3

xzhbjgz

1.5  转运与组织靶向性  哺乳动物细胞对核酸类药物的摄取率较低，通常会通过附加载体或进行某种化学修饰以促进其进入细胞内。例如，许多反义复合物采用阳离子脂质体作为载体，通过网格蛋白介导的内吞作用进入细胞后，遇到带负电荷的磷脂酰丝氨酸（PS）脂质会释放出来。带正电荷的脂质体不仅能将带负电荷的AODNs包裹住更有利于其透过细胞膜。人们也发明了多种不同的脂质载体，如PH敏感的促溶脂质体，在内涵体酸性环境下会选择性释放其内容物，商品化的转染剂也可以使用，但是这些载体基本都是在培养的细胞上具有良好的转运功能，运用到体内时，在足够数量的有效成份到达靶器官前可能就有大部成被血液循环清除掉。而脂质体包含PS会介导AODN进入细胞内再释放，肝脏吞噬细胞是唯一可能的清除途径，PS悬挂于凋亡细胞的外膜，显示出在正常状态下正行使它的清除功能。

一些多聚体可大规模生产，并有可控制的极性构象，因此也可用来转运AODN。聚酰胺及含胺、亚胺的多聚体具有多个回旋状看似树突样的结构，因此称为突状聚体（dendrimers）。突状聚体与核酸结合后能形成更小更稳定的复合体。在酸性内涵体中，胺基结合质子后带正电引起渗透性改变和水解，AODNs与其解离进入细胞浆。这一转运系统也主要是经过培养细胞的验证，尚无体内实验结果。

如何使反义核酸或其衍生物选择性进入靶器官或组织，一直是将其应用于临床治疗的难题。高选择性可降低非靶部位的毒副作用，也可在药物降解或代谢掉之前以足够的浓度及时到达作用靶点，因此这一点很重要。脂质体和突状载体只是非特异性地增加了药物的摄取率，截至目前为止，临床试验应用的都是非特异转运方法。

一些组织细胞表面特异表达独有受体或富集某种受体，将AODN转运载体与这一受体配体相连有助于解决这一难题。其特异性识别、结合、摄取过程有利于反义核酸的局部效应。多聚－L－赖氨酸、脂质体和其他一些核酸结构可以作为中间体将反义核酸与靶细胞表面受体配体连接起来。例如，肝源性肝细胞表面大量表达无唾液酸糖蛋白受体，抗乙肝病毒反义核酸通过多聚－L－赖氨酸与非唾液血清类粘蛋白连接可以特异性抑制乙肝病毒复制。这一策略同样适用于肿瘤的治疗，与静止期细胞相比，肿瘤细胞的生长需要更多的叶酸，其表面高表达叶酸盐受体，将叶酸配体与转运癌基因靶向的AODNs载体相连就可以增加治疗的特异性。

Packaging PNA(pRNA) 是一种新型的天然生物载体，它是从枯草杆菌噬菌体Φ29前衣壳上分离出的小双链RNA分子，其六聚体形式在噬菌体复制时起包裹基因组至外壳内的作用。pRNA的双链结构可以保护效应分子不被核酸外切酶降解，同时提高了反义药物的作用效果。使用pRNA载体携带抗HBV锤头状核酶在体外可提高其转运。pRNA能形成二聚体、三聚体、六聚体，每个pRNA分子都可以携带ODN和细胞表面受体的配体，因此不仅可以提高ODN的效率还能增强其靶向性。Guo等人观察与叶酸相连pRNA多聚体可以与表达叶酸盐受体的HeLa和KB肿瘤细胞特异结合。携带siRNA的 pRNA二聚体可经受体介导的内化作用进入细胞内， 经dicer 酶切开后可使其靶基因沉默。

抗病毒治疗时，pRNA可以携带病毒衣壳蛋白受体的配体或针对病毒感染靶器官而设计所携带配体，如前所述HBV感染针对肝细胞，CVB3感染针对心肌细胞。pRNA作为新一代基因转移载体，应用其多聚体形式或其衍生的小分子复合物增强AODNs效应性和靶向性可能是未来研究的方向。

1.6副作用及毒性  尽管体外试验结果显示反义核酸或与其载体形成的复合物细胞毒性并不大，但不能简单认为同等剂量在生物体内具有很好耐受性。临床试验应用的AODNs大多数为PSODNs，有关毒性结果大多来源于此，少数关于其他复合物如PMOs的试验显示具有良好耐受性，产生的多为靶基因敲除后的不良反  应。反义寡核苷酸经硫代修饰后，其毒性试验结果不一，一些研究结果提示具有多种副作用。

全身用药的可能副作用有高血糖、血小板计数下降、活化部分凝血酶原时间延长。这些副作用与硫代修饰有关而不依赖于寡核苷酸序列，但其发生机制却不很清楚，可能与AODNs与前凝血因子的结合有关。带阴性电荷的AODN可与带阳性电荷的氨基酸残基结合，AODN－蛋白之间的这种相互作用或称为适体相互作用可引起生物功能丧失，非特异结合也可以发生在细胞内，引起细胞内生化平衡改变。可与AODN相互作用的有DNA多聚酶、RNAH/L酶、逆转录酶、蛋白激酶C和各种生长因子。另外，AODNs还可激活宿主免疫系统，特别是激活补体级联反应。

原核生物中常见的非甲基化CPG基序在真核生物中很少，脊椎动物中取而代之的是甲基化CPG，非甲基化CPG基序可刺激B淋巴细胞增殖引起免疫反应，因此含有这样CPG基序的AODNs可以引起类似的B细胞增殖和免疫球蛋白分泌。这种非特异免疫反应在病毒感染时并无特异性，其结果有时难以预料和控制，针对病毒免疫刺激的特异CPG AODNs收效也很复杂。

2. 小干扰RNA  siRNA是短的、双链RNA（dsRNA）分子，可以与特异序列的mRNA结合通过细胞内RNA干扰过程（RNAi）降解靶基因。Fire和其同事首先发现给华丽线虫注射长dsRNA可产生特异基因沉默，此后大量研究阐明dsRNAs可以被裂解为siRNA而产生基因沉默，而化学合成的siRNA也可以降解同源RNAs。这一发现为基因功能研究和许多疾病的治疗提供了有利的实验工具。

2.1 序列和设计策略  开始RNAi实验的第一步是设计有效的siRNAs，最初的设计原则是建立在许多靶基因分析的基础之上，后来发现按此原则设计的不同siRNAs沉默效应有差异。Schwarz等人发现siRNA的同义链和反义链整合入RNA诱导的沉默复合体的几率并非相同，两条链5’端碱基对的热稳定性决定那条链被优先选择。此后，分析180个针对两个基因的siRNAs鉴定出8个决定siRNA效率的因素，如低C/G含量、缺乏内部重复序列、5’端富A/U等，综合考虑这些因素提高了RNA选择的有效性。另外，最佳siRNA序列还受许多因素的影响，如siRNAs末端G/C含量、siRNA内部Tm值、siRNA长度、靶序列在编码基因的位置、3’端突出部分的核苷酸序列等。基于这些发现的设计规则提高了siRNA设计的成功性。

除了siRNA序列的特征，最近报道关于局部自由能和siRNA效率的分析结果提示mRNA靶位的二级空间结构会影响siRNA效率，如靶位局部含有不同的发夹样结构会显著降低基因沉默效率。mRNA结构的生物信息分析显示靶部位自由能与基因敲除程度有直接关系，因为局部自由能偏低会形成许多未配对核苷酸的开放区域。因此计算mRNA的二级结构和自由能也应考虑进siRNAs设计原则之内。

siRNA的序列特异性也很重要，单核苷酸的错配，特别是发生在双链中间部位的错配即足以使其在哺乳动物细胞内失活。我们的研究中也发现，针对CVB3蛋白酶2A的siRNA内部单碱基突变可使其抗病毒活性完全丧失。关于单核苷酸选择的研究还观察到siRNA对反义链3’端突变耐受性较好，5’端突变耐受较差。进一步对siRNA序列结构的功能分析发现细胞内mRNA和siRNA的反义链完全互补，才能实现RNAi，siRNAs同义链突变不会使其基因沉默功能丧失。对一些正负单股RNA病毒的研究发现，siRNA的靶基因为正链或mRNA。

2.2  siRNA的化学修饰  siRNA的基因沉默效率还依赖于它的稳定性。未修饰的双链RNA比单链RNA更稳定，使用化学修饰的碱基合成siRNA可进一步提高其稳定性和延长其抑制效应。广泛使用的化学修饰通常为核糖的2’位置，包括2’－O－甲基核糖、2’－O－丙烯基核糖、2’－脱氧尿苷、2’－氟2’脱氧尿苷、2’－氟2’－脱氧胞苷酸等。同义和／或反义链2’核糖位置完全替代的的siRNA分子不能诱导RNAi，然而3’突出部分或碱基配对部位的2’核糖修饰增强其在血浆中的稳定性同时不丧失活性。另一个常被修饰的是主链部分。有几项研究提示具有磷硫酰主链的siRNAs活性增强，但随修饰程度的增加活性反而下降。主链修饰还可将磷酸二酯键中的非共价氧被等电子的甲硼烷替代，这种甲硼磷酸化修饰的siRNAs比天然siRNAs更有效，与硫代修饰siRNAs相比抵抗核酶降解能力更强而毒性更低。有研究表明恰当化学修饰的siRNAs稳定性好、能与靶位更有效结合，改善其药代动力学特性的同时却不影响其内在效能。