脏中检测出Treg的存在，但对于Treg在肝组织中募集和驻留的分子基础还了解甚少。英国伯明翰Ye H. Oo等研究发现，与外周血Treg相比，肝脏浸润Treg（LITreg）表达相似水平的Foxp3、CTLA-4和CD127，但表达更高水平的CD27。体外分离的LITreg能抑制肝脏树突状细胞刺激的原始T细胞的增殖。此外，与外周血Treg相比，LITreg表达更高水平的β1、β2整合素和趋化因子受体CXCR3和CCR4。在流黏附测定中，LITreg需要α4β1和CXCR3方能黏附和迁移至窦状内皮细胞。CCR4并未参与上述迁移过程，但可促进LITreg对源于肝脏树突状细胞的CCL22作出应答。综上所述，该研究定义了一群表达特异性趋化因子受体的抑制性LITreg细胞，该细胞上CXCR3表达的上调是LITreg募集到肝脏的关键因素，而CCR4表达的上调则利于LITreg与肝组织树突状细胞间的对话。

    中国武汉Weiming Yan等利用MHV-3感染C3H小鼠成功建立了一种慢性病毒性肝炎小鼠模型，FACS分析表明该小鼠模型在病毒感染后其外周血、肝脏、脾脏中有一群DNT（CD3+CD4-CD8-T）细胞的比例大幅增加，该群细胞具有全新的表型（TCRαβ+ CD4-CD8-CD25-CD28-CD30-CD44-），胞内细胞因子仅表达少量IL-2和IFNγ，而不表达IL-4，IL-10，TNFα及FoxP3。功能学研究表明，该DNT细胞可通过Fas-FasL而非穿孔素/颗粒酶途径对CD8+T细胞发挥病毒特异性的杀伤作用。综上所述，该研究首次在MHV-3诱导的慢性肝炎小鼠模型中鉴定了一群全新的DNT细胞亚群，后者可通过Fas-FasL途径对CD8+T细胞发挥病毒特异性的负性调节作用，进而促进了病毒感染的慢性迁延。

    LAP是TGF-β先驱多肽链上的氨基末端位点，与TGF-β间呈非共价结合状态。膜结合型LAP在Treg上的出现与后者发挥的免疫调节功能相关。耶路撒冷Meir Mizrahi等以不同类型的β鞘糖脂为佐剂，包括β葡糖苷酰鞘氨醇（GC）、β乳糖酶基鞘氨醇（LC），及两者混合物（IGL）,与HBV疫苗一起分别通过口服（PO），腹腔（IP），直肠（IR）及鼻腔（IN）途径对小鼠进行接种，观察小鼠的抗HBV反应及Treg细胞的产生情况。研究结果表明，以GC为佐剂、口服途径接种HBV疫苗的小鼠其脾脏来源的CD4+LAP+淋巴细胞的数量增加了5倍，抗HBV抗体滴度增加了3倍。同时脾脏CD4+LAP+淋巴细胞与抗HBV抗体滴度增加的幅度与接种的途径相关，同样以GC为佐剂，经过PO、IP、IN途径接种的小鼠其脾脏CD4+LAP+淋巴细胞比例与抗HBV抗体滴度远远高于IR途径接种的小鼠。肝脏来源的CD4+LAP+淋巴细胞的增加主要发生于以GC为佐剂、IP途径接种的小鼠。综上所述，CD4+LAP+淋巴细胞是一群全新的调节性T细胞，在增强HBV抗病毒免疫中发挥重要作用，适宜佐剂与HBV疫苗的联合免疫辅以恰当的接种途径可以促进该群细胞的产生，从而为以抗病毒免疫为基础的治疗研发提供了新的工具。

    8. 天然免疫及特异性免疫反应与肝内cccDNA 的转录活性

    目前调节HBV cccDNA转录活性（TA）的因素尚未明了。体外细胞培养模型研究表明，G1896A(PC)突变、A1762T/G1764A(BCP)突变与HBeAg（－）慢性乙型肝炎（CHB）患者上调的cccDNA TA水平有关。然而体内分子生物学研究则表明 HBeAg（－）CHB患者的TA水平要低于HBeAg（＋）CHB患者，可能与宿主的免疫学反应有关。澳大利亚墨尔本Alex J. Thompson等通过比较 HBeAg（－）CHB患者与HBeAg（＋）CHB患者，探讨了宿主天然免疫及特异性免疫反应与肝内cccDNA TA水平间的关系。与HBeAg（＋）CHB患者相比，HBeAg（－）CHB患者表现出较低的血清HBV DNA水平（-4log），肝脏cccDNA水平（-1log）及TA水平（-2log）（P<0.05）。免疫学研究表明，HBeAg（－）CHB患者CD14+单核细胞、肝实质细胞及Kuffer细胞上TLR2的表达均上调，肝脏而非外周血分泌IL-10的HBV特异性CD8+T细胞减少。该研究首次直接探讨了肝脏HBV转录活性与宿主免疫反应间的关系。HBeAg（－）CHB患者体内低水平的cccDNA 与TA水平直接降低了机体的病毒载量。HBeAg（－）CHB患者肝脏中TLR2表达的上调提示了宿主天然免疫反应的增强，而具有调节功能的HBV特异性分泌IL-10的CD8+T细胞的减少则与更加活跃的特异性免疫反应相一致。综上所述，机体天然免疫反应与特异性免疫反应在HBV转录活性的调节中发挥重要作用。

charisma

先顶了再看，辛苦了

希望19

都是美国的。

614

中国的学者照样改改,不就成了他们的学术论文了?
哈哈...................