乙型肝炎病毒耐药的标准化命名、检测及处理

张医生

　　慢性乙型肝炎的治疗在过去的10年中取得了长足的进展，目前已经有两种干扰素以及4种核苷（酸）类药物被批准上市。然而，核苷（酸）类药物48周疗程结束后，往往很难达到对病毒的持续抑制，而长期甚至是无限期的治疗会增加病毒耐药产生的风险。病毒耐药的产生及患者依从性差是导致乙型肝炎治疗失败的最重要原因，因此，有必要对乙型肝炎病毒耐药相关的命名标准化，包括核苷（酸）类药物的基因型耐药、表型耐药以及临床耐药。DNA检测推荐用国际卫生组织（WHO）指定的标准单位（IU/ml）。

　　一、病毒耐药的临床分类

　　（一）原发性治疗失败（或无应答）：核苷（酸）类药物治疗6个月后，患者血清HBV-DNA较基线下降小于1log10IU/ml，称为原发性治疗失败。之所以如此定义，是因为它超过了HBV-DNA定量检测法的误差，从而能真实地体现病毒学应答，但HBV-DNA水平1log10IU/ml的下降在临床治疗中意义并不大。原发性无应答可能与宿主、病毒以及药物因素有关。患者体内酶的个体差异，包括将药物前体转化为药物活性形式的酶以及将核苷（酸）类药物磷酸化为其三磷酸活性形式的磷酸化酶，在原发性治疗失败中起着一定的作用。一些病毒株对于某种或某些抗病毒治疗敏感性较低，最近对1例阿德福韦原发性无应答的研究支持了这一观点。抗病毒药物的剂量和效力也对应答效果起着重要的作用。以阿德福韦为例，批准治疗乙型肝炎的剂量为10mg/d，此剂量的抗病毒效力比不上高剂量，这也是阿德福韦原发性无应答率高的最重要原因。研究证明，治疗6～12个月后较高的HBV-DNA含量，与病毒耐药的发生率呈正相关。因此原发性无应答的监测非常重要。

　　（二）继发性治疗失败（或病毒学突破）：病毒学突破往往伴随着病毒耐药的出现，它被定义为在患者依从性良好，且初始治疗有效的情况下，在连续两次相隔1个月以上的样本检测中，血清HBV-DNA水平较治疗过程中的最低点升高大于等于1log10IU/ml。对伴随转氨酶升高的患者来说，无须证实第二次样本中血清HBV-DNA升高。与野生株相比，大多数HBV耐药变异株复制能力下降，所以开始时HBV-DNA浓度比较低，但如果继续原有治疗，随着代偿性变异的出现和累积，病毒的复制能力得到恢复，从而导致病毒反弹，HBV-DNA水平将会逐步增加，甚至超过治疗前的水平。

　　（三）生化学突破：生化学突破是指病人达到初始应答，转氨酶正常后继续治疗转氨酶再次升高。血清转氨酶可能在病毒学突破数周或数年后仍保持正常。生化学突破常常与病毒反弹同时出现，在某些病例中，转氨酶出现明显上升，从而形成肝炎爆发（转氨酶大于正常值上限的五倍），但肝功能失代偿罕见。

　　二、基因型耐药的定义、命名及其检测

　　病毒耐药中的一个基本问题在于如何定义耐药变异。当变异在复制过程中出现时，便形成了一个核苷酸的置换。它可以是同义置换（不伴有氨基酸的改变），也可以是错义置换（伴有氨基酸的改变）。耐药突变株会引起氨基酸的改变，从而降低病毒对药物的敏感性。

　　（一）基因型耐药：指在药物靶基因（在HBV核苷（酸）类药物治疗中指HBV聚合酶基因）上出现特定的核苷酸以及相对应的氨基酸突变，而它们已经被证明与病毒耐药有关。理想状态下，为了鉴定潜在的基因型耐药，在病毒学突破时分离提取的HBV-DNA序列及其推导出的氨基酸序列应该与患者治疗前标本的序列比对。当治疗前标本无法获得时，也可以与已经发表的同一基因型的HBV序列比较。

　　原发性耐药突变：指由于1个氨基酸的替换而导致对于某种抗病毒药物的敏感性下降，而继发性代偿突变是指一个氨基酸的替换能够补偿因原发性耐药而导致的病毒聚合酶活性的功能缺陷（如复制适应性）。例如，原发性拉米夫定耐药相关变化发生在204位密码子，相对应的氨基酸由酪氨酸-甲硫氨酸-天冬氨酸-天冬氨酸（YMDD基序）变为YVDD或YIDD（甲硫氨酸被缬氨酸或异亮氨酸取代），即rtM204V/I。这一改变可导致在表型测定中病毒对于拉米夫定的敏感性下降超过100倍。而与拉米夫定耐药相关的最常见的代偿性变异则为rtL180M（亮氨酸被甲硫氨酸所取代），它能恢复HBV聚合酶因rtM204V/I变异而降低的复制适应性。

　　尽管没有研发出真正的竞争性复制适应性测定方法，但当前的体外测定法已经能够确定编码某些特定突变的HBV-DNA与参照系以及野生株相比较的相对复制能力。举例来说，编码rtV173L（缬氨酸被亮氨酸取代）＋rtL180M＋rtM204V的HBV克隆和编码rtL180M＋rtM204V变异的HBV克隆相比，在复制能力上有所增加，而在对拉米夫定的敏感性上却没有差异。因此，rtV173L变异被看作是HBV-DNA基因组中的一个代偿性变异。

　　如果在两个或更多接受同一种抗病毒药物治疗且出现病毒学突破的患者中，检测到新的核苷酸及其相对应的氨基酸改变，在排除患者依从性的情况下，可以被定义为“假定”的耐药突变，而且将一直保持其假定的地位直到体外表型实验证实。因此，需要有足够的数据来证明特定的核苷酸以及由它所推导的氨基酸突变在药物选择压力下是独特的。另外，在对同一种抗病毒治疗持续应答的患者中此突变株不应被检测到。在治疗前进行的检测中，该突变株一般也不超过病毒总数的5%。尽管在治疗前和（或）病毒学突破前标本中可以用超敏法（见下文）检测到耐药变异株，但在没有药物选择压力下的治疗前标本中，突变株成为准种中优势株的可能性很小。

　　基因型耐药的确定基于以下两个方法：体外表型分析和虚拟表型分析，后者是研究患者治疗及应答资料与HBV序列数据间相关性的一种方法。

　　体外表型分析：是确定基因型耐药的金标准，但是，由于合适的细胞培养体系的不足以及对有特异性HBV复制活性细胞的需求，使得这种方法需要消耗大量人力物力和时间。另外HBV基因组其他部位上的多重核苷酸及序列置换也会影响结果。

　　虚拟表型分析：患者治疗和应答资料与HBV序列数据的相关性。这种方法依赖相关HBV数据库。在库中，临床、病毒学和HBV序列资料通过相互连锁进行整合和统计学分析。建立这样一个数据库需要大量的治疗过程中出现病毒学突破的患者。输入的临床和HBV序列资料与库中数据对比，从而找到最相符的数据和最可能发生的治疗应答。

　　（二）基因型耐药命名：在开始检测和报道病毒耐药时，由于HBV不同基因型在基因组长度上的差异，使得对于耐药突变的命名有些混乱。2001年Stuyver和他的同事们通过将HBV聚合酶划分为4个功能区和对每个功能区重新编号解决了这个难题。在所有的基因型中，聚合酶基因中的逆转录酶区是相同的。这个区域中的突变应该这样描述：在前缀字母RT后的是原始的氨基酸，接着是从此区域开始计数的密码子编号，最后是突变的氨基酸。例如：原发性拉米夫定耐药改变用此种命名法便被称为rtM204I和rtM204V（HBV基因逆转录酶区的204号密码子编码的甲硫氨酸被异亮氨酸或缬氨酸取代）。由于在保守的YMDD基序中只有甲硫氨酸被置换，所以这种拉米夫定耐药变化不应被称为“YMDD突变”。

　　（三）确定新的基因型耐药突变的技术问题：在确认已知的或新发现的耐药突变株的HBV聚合酶基因序列测定中，目前被广泛接受的标准是PCR扩增产物的双链（或双向）测序。在报道新证实的耐药突变株时，应包括HBV聚合酶基因逆转录区核苷酸序列和氨基酸序列的改变。此外，任何引起与之重叠的包膜读码框编码的氨基酸序列改变也应包括在内。这些序列都应该储存在基因库内。当在同一位点检测到超过一个的核苷酸改变（如混杂的HBV总体）时，所有对应的氨基酸序列都应用国际理论化学和应用化学联合会（IUPAC）的代码列出。举例来说，当病毒总体由野生株和拉米夫定耐药突变株混合而成时，就应该报道为rtM204M/V。另外，由于在相应重叠读框的HBV表面蛋白编码区195位密码子有甲硫氨酸被异亮氨酸取代的情况出现，HBV表面蛋白195位氨基酸可能为甲硫氨酸或异亮氨酸，也应标明为sI195M/I。

　　1、检测基因型耐药突变的方法：鉴定耐药突变的可用方法包括PCR产物的直接测序、PCR扩增产物的多重克隆序列分析、特异性探针实时PCR法包括等位基因特异性PCR、杂交法如线性探针测定法、限制性片段长度多态性（RFLP）以及最近应用趋于广泛的基质辅助激光解吸附电离飞行时间质谱测定法（MALDI-TOF MS）。此法基于限制性酶切片段质量多态性（RFMP），RFMP能检测出在病毒准种中含量小于1%的突变株。敏感的检测法能测定在整个病毒准种中仅占5%～10%的编码耐药突变株的HBV-DNA，从而能在患者病毒学突破发生或更早时确定基因型耐药的出现。虽然超敏测定法能检测出在病毒总体中含量低于1%的突变株，但它对于预测耐药发生的实际意义还不确定。

　　2、直接PCR测序：直接PCR测序对于少量耐药突变株的检测最不敏感，只有当耐药突变株达到病毒准种的20%以上时才能被检测到。它也不适用于大规模筛选，但直接PCR测序适用于各种突变的测定，包括潜在的代偿性突变和新发现的未确定的突变。体外表型测定对于新疗法和现有疗法中新生变异的确定是必不可少的。

　　3、限制性片段长度多态性（RFLP）分析：限制性片段长度多态性分析能检测出在病毒总体中大于5%的突变株，但是对于每一个感兴趣的突变，必须特别设计单独的核酸内切酶。有些突变能产生1个新的限制性内切酶位点，在这种情况下RFLP分析非常有用。而对于那些破坏原有的限制性位点的突变，RFLP分析需要谨慎地使用。因为酶切的不足既可能是因为限制性位点的消失所致，也可能缘于此种方法的技术问题。由于针对某些突变的特异性内切酶可能并不存在，RFLP分析并不适用于所有的突变。

　　4、反向杂交测定法LiPA DR：已经商品化的反向杂交测定法LiPA DR（Innogenetics公司， 比利时）包含一系列的膜结合寡核苷酸探针，能检测出单个核苷酸的错配。LiPA法能检测出病毒总体中大于5%的突变株，它的最大不足在于每一个变异都需要一组特异性的探针。由于病毒基因型的差异，检测1个单核苷酸变异需要许多的探针。

　　5、基于微芯片技术的测序：微芯片测序法利用寡核苷酸微点阵，可以检测新发现的突变。这种方法代价昂贵，没有得到广泛应用。

　　6、基质辅助激光解吸附电离飞行时间质谱测定法（MALDI-TOF MS）：MALDI-TOF MS对包含变异位点的小DNA片段进行质谱分析，这种方法非常敏感，能检测出在病毒总体中仅占1%以上的突变株。但对于每个新的突变都必须设计一组新的引物，质谱仪也不可或缺。

　　7、单一基因组测序：单一基因组测序已经被用于研究HIV病毒的耐药突变。这种方法不仅烦琐，而且不能提供突变株的绝对频数。另外，由于HBV复制过程中的高自发突变率，病毒总体中小于0.1%的突变株的临床意义并不确定。

　　对4种已经被批准用于治疗乙型肝炎以及数种正在开发中的药物而言，设计一种检测法，使之能检测到所有与这些药物耐药有关的已知突变正变的越来越难。以上所提到的检测法中，只要有报道该方法有效，都能在研究中应用。在临床实践中，最常用的方法包括直接测序法和线性探针测定法。

　　三、体外表型耐药的定义及测定方法

　　（一）表型耐药：一个指定的核苷酸置换是否与耐药有关需要体外表型测定来确定。在体外，如果带有此置换突变的复制活性克隆对于某种抗HBV药物的敏感性较野生株（无此突变）降低，则证明此突变与耐药有关，反之则否。体外表型测定基于与野生株相比，50%药物有效抑制浓度（EC50或IC50）的改变。

　　临床上，抗病毒药物耐药通常被分为重度（增加超过100倍）、中度（增加在10倍到99倍之间）和轻度（增加在2倍到9倍之间）三个水平。但是，这种基于体外表型测定的分级与临床观察结果并不完全一致。例如，在体外对于阿德福韦敏感性的轻度降低（EC50增加2～9倍）可能会引起体内对它的耐药。

　　（二）表型测定的方法：抗病毒药物敏感性实验包括聚合酶活性和HBV复制能力的测定。这些方法较耗费时间且对技术水平要求极高。

　　1、基于酶活性的表型测定：目前HBV聚合酶活性测定的唯一方法是应用杆状病毒载体来测定HBV聚合酶在昆虫细胞中的表达以及在纯化的HBV核壳中聚合酶的表达。此外，有一种无细胞测定法用来研究鸭乙型肝炎病毒（DHBV），但是HBV聚合酶基因有相当一部分插入序列在鸭乙型肝炎病毒和其他嗜肝DNA病毒属病毒中并不存在，而这些插入序列可能影响表型结果的判定。

　　2、基于瞬时转染肝细胞衍生细胞系的表型测定法：已经有两种基于瞬时转染的方法用于表型测定。一种方法凭借定向诱变在重组的、特性清楚的“实验室”HBV复制活性克隆体中产生与耐药有关的点突变。这种方法的优势在于判定特定的突变与药物敏感性降低是否有关。然而在某些病例中，患者HBV-DNA存在的多重突变和（或）更长的基因框架对于耐药性的产生是必不可少的。另一种方法是对临床分离的标本（而不是实验室产生的突变株）进行HBV-DNA基因组全长扩增。在多重突变和（或）克隆变异体存在的情况下，最终结果是由逆转录区和HBV基因组其它部位的所有突变一起决定，而不仅仅取决于1个特定的突变。

　　3、基于杆状病毒/HBV重组子转导入肝细胞衍生细胞系的表型测定法：杆状病毒/HBV重组子也被用于表型测定。在这个体系中，HBV复制由内源性启动子启动，因此能够进行相对复制表型的研究。但是这种技术很烦琐。

　　4、含稳定整合HBV基因组的传代细胞系表型测定：稳定转染表达HBV的细胞系被用来研究病毒耐药。用该细胞系进行表型测定的优点是可以在稳态下进行交叉耐药试验，但对每一个新的突变需要建立一个新的细胞系。HBV-DNA在细胞染色体上的整合位点会影响HBV复制以及细胞功能，因此该细胞系不能用于测定HBV耐药突变株的相对复制效率。

　　四、HBV耐药数据库和虚拟表型

　　虚拟表型指从一个包含基因型、表型和临床信息的庞大数据库找到与临床样本关连的数据，从而确定其表型。

　　分析程序会搜索相连数据库中与特定表型有关的序列，并从中找到最佳匹配。虚拟表型应该成为体外表型的辅助工具，而不应当作它的替代品。首先用来研究HBV患者临床病毒学以及HBV序列资料之间相关性的程序叫做SeqHepB，注册用户可以在线使用这个程序，输入临床分离的HBV核苷酸和（或）氨基酸序列进行分析。SeqHepB能将输入序列与相同基因型的参照序列相比对，从而定义所有的氨基酸变异，并将结果与HBV基因型、表型、临床病史数据库关联。不同的数据采集算法和功能可以用来促进耐药性新标记的快速有效鉴定。功能之一包括在HBV聚合酶分子模型上定位氨基酸的改变。这一功能可以帮助深入了解突变在病毒耐药中的重要意义以及耐药发生的可能机制。

　　欧洲卓越网络在抗病毒药物耐药处理（ViRgil）上也正在实施统一临床记录格式和病毒学中心实验室来建立数据库。日本的肝脏病毒数据库（HVDB）对公众开放，它每年用最新公布的日本DNA数据库（DDBJ）数据更新4次，目前包含10892个HBV数据。HVDB主要采取系统进化分析法进行研究。

　　设计得当的数据库能极大地方便追踪已知耐药突变和发现新突变，它还可以应用于突变相互作用的基础研究、耐药突变的流行病学调查以及对耐药突变相关危险因子和耐药突变病人临床结果的系统性研究。另外，它还能给临床医生提供方便的已知耐药突变的概况，并及时发布耐药资料的变化信息。

　　五、抗病毒药物耐药相关突变

　　基因型耐药发生率与病毒（治疗前血清HBV-DNA水平，治疗前存在耐药突变株）、宿主（免疫状态，药代动力学）、治疗方法特性（药物效力、耐药基因屏障即对抗病毒药物敏感性出现明显下降所需要的耐药突变位点数目、治疗时间）有关。基因型耐药发生率也与检测方法敏感性（见第2节：基因型耐药的定义）以及研究的病人数量有关。因此，采取的方法不同，如用高敏感的PCR检测法（RFLP或反向杂交）检测所有病人的血清HBV-DNA含量和使用低敏感度的PCR检测法如直接测序法仅仅检测病毒反弹（HBV-DNA>10E5拷贝/ml或>10E4IU/ml）患者的血清标本，临床研究结果也不同。这就导致了对于拉米夫定治疗一年后耐药发生率的报道从7%到23%不等。

　　（一）单药耐药

　　1、拉米夫定和其他左旋核苷类药物：原发性拉米夫定耐药突变为rtM204V/I，发生在YMDD基序的204位密码子上。体外实验显示此突变株对拉米夫定的敏感性下降了100倍以上。rtM204V/I突变发生后，异亮氨酸或缬氨酸取代了甲硫氨酸，前两者的β-侧链基团与拉米夫定的草酰硫酸环（oxathiolane ring）发生碰撞，使其不能进入dNTP的结合位点。这种立体阻碍现象是拉米夫定耐药产生的分子机制。rtL180M是最主要的代偿性变异，其它的代偿性变异还包括rtV173L和rtL80I。据报道rtA181T改变在没有rtM204V/I的情况下发生，因此被看作是原发性耐药突变，它在阿德福韦治疗过程中也会出现。拉米夫定耐药突变株rtM204V/I伴或不伴rtL180M对恩替卡韦的敏感性也有所降低。

　　原发性拉米夫定耐药突变rtM204V/I对其它的左旋核苷类药物如恩曲他滨（FTC）、替比夫定（LdT）、β-L-2脱氧胞苷酸（LdC）、Elvucitabine、克拉夫定（1-2'-脱氧-2'-氟-β-D-阿拉伯呋喃糖基-5-甲基尿嘧啶）均有交叉耐药。rtM204V/I在除了替比夫定的上述药物治疗过程中都能被检测到，替比夫定治疗过程中只观察到rtM204I的出现而无rtM204V。

　　在细胞培养中，替比夫定对于rtM204I和rtM204V＋rtL180M无抗病毒活性（www.fda.gov）。拉米夫定、替比夫定和克拉夫定对单独出现的rtM204V突变HBV有低度抗病毒活性，但是在病人中，单独的rtM204V突变罕见。因此，替比夫定和克拉夫定对于发生拉米夫定耐药的病人无效。

　　2、无环磷酸盐类：阿德福韦（ADV）-原发性阿德福韦耐药突变是rtN236T和（或）rtA181T/V。rtN236T突变株对拉米夫定敏感，而rtA181T/V突变株则对拉米夫定敏感性下降。阿德福韦相关耐药突变仅仅导致EC50中度增加（2～9倍），但在病人中可观察到病毒反弹、肝炎爆发以及肝功能失代偿。阿德福韦相关突变株与替诺福韦有部分交叉耐药。阿德福韦耐药引起病毒学反弹时，如果患者改用替诺福韦治疗，血清HBV-DNA含量会有所降低，这可能是因为与阿德福韦相比，替诺福韦临床治疗的剂量较高（300mg比10mg）。rtN236T突变导致的阿德福韦耐药，其主要机制被认为是对HBV聚合酶的三磷酸盐结合位点的间接干扰。在体外实验中，恩替卡韦对rtN236T和rtA181T/V突变株保持敏感，而病例报道也证实在体内拉米夫定和恩替卡韦对阿德福韦耐药病毒株仍有效。

　　最近有报道称在对两例HBV和HIV共感染的患者体内发现与替诺福韦相关的耐药变异，在HBV聚合酶区发生了rtL180M＋rtA194T（丙氨酸被苏氨酸取代）＋rtM204V变异。在用替诺福韦和拉米夫定治疗过程中，HBV-DNA在两位患者中持续存在，但只有一位患者的血清HBV-DNA出现升高。转氨酶水平在两位患者均保持正常，这与表型测定的结果相矛盾。替诺福韦主要与拉米夫定或恩曲他滨联合用于HBV和HIV共感染患者，因此往往很难获得接受替诺福韦单一治疗病人的耐药资料。

　　3、恩替卡韦：据报道有两种不同的恩替卡韦耐药突变模式，并都已在体外实验中得到证实。一种耐药模式为rtI169T＋rtL180M＋rtM204V＋rtM250V，而另一种模式为rtL180M＋rtT184G＋rtS202I＋rtM204V。而其他的恩替卡韦耐药突变模式包括三重突变也已被检测到。在拉米夫定耐药突变不存在的情况下，rtM250V变异能导致EC50增加9倍，而rt169（I169T）、184（T184A/F/G/I/L/S）或202（S202G/I）变异则对EC50影响较小（www.fda.gov）。然而，在拉米夫定耐药突变存在时，恩替卡韦耐药变异能使病毒对恩替卡韦的敏感性下降超过100倍，特别是两个以上的变异同时出现的情况下。体外和体内实验证实恩替卡韦耐药突变株对阿德福韦和替诺福韦依然敏感，与临床报道阿德福韦治疗有效相符。

　　最近的资料显示在没有接受过拉米夫定治疗的患者中，有少于0.1%的病人存在rtL180M＋rtM204V突变，当他们接受恩替卡韦治疗时，可能会增加选择出恩替卡韦耐药突变的风险。由于单独选择出拉米夫定耐药突变株，病毒学突破可能会在接受恩替卡韦治疗的核苷类药物初治患者中出现。这些资料提示恩替卡韦耐药可能通过“二次打击”机制发生。开始时，由于与野生株相比，拉米夫定耐药突变株（rtM204V/I）对恩替卡韦较不敏感，所以被选择出来。病毒学突破通常只在附加的恩替卡韦耐药变异出现后发生，而极少在拉米夫定耐药突变单独出现时发生。

　　（二）多重耐药：核苷（酸）类药物单药序贯治疗可能导致耐药突变从起始治疗和随后治疗中被逐步选择出来。例如，先后出现拉米夫定和阿德福韦的耐药变异可以在换用阿德福韦单药治疗的拉米夫定耐药患者中检测到。最近的研究显示在单药序贯治疗的患者中能检测到多重耐药突变，并且克隆分析表明，大多数情况下，与两种药物相关的耐药变异存在于同一个克隆中。体外药物敏感性分析表明，同时具有拉米夫定和阿德福韦耐药变异的复制性克隆对于两者联合治疗的敏感性下降了超过50倍，提示两种药物的联合治疗对于多重耐药病毒无效，因此不同药物耐药突变出现在同一基因组中是令人担忧的。

　　六、对HBV耐药的监测和治疗

　　（一）对病毒学应答和突破的监测：所有接受核苷（酸）类药物治疗的乙型肝炎患者在治疗期间都应密切监测病毒学应答与突破，停药以后也应监测应答持续和病毒复发。治疗开始前应该检测血清HBV-DNA，治疗过程中每三个月检测一次。对原发性无应答的患者，应考虑替换治疗以促进临床应答和尽可能减少后续耐药。对病毒学突破的患者，应考虑患者依从性。尽可能进行病毒耐药突变的检测，以确定基因型耐药的存在和病毒耐药突变的模式。在越来越多的患者接受1种以上药物治疗的情况下，后者尤其重要。

　　（二）HBV耐药的治疗：对HBV耐药患者的治疗依赖于对既往治疗史的了解、既往疗法的应答情况、病毒突破时检测到的突变模式以及耐药突变株对不同药物敏感性的体外实验资料。最近的研究显示，与病毒反弹和生化学突破才应用补救治疗相比，在病毒学突破时就开始补救治疗更有效。

　　1、拉米夫定、替比夫定和其他左旋核苷类药物耐药：体外研究显示，阿德福韦、替诺福韦和恩替卡韦对拉米夫定和其它左旋核苷类药物耐药HBV突变株仍保持抗病毒活性，但与野生株相比，恩替卡韦对突变株的活性有实质性下降（表3）。对拉米夫定耐药病人的初步研究表明，在血清HBV-DNA下降程度上，阿德福韦单药治疗与拉米夫定和阿德福韦联合治疗类似，然而，联合疗法能更有效地降低后续阿德福韦耐药发生率。临床研究显示替诺福韦能有效地抑制拉米夫定耐药HBV突变株。尽管替诺福韦比阿德福韦更有效，但替诺福韦最适合与拉米夫定或恩曲他滨联合治疗以防止突变的产生。临床实验表明，恩替卡韦能有效抑制拉米夫定耐药HBV，但需要增加剂量（1mg/d）。已存在的拉米夫定耐药突变能增加恩替卡韦耐药的发生率，因此，对于拉米夫定耐药HBV患者，恩替卡韦并不是最佳的选择。一旦使用恩替卡韦，拉米夫定必须停药。

　　基于在替比夫定耐药病人体内检测到rtM204I突变以及体外实验数据，上述措施也适用于替比夫定耐药HBV患者。

　　2、阿德福韦：体外研究显示，拉米夫定和恩替卡韦对于阿德福韦耐药HBV突变株有效。病例研究证明拉米夫定能有效地降低阿德福韦耐药HBV患者的血清HBV-DNA水平。但是，应答的持续性，尤其对于先前出现过拉米夫定耐药的病人，尚不明确。此外，重新使用拉米夫定可能使病人较快地出现拉米夫定耐药突变。在病例研究中还发现，对于阿德福韦原发性无应答的病人，改用替诺福韦能促进病毒抑制。这可能是因为在临床应用中，替诺福韦的剂量较大。同理，在阿德福韦耐药的HBV病人中，替诺福韦能在某种程度上抑制病毒，但由于二者在体外实验有交叉耐药，故其效力有限。有报道恩替卡韦有效治疗2例阿德福韦耐药的HBV患者。

　　3、恩替卡韦：体外研究显示，阿德福韦和替诺福韦对恩替卡韦耐药HBV突变株有抗病毒活性，但有关这些药物治疗恩替卡韦耐药HBV患者有效性的临床资料还未见报道。

　　4、多重耐药HBV：对多重耐药HBV最有效的处理是通过慎重使用核苷（酸）类药物和避免使用单药序贯疗法预防其发生。因此，病变轻微的患者和那些不太可能获得持续应答的病人（如非激活状态的携带者以及处于免疫耐受阶段的HBeAg阳性患者）不应接受核苷（酸）类药物治疗，特别是上述年轻患者。如果可能，要尽量使用高效低耐药的核苷（酸）类药物，并加强患者依从性。要密切监测应答，出现原发性无应答时应更换药物。与拉米夫定单药相比，拉米夫定和聚乙二醇他干扰素或阿德福韦的起始联合治疗的病毒突破率较低，但并不能完全阻止耐药的发生。最佳联合疗法及成本效益的确定需要对其他起始联合治疗的进行进一步的研究。

　　病毒耐药突变以及患者依从性差是乙型肝炎患者治疗失败的最主要原因。随着越来越多治疗方法的出现，耐药突变的复杂性以及初始和补救治疗的选择性也在增加。因此，迫切需要标准化耐药突变的命名、用于检测和确定耐药的方法及体内外耐药资料的报告格式。这篇文章代表了北美、欧洲、亚洲和澳洲研究者的共同努力。研究组认为，信息共享不仅在研究者之间，在研究者和临床医生之间同样重要，这样研究中得到的新信息可以及时传播，在临床实践中的观察也能得到及时验证。最后，研究组希望建立关于HBV耐药突变的免费使用数据库，建立有助于共享检测技术、临床标本以及HBV分离株的方法。

Hepatology. 2007 Jul;46(1):254-65.

Antiviral drug-resistant HBV: standardization of nomenclature and assays and recommendations for management.

Lok AS, Zoulim F, Locarnini S, Bartholomeusz A, Ghany MG, Pawlotsky JM, Liaw YF, Mizokami M, Kuiken C; Hepatitis B Virus Drug Resistance Working Group.

Division of Gastroenterology, University of Michigan, Ann Arbor, MI 48109-0362, USA.

Substantial advances have been made in the treatment of chronic hepatitis B in the past decade. Approved treatments for chronic hepatitis B include 2 formulations of interferon and 4 nucleos(t)ide analogues (NAs). Sustained viral suppression is rarely achieved after withdrawal of a 48-week course of NA therapy, necessitating long, and in many cases, indefinite treatment with increasing risk of development of drug resistance. Antiviral resistance and poor adherence are the most important factors in treatment failure of hepatitis B. Thus, there is a need to standardize nomenclature relating to hepatitis B antiviral resistance, and to define genotypic, phenotypic, and clinical resistance to NA therapy.

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dickens_yu

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