通过乙肝病毒大表面蛋白诱导的细胞液泡化和细胞凋亡

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原    文：Cellular Vacuolization and Apoptosis Induced by Hepatitis
B Virus Large Surface Protein
作    者：Ngee-Chih Foo, Byung Y. Ahn, Xiaohong Ma, William Hyun, and T. S. Benedict Yen
作者单位：San Francisco VA Medical Center, San Francisco,CA; Department of Pathology and Comprehensive Cancer Center, University of California, San Francisco, CA; and Department of Life Science, Korea University,
Seoul, Korea.
发表刊物：HEPATOLOGY, Vol. 36, No. 6, 2002
   以下为中文翻译稿 ：   
                                                                                          
通过乙肝病毒大表面蛋白诱导的细胞液泡化和细胞凋亡

纤维淤胆性肝炎(FCH)是乙肝病毒的一种快速发展的过程，它发生于严重的免疫抑制病人中。病理学方面，FCH状态下的肝脏的主要特征是肝细胞产生广泛性的液泡化和细胞凋亡，相比较于普通的乙肝的形成，它很少产生明显的炎症反应。因此，对于FCH，已经被提出，肝细胞的损伤更多的是来自于病毒性的细胞病变效应，而非来自于宿主的免疫反应。作为以上猜想的证明，我们提供了证实，即在培养的肝细胞中转染进选择性表达病毒大的表面蛋白的质粒，从而形成许多大的液泡和产生细胞凋亡。体内的FCH细胞病理情况和体外的这些转染细胞的病变的相似性，表明大的表面蛋白是形成这种急性肝病的直接原因。已发表的关于在FCH下肝细胞中积累大的表面蛋白，这种蛋白是通过病毒而超量表达的，它支持了以上的结论。总之，我们的数据表明在纤维淤胆性肝炎中，大的表面蛋白是导致肝细胞损伤的主要原因。
前言：乙肝病毒（HBV）为包膜DNA病毒，它在世界范围内广泛发生[1]。大多数的感染病人能够产生有效的免疫反应并清除病毒。然而，少数个体不能够如此，并且形成了慢性感染。他们会发展为慢性肝炎，肝硬化和肝细胞癌。每年有超过1百万的人死于慢性乙肝感染的并发症。
通常我们认为，乙肝相关的肝损伤不是由病毒自身引起，而是通过宿主的免疫反应[2，3]。这种论断由许多发现所支持，这其中包括当在慢性感染个体的百分比例中缺少临床的和病理学上的证据，那些个体仍然在他们的肝细胞中表现出高水平的病毒复制[1]。进一步的，在培养基中生长的肝细胞，转染进乙肝基因组，它可以产生不定数的病毒颗粒，没有证据表明对于它们的复制有细胞病变或者其它负作用[4]。然而，这种病理机制不是对于所的乙肝病例都起作用。在特殊情况中，严重的免疫抑制病人可能死于乙肝感染的情况，如纤维淤胆性肝炎（FCH）。当在FCH情况下，在肝细胞中积累大量的病毒蛋白，伴有广泛的肝细胞液泡化和细胞凋亡，在临床上，产生快速的肝纤维化和肝功能衰竭[5-9]。由于在这些患者中缺少明显的肝炎炎症和免疫抑制，表明了在这些疾病中，一种或多种病毒基因产物和肝细胞的损伤有着一定的联系。乙肝产生的大的表面蛋白有可能是以上现象的起因，因为在转基因小鼠的肝脏中过量表达大的乙肝表面蛋白，表现出慢性的肝炎症状，尽管还没有直接的证据证实对于大的表面蛋白造成的急性细胞病变。
在此次研究中，我们提供了实验证据，表明了在培养的肝细胞中表达乙肝的大的表面蛋白会引起细胞凋亡。在死亡之前，来自于粗糙内质网（ER）的小泡，通过膨胀的膜介面的积累，致使细胞表现出明显的细胞质液泡化作用。FCH的肝脏病变，在体外有着相似的反应，和先前的FCH下肝细胞细胞质中大的病毒表面蛋白的情况积累，表明了大的表面蛋白在此种疾病的病理中有着重要的作用。
材料和方法：
质粒，pCMVβ（Clontech, PaloAlto, CA）质粒使用的是巨细胞病毒（CMV）即早期启动子来表达半乳糖苷酶。质粒pCMV-EGFP，表达绿色荧光蛋白，它的构建带有CMV启动子，用EcoRI和SmaI消化pCMVβ，再连入用EcoRI和SmaI消化的pEGFP-1（Clontech）。质粒pSFFV-Bcl2和pSFFV-Bax表达Bcl2和Bax。质粒pSV2neo表达新霉素抑制基因，此质粒来自于J.Ou。质粒pCMVLM-S-，表达乙肝大的表面蛋白，由CMV即早期启动子控制，表达的乙肝X蛋白，由其自身启动子控制，如先前的描述[13]。质粒pCMVLM-S-X-和质粒pCMVLM-S-相似，只是它的X基因104密码子进行了突变，由TCA变为TAG。这个突变阻止了任何有功能的X蛋白的产生。
细胞培养和DNA转染。HuH-7和NIH3T3细胞用Dulbecco的改进的Eagle培养基培养，其中加有10%的胎牛血清，在37℃下，93%的空气和7%的CO2的条件下进行。细胞在60mm的培养瓶中，磷酸盐的条件下转染，如前所描述，或者用FuGene6。对于FuGene6介导的转染，5μg的质粒DNA和15μL FuGene6及200μl无血清培养基一起在室温下预培养20分钟。混合物再加入到60-mm培养瓶，并加入5mL含血清的培养基。过夜培养后，用新鲜的培养基来更换。在一些实验中，细胞在开始转染后的24或48小时开始收集。另一些实验中，每两天，转染的细胞在加入新鲜的培养基之前用PBS冲洗两次，直到转染3或6天后细胞被收集。斑点计数，用10μg的pSV2neo和10μg的pCMVB， pCMVL+M-S-及pCMVS转染Huh-7细胞。转染后的Huh-7细胞用胰蛋白酶消化48小时，再转入100-mm培养皿，加入10mL培养基和500μg的geneticin。抗药性的克隆经过3个星期在这些培养皿中形成，在它们形成之前用Giemsa染料显色。直径大于2mm的可见斑被计数统计。
通过荧光活化细胞分选仪检测DNA的量。参考Juan和Darzynkiewicz手册[15]。简述之，转染后6天，收集培养基，通过胰酶消化收集细胞。混合的培养基和细胞在300g，4℃下离心5分钟，之后重悬到0.5mL Ducbecco的PBS缓冲液中。细胞滴加入14mL的冰乙醇并于-20℃条件下过夜。乙醇混合的细胞在300g，室温条件下离心5分钟，用5ml的PBS冲洗，再次离心。细胞重悬于0.5ml的透化溶液（0.25% Triton x-100于PBS中），并在室温下放置5分钟。透化后的细胞再次离心，重悬于200μl的冲洗液（含1%的牛血清蛋白的PBS），含有恰当的稀释的初级抗体，在室温下培育60分钟，并不时地轻轻摇动。培育后，在离心之前用5ml的冲洗液处理细胞，重悬于200μl的冲洗液中，加入稀释的荧光标记的二抗，稀释度为1：40（Sigma Chemical CO.,St.Louis, Mo），在室温下培育45分钟。加入5ml的冲洗液并离心，细胞重悬于1ml的PBS，其中含有100μg的无脱氧核糖核酸酶的核糖核酸酶A，和5μg的碘化丙啶。细胞在暗处室温下培养1小时，用35μm的细胞滤网膜过滤（Falcon,Lexington, KY），并且用荧光活化细胞分选仪分析。FACS Calibur的起始点设立在碘化丙啶正值处，不包括小的碎片和大的双联体或团块。每个样品中至少有100，000个细胞用ModFit LT来分析，此细胞循环分析软件来自于Verity, Inc., Topsham, ME。
初始抗体使用的是多克隆兔抗β-半乳糖苷酶抗体，稀释度为1：250（5 Prime→3 Prime Inc, Boulder, co），或者使用单克隆鼠HBV表面蛋白抗体，稀释度为1：50（DAKO，Carpenteria, CA）。
Western Blotting。用5μg的pCMVL+M-S-X-或pSFFV Bax转染Huh-7细胞，第3天时，细菌生物碱加到一些培养瓶中，终浓度为2μmol/L。第4天，收集细胞，用胰蛋白酶处理，胞融物中加入提供的caspase－3抗体。细胞用PBS冲洗一次，再用5倍于细胞体积的溶解缓冲液重悬，细胞反复冻融3次，经过14,000g离心10min，收集上清于小离心管中。取1/4体积的上清液，和等体积的2xtricine凝胶上样缓冲液混合（Novex, Carlsbad, CA），煮沸5min，然后在tricine缓冲液中进行10%到20%的丙烯酰胺梯度电泳。凝胶中的蛋白转移到Immobilon-P膜上（Millipore, Bedford, MA），用兔抗caspase3 的多克隆抗体标记，在PBS溶液中，按1：1,000稀释，Tween20的体积比为0.05%，并含有质量百分比为5%的脱脂奶粉。结合抗体通过加强的化学发光反应物来检测（Amersham Pharmacia, Piscataway, NJ）。
转染细胞的形态分析。为了证实凋亡，用1μg的pCMVEGFP和10μg的pCMVL+M-S-X及pCMVβ共转染HuH-7细胞。转染后3天，收集培养基，加入Hoechst 33342到终浓度为20μg/mL。混合物置于冰上30分钟，加入终浓度为1%（wt/vol）的三聚甲醛。在冰上培育90分钟后，使用ThinPrep 2000使细胞单层覆盖于玻片上。第二个检测，盲传样品进行检验，用荧光显微镜进行分析。至少150个GFP阳性细胞出现了细胞核构型上的压缩或片段化，这是细胞凋亡的特征。
为了检测转染细胞的组织学特征，HuH-7细胞生长在LabTek chamber玻片上（Nalge Nune, Rochester, NY），用pCMVL+M-S-X或pCMVS来转染此细胞。转染后两天，细胞中混入4%的中性甲醛缓冲液，并且在UCSF，免疫组化病理学系，用曙红Y对表面蛋白进行染色，使用1：10稀释的鼠多克隆抗体（Zymed），北San Francisco, CA, 并且使用Ventana（Tucson, A2）的自动染料。来自于FCH症状的病人的肝组织也用类似的方法进行染色来检测表面蛋白。
电镜观察，HuH-7细胞在转染后的1或2天，加入中性的磷酸缓冲液固定，其中含有2%的戊二醛，之后加入四氧化锇，并包理进Epon中。切成80nm的部分，使用柠檬铅和醋酸铀染色，使用Philips (Hiusboro, OR)CM10电子显微镜观察。

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结果：大的表面蛋白的表达缺少稳定性。乙肝表面基因编码3种表面蛋白（包膜蛋白），称为大的，中的和小的（主要的）表面蛋白[3]。它们起始于不同的同框ATG启始密码子处，但终止于相同的终止密码子处。由于不同的转录和转录后的调节，通过感染的肝细胞合成的大的表面蛋白远远少于中等的和小的表面蛋白[16]。实际上，之后形成的蛋白在数量上远远超过病毒形态发生所需的量。作为一种结果，大量由中等和小的表面蛋白所组成的没有感染性的亚病毒颗粒分泌到感染的肝细胞血清中。相对应的，如果大的表面蛋白超量表达（或通过自身表达），亚细胞颗粒将不会分泌，而是积累在内质网一高尔基体的中间组成过程中（ERGIC）[17-21]。
我们先前的结果表明大的表面蛋白颗粒在ERGIC中的积累会诱导内质网胁迫[13]。为了在更多的细节上论证这个现象，我们通过共转染表达大的表面蛋白的质粒和表达新霉素抗性的质粒来使HuH-7肝细胞稳定表达大的表面蛋白。然而，我们没有得到这种细胞，尽管成功获得了稳定表达β-半乳糖苷酶的细胞。对药物抗性的克隆进行的定量表明，和共转染β-半乳糖苷酶表达质粒相比，如共转染大的表面蛋白表达质粒则会使此克隆的数目大幅度减少（图1）。进一步的，免疫荧光分析表明，尽管所有较晚期克隆表达β-半乳糖苷酶，但是没有早期的克隆表达大的表面蛋白（数据没有显示）。这种影响对大的表面蛋白具有特异性，因为如果共转染表达小的表面蛋白的质粒则产生数量较多的克隆（图1），此克隆表达此小的蛋白（数据没有显示）。因此，大的表面蛋白似乎干扰细胞的循环和（或）杀死宿主细胞。和pCMVL质粒一起转染的条件下，除了包含有表达大的表面蛋白质粒外，还含有表达中等和小的表面蛋白的质粒，此情况下也不会产生稳定表达的大的表面蛋白（数据没有显示），这说明了这种影响来自于过量表达大的表面蛋白，而非缺少中等的和小的表面蛋白。


图1，大的表面蛋白在稳定转染子形成上的影响。Hu H-7细胞用以下质粒共转染，编码新霉素抗性的或β-半乳糖苷酶，小的表面蛋白或大的表面蛋白。3星期后在G418中筛选，用Giemsa染色后，直径大于2mm的克隆用来计数。数字代表3个分别转染的标准误差均值。


大的表面蛋白诱导的细胞死亡。为了测定大的表面蛋白对细胞循环和活力方面的影响，我们使用FACS检测瞬时转染的HuH-7细胞中的DNA含量。空白对照细胞在G1，S和G2期上表现出了和预期相同的结果，一小部分在Sub-G1期的细胞表现出了一个低水平的细胞死亡（图2A；参看图2D中的第一道的数值）。当用β-半乳糖苷酶表达质粒瞬时转染细胞，没有转染的细胞体（通过抗β-半乳糖苷酶的抗体负染）表现出一些更多的Sub-G1期细胞（图2D，2道），这可能是一种转染过程中的非特异性结果。转染的细胞体（通过β-半乳糖苷酶的阳性结果）表现出了本质上相同的特征（图2B和图2D的第三道）。然而，当细胞用相似的方法转染进大的表面蛋白表达质粒后，许多转染细胞（通过表面蛋白抗体检测为阳性）表现出Sub-G1期的DNA特征，包含有大量的细胞死亡（图2C和图2D的道5）。相对照的，从同一个实验的没有转染的细胞体则不表现出这种特征（图2D，4道）。当用大的表面蛋白表达载体和β-半乳糖苷酶表达载体共转染细胞，并用β-半乳糖苷酶的抗体来检测，也如所设想的，用表达原凋亡蛋白Bax的质粒和表达β-半乳糖苷酶的质粒共转染细胞，并用抗β-半乳糖苷酶的抗体检测，也会产生许多的有着sub-G1期特征的细胞（图2D，道6）。由于用来表达大的表面蛋白的质粒同时也会表达乙肝的X蛋白，在一些条件下这可以产生原凋亡现象，所以要排除这种死亡，全部或部分地来自于蛋白X，这是非常重要的。因此，我们构建了一个来自于表达大的表面蛋白质粒的重组质粒，此质粒对X基因进行了突变，使之不会产生任何有活性的蛋白X。用质粒（pCMVLM-S-X-）转染HuH-7细胞，仍旧会导致细胞死亡，这证实了蛋白x在这个过程中并没有发挥作用。为了不使任何来自于蛋白X的影响带入本实验，以下的实验都采用质粒pCMVLM-S-X。
图2，通过大的表面蛋白诱导的细胞死亡。HuH-7细胞用空白转染对照或用指定的蛋白表达质粒转染。在选择实验中，细胞用200μmol/L的ZVADfmk处理。6天后，收集细胞，用表达蛋白的抗体检测，并用FACS分析蛋白的表达和DNA组成。（A）空白对照的细胞DNA特征。2个主要的峰值表示细胞的G1期和G2期。（B）表达β-半乳糖苷酶细胞的DNA特征。（C）表达大的表面蛋白的细胞的DNA特征。大多数细胞在G1期含有较少的DNA。（D）细胞在亚G1期所含DNA的量，3个分别的实验的标准误差均值。第一道，没有DNA进行的转染。2-7道和9道，6μg相应的质粒和4μg的PUC19进行的共转染。第8道，6μg的pCMVL+M-S-X和4μg的pSFFV-Bcl2进行的共转染。
许多证据表明，通过大的表面蛋白造成的死亡是细胞凋亡。第一，如果和表达抗原凋亡蛋白Bcl2的质粒一起转染，则此过程可以被抑制（图2D，道8）。第二，这种死亡可以被通常的caspase 抑制剂benzyloxycarbonyl-Val-Ala-Asp-flu-romethylketone(zVADfmk)所抑制（图2D，道9）。第三，在表达有大的表面蛋白的转染细胞中发现，原体caspase3被切割为有活性的caspase 3形式，这和Bax转染的细胞及用细菌生物碱处理的细胞产生的现象相似（图3）。第四，许多大的表面蛋白转染的细胞（通过共转染带有GFP的质粒标记）表现出细胞核浓缩以及细胞凋亡的片段化（图4A和B）。相对照，共转染表达质粒β-半乳糖苷酶和GFP，小得多的碎片产生于细胞核（图4B）。这些实验在转染后3天进行，在背景中带有最少的细胞碎片；然而，细胞的死亡百分比，比用FACS分析要低一些，FACS的分析是在转染后6天进行的。
图3。通过大的表面蛋白诱导的caspase 3的剪切。用表达大的表面蛋白质粒（pCMVLM-S-X）或Bax（2道和4道）转染HuH-7细胞，4天后收集细胞。没有转染的细胞也用相似的方法收集（1道），同时，另一组没有转染的细胞用细菌生物碱处理1天（道3）。整个细胞蛋白用SDS聚丙烯酰胺进行电泳，转膜，并用caspase3的特异性抗体标记。箭头表示全长的caspase3，星型表示在细胞凋亡中剪切的caspase3形成的大片段。小片段用此抗体不会检测出来。

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图4。通过大的表面蛋白诱导的核浓缩和片段化。用表达GFP的质粒和大的表面蛋白表达质粒（pCMVLM-S-X）或β-半乳糖苷酶表达质粒一起共转染HuH-7细胞。3天后，悬浮细胞进行爬片并用Hoechst 33342 进行染色。带有核浓缩和/或片段化的绿色荧光细胞被用来观察。（B）3次转染的标准误差均值。









通过大的表面蛋白诱导的细胞质液泡化。在我们的分析过程中，我们发现，用大的表面蛋白表达质粒转染的早期，相当比例的细胞表现出了细胞质的液泡化（图5A），这不同于用小的表面蛋白表达载体所转染的细胞的情况（图5B）。用抗表面蛋白的抗体进行的免疫染色证实了液泡化的细胞代表了那些表达了大的表面蛋白的情况，因为这些细胞在细胞核周围和液泡之间有着强烈的染色，可用免疫荧光或免疫过氧化物酶技术得到证实（图5C和D）。相对照，表达小的表面蛋白的细胞在细胞质中表现出网状的染色特征，而非液泡化（图5E）。这些液泡不是大的脂滴，因为用油红O不能对其染色（数据没有显示）。电镜观察发现，这些小泡为带膜的泡体，转染后第1天其较小（图5F和G），但在转染后第二天会变得相当大（图5H）。在细胞液泡化的早期，这些小泡密布于核糖体（箭头，图5G），表明了它们来自于粗面内质网。这些小泡不同于ERGIC，它包含有一种内腔大表面蛋白颗粒（单箭头，图5G）。很相似的液泡化现象也在FCH状态下的病人的肝细胞中被发现，并且这些肝细胞在细胞质中积累大量大的表面蛋白（图5I）。值得指出的是，通过免疫组化，FCH下肝细胞表面蛋白积累的量和我们转染细胞中的相类似（比较图5D和I）。

图5。通过大的表面蛋白诱导的细胞质液泡化。（A）用大的表面蛋白表达质粒（pCMVLM-S-X）转染HuH-7细胞，并用eosin染色。（B）用小的表面蛋白表达载体转染HuH-7细胞，并用eosin染色。（C）用大的表面蛋白表达质粒转染HuH-7细胞，用鼠的抗表面蛋白的多克隆抗体染色，并用cy3标记的二级抗体。箭头表示转染的细胞的核周围和质中的液泡化区域的明亮部分。图片进行了充分曝光，来表现没有转染的细胞背景。（D）用大的表面蛋白表达载体转染HuH-7细胞，用免疫过氧化物酶技术来标记表面抗原（黑棕色）并用苏木精进行复染色（蓝色）。箭头表示转染的细胞。（E）用小的表面蛋白表达载体转染HuH-7细胞，用免疫过氧化物酶技术标记表面抗原（黑棕色），并用苏木精进行复染（蓝色）。（F）用大的表达蛋白转染的HuH-7细胞的电镜观察，转染后1天收集细胞。在ERGIC中（单箭头）之间的大的表面蛋白颗粒。标尺=1,000nm。（G）用大的表面蛋白转染的HuH-7细胞的高能电镜观察，转染后1天收集细胞。在一些膨胀的小泡上含有核糖体（箭头），在ERGIC（单箭头）上有表面蛋白颗粒。标尺=500nm。（H）大的表面蛋白转染的HuH-7细胞的电镜观察，转染后2天收集细胞。标明的一个大的液泡。一些液泡包含有无定形的电镜染料，可能表明了一些沉淀下的分泌的蛋白。标尺=1,000nm。（I）FCH下病人的肝组织切片，用免疫过氧化物酶技术标记表面抗原并用苏木精复染。在肝细胞中存在着小泡。


讨论：我们已经证实，表达的乙肝大的表面蛋白致使培养的肝细胞在一些天内死亡。通过许多生物化学和形态方面的证据，这种死亡为细胞凋亡。显著的特征是，这些细胞在死亡前的胞质中有明显的液泡化。这些小泡有膜质的边界，似乎来自于内质网。它们不能简单地认为是细胞凋亡造成的，因为用ZVADfmk来阻止细胞凋亡，但不能阻止液泡的形成(Ahn and Yen, unpublished observations, October2001)。这些变化和那些患有严重乙肝的FCH的病人肝细胞很相似[5-9]。感染的乙肝的肝损伤通常认为是由免疫反应所介导的，而非通过病毒本身所致[2,3]。然而，FCH可能是一种例外，因为它的特征为很少的肝的炎症发生，并且只是在严重的免疫抑制的个体中被发现。免疫组化和放射性免疫分析表明，在FCH下的肝细胞积累表面蛋白，包括大的表面蛋白[5-9]。实际上，尽管精确的量化不太可能，但我们的免疫组化分析表明，在我们体外转染的细胞和在FCH下病人液泡化肝细胞的细胞质中，表面蛋白的总量基本相似。因此，似乎对于FCH下的细胞影响和肝功能衰竭，主要的，至少是部分的作用来自于大的表面蛋白，尽管通过我们的结果，不排除有其它的乙肝蛋白在其中发挥了作用。通过大的表面蛋白诱导的细胞凋亡和液泡化不仅仅局限于HuH-7细胞，因为它也在HepG2的人类肝细胞中观察到（数据没有显示）。因此，这些现象并不是HuH-7细胞中独一无二的。
Chisari等[10]和Fernandes等[23]已经证实，在转基因小鼠中过量表达大的表面蛋白会使肝细胞凋亡并且产生慢性肝炎。然而，在他们模型中的这种损伤相对比较温和，没有小鼠死于肝功能衰竭。我们转染的细胞和FCH下的病人的这种不同的原因还不清楚，但是可能和转基因肝细胞的适应性反应有关，这些细胞大概从出生前就开始表达大的表面蛋白。这种情况和FCH及我们转染的细胞形成鲜明的对比，FCH下和我们转染的细胞会大量表达大的表面蛋白。事实上，基于我们的结果，如果转基因小鼠不能够适应大的表面蛋白积累的话，它就不能够存活下去。然而，来自于转基因小鼠的结果也证实了大的表面蛋白在肝细胞损伤中的重要作用。
许多研究小组已经证实，相对于中等和小的表面蛋白，大的表面蛋白不能够分泌，甚至带有反式调控作用，它阻止其它形式的表面蛋白进行分泌[17-20]。我们先前已经证明，大的表面蛋白形成的颗粒积累于ERGIC中，并且导致内质网胁迫[13,21]。这种胁迫，依次使没有折叠的蛋白的反应激活，并作为一种适应性反应增加细胞和病毒基因的转录[13]。通常，维持一种高水平的内质网胁迫会产生细胞凋亡[24]。因此，可能由大的表面蛋白介导产生内质网胁迫激活通路的细胞死亡。另一方面，细胞质的液泡化不会由内质网胁迫和由积累的错误折叠蛋白造成的细胞凋亡来引发。这种不同造成了一种可能性，就是大的表面蛋白可能由其它机制导致细胞凋亡。在大的表面蛋白表达的细胞中存在的大的带膜小泡使人联想到用brefeldin A来处理细胞，brefeldinA是一种真菌的代谢产物[25]，它可以阻止从内质网向高尔基体分泌蛋白，通过凋亡的形式使细胞死亡[26,27]。因为大的表面蛋白颗粒存在于ERGIC中，大概通过这个蛋白可以产生相类似的分泌抑制。值得注意的是通过brefeldinA产生的死亡也可以通过ZVADfmk和Bcl2来阻止[26,27]。
越来越多的证据表明，细胞病理和人类的疾病可以由内质网中不正常的蛋白积累所引起。这些疾病包括а1一抗胰蛋白酶缺乏病，阿尔茨海默氏病，帕金森氏综合症，甚至缺血性中风和糖尿病[28-32]。我们的结果表明，FCH也可能属于它们的行列。进一步的，发现肝细胞中积累的表面蛋白和非FCH的慢性乙肝的肝功能衰竭的严重性呈现为正相关性[33]，使得大的表面蛋白在肝细胞中的积累对肝损伤起着相当的作用。
在我们转染的细胞中，使用异源性启动子，从而使大的表面蛋白会过量表达，此时，我们对在FCH下的大的表面蛋白超量表达的原因并不清楚。一种可能的原因来自于病毒的突变，使表面蛋白基因的表达不正常。Bock等[34]从FCH下的病人体中分离的突变的乙肝基因组，当其转染进培养细胞后会过量表达大的表面蛋白。另一种可能性，但也不能彼此地排除，是缺少一种全功能的免疫系统来使乙肝基因的表达增加，因为已经被证实，转基因小鼠的细胞因子可以负调控乙肝信使RNA的水平[2]。
总之，我们的研究发现，乙肝大的表面蛋白会致使体外培养的细胞的液泡化和细胞凋亡。这些结果和FCH下的肝脏病理情况相当地相似，因此大的表面蛋白在这种严重的疾病中充当了很重要的角色，尽管不能排除还有其它病毒组分的细胞影响。进一步的研究还需要阐明这种细胞损伤的分子机制以及此细胞凋亡的通路。这些信息应该针对于阻止或者治疗这种潜在致死的变异的乙肝病毒。

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特深沉

有意思。不过对治疗没有指导作用。