子宫内传播中乙型肝炎病毒部分S区基因的变异

药罐

中华传染病杂志2000年第18卷第1期



子宫内传播中乙型肝炎病毒部分S区基因的变异



王珊珊　姜普林　彭桂福　曾年华　王志斌



　　摘　要　目的　以丈夫无乙型肝炎病毒(HBV)感染标志的4例女性 携带者与妻子无HBV感染标志的6例男性携带者及子宫内感染HBV的胎儿为对象，研究子宫内 传播中HBV S区的变异。方法　以双脱氧链末端终止法检测母儿、父儿所携HBV S区451～660位核苷 酸序列。结果　母儿、父儿间同源性98%～100%，检出491、494、530、546、581位点变异致使113、114、12 6、131、143位氨基酸替代，其中126、131、143位氨基酸变异为多。结论　子宫内传播的HBV存在S基因变异。





　　关键词：肝炎病毒，乙型；子宫内传播；S基因变异



　　乙型肝炎e抗原(HBeAg)阳性的母亲是子宫内传播的重点人群［1，2］。目前的研 究表明子宫内传播不仅包括母儿传播而且包括父儿传播［3］ ，本研究试图观察子宫 内传播中编码乙型肝炎表面抗原(HBsAg)基因区的变异情况，了解是否存在较集中的变异点 。



材料与方法



　　一、研究对象

　　1995年3月至1996年3月在湖南省某县以HBsAg筛检前来终止3月以上妊娠孕妇及其丈夫。共筛 选 506对夫妇入选49对，25例妻子阳性丈夫阴性的25例胎儿10例受染。24例丈夫阳性妻子阴性 的25例胎儿(1例双胞胎)8例受染。以4例丈夫无乙型肝炎病毒(HBV)感染标志的女性携带者与 6例妻子无感染 标志的男性携带者及其子宫内受染胎儿为研究对象。男、女性携带者以酶联免疫吸附试验(E LISA)检测HBV血清学标志与聚合酶链反应(PCR)检测HBV DNA进一步确定，均无既往肝炎史， 丙氨酸转氨 酶正常，无乙型肝炎疫苗注射史，其配偶上述方法检测HBV标志均阴性。年龄均在23～35岁 之间。取终止妊娠3月以上引产胎儿，胎儿血在产出当时采取分离血清保存于-20°C。同时 分离白细胞，无菌条件下取肝脏。以PCR检测胎儿血清、白细胞、肝脏HBV DNA任何一项阳性 则判定为子宫内感染。选择5对无任何HBV标志的夫妇及胎儿为对照。

　　二、检测方法

　　(一) HBV标志　HBsAg, 抗-HBs，HBeAg，抗-HBe，抗-HBc用ELISA检测。

　　(二) 各种标本的处理及DNA的抽提　抗凝血液标本以白细胞分离液分离白细胞，PBS反复洗 涤以除去血液中HBV的影响，恢复体积分小包装低温保存备用；肝脏标本取2 g与PBS 2 ml在 无 菌研磨器中研磨成匀浆PBS反复洗涤，加PBS 2 ml后分小包装低温保存备用；精液标本离心 将精子与精浆分开，精子以PBS反复洗涤以除去精浆中HBV的影响，恢复体积分小包装低温保 存备用。上述标本末次洗液PCR检测HBV DNA均阴性。各种细胞标本及血清标本提取DNA ［4］。

　　(三) HBV DNA检测　PCR引物合成于中国科学院上海细胞生物学研究所。引物取自HBV S区( 表1)。外引物为S 1R、BS1，扩增片段为787bp。内引物为S3、BS3，扩增片段为261bp。第一轮PCR产物1∶50稀 释作为第二轮PCR的模板，每轮PCR均设阳、阴性对照与空白对照。常规PCR方法参考文献[ HT]［4］。阳性标本以斑点杂交法确认，操作按说明书。



表1　PCR引物序列



引物 位置 序　列

S1R 842～822 5′ TTAGGGTTTAAATGTATACCC 3′

BS1 56～76 CCTGCTGGTGGCTCCAGTTCC

S3 427～448 CATCTTCTTGTTGGTTCTTCTG

BS3 687～668 GGCACTAGTAAACTGAGCCA





　　(四) 序列分析　取第二轮PCR产物以醋酸胺与异丙醇纯化，用Fmol DNA cycle sequenc ing system (promega公司)以双脱氧链末端终止法测序［4］，γ-32P- A TP购自北京亚辉公司。放射自显影后读片。结果输入计算机用DNASIS软件处理并与发表的序 列(genebank)比较。

结果



　　4例女性HBV携带者HBsAg、HBeAg均阳性。6例男性携带者中4例HBsAg、HBeAg阳性，2 例HBsAg 、抗-HBe阳性。10例胎儿仅2例HBsAg阳性。以套式-PCR(Nested-PCR)检测HBV DNA 6 2份标本阳性58份，其 中10份父、母亲血清、3份父母亲白细胞、2份胎儿血清、2份胎儿白细胞、2份胎儿肝脏、2 份精液、为第一轮PCR阳性，其余63.8%(37/58)均是第二轮PCR检测时出现阳性结果。尤其是 精子标本在第一轮均阴性。5例对照胎儿与父母各种标本均无HBV感染标志。

　　以PCR产物直接测定10例携带者与胎儿的HBV S基因第451～660位核苷酸(从HBV的EcoR1酶切 点计算)。4对母儿、6对父儿此段序列核苷酸同源性均在98%～100%。4对母儿中2例胎儿的此 段序列与母亲完全一致。另外2例在个别碱基上有变。第1对544、546位碱基母亲为A、C，胎 儿为C、A。值得注意的是胎儿的C(A)、A(C)位置上信号较弱的平行带。此外581、586位母亲 为A、C，胎儿为T、T。第4对544、546位的变化与第1对相同。544与586位的变异均为无表型 变异。546的变异使S区第131位氨基酸由苏氨酸变为天冬酰胺。581位的变异使第143位氨基 酸由苏氨酸变为丝氨酸。此段序列中4对母儿共同变异的有3个位点，499、529、530位，仅 第3对母儿在530位由A变为G致使第126位氨基酸由苏氨酸变为丙氨酸。其它均为无表型变异 。6对父儿中第3、4、5、6例胎儿的此段序列与父亲完全一致，其中第4对父亲血清、精子与 胎儿血清HBV基因两个位置均与原型株有差异，第499、508位原型株为C，此对父儿为A、G， 此变异未引起表型变化。第1例胎儿8个位点与父亲不同，491、494、505、544、546、581、 586、592位碱基父亲为T、T、C、A、C、A、C、C，胎儿为A、A、T、C、A、T、T、T。第2例 胎儿544、546位的变化与第1例相同。在这2个位点上也有信号较弱的平行带。上述位点中49 1、494位的变异使胎儿S区第113、114位氨基酸由丝氨酸变为苏氨酸，546位的变异使131位 氨基酸由苏氨酸变为天冬酰胺。581位的变异使第143位氨基酸由苏氨酸变为丝氨酸，其它位 点均为无表型变异。此段序列中父儿共同变异的5个位点即493、499、508、529及530。其中 仅第3对父儿在530位由A变G，致使第126位氨基酸由苏氨酸变为丙氨酸。



讨论



　　本研究从最大限度上排除了母儿传播的可能，初步确定出生前期可能存在HBV的父儿传播， 第4对父儿父亲血清、父亲精子与胎儿HBV在499、508位的变化一致，说明父儿间病毒在分子 水平特征相同。从本研究的结果看父亲的HBV血清学标志与发生子宫内传播似有较大关系，6 例阳 性胎儿的父亲4例HBeAg阳性，可能此种血清学标志的携带者父亲更易将病毒传给子代，这一 点与母婴传播中的情况一致［1，2］。

　　从10例子宫内感染胎儿的序列分析看，子宫内感染以父母亲所携带的HBV优势株为主(6/10 ) ，此优势株可以是原型株也可以是变异株，而父母所携检测水平以下的少数株传给胎儿的较 少(4/10)。从病毒本身来看还是以变异株为主，在传播变异株的6例中，126位变异2/6 、131 位变异4/6、131位变异合并143位变异2/6，其中126位变异株在父母代已形成可检出的优势 变异株，而131位、143位变异株在父、母代仍为检测水平以下的少数株，但传给子代后成为 可检出的优势株。这一点已在母婴传播中证实［5］。胎儿544、546位信号较弱 的平行带看，变异似是在传播过程中逐渐积累形成的。基因库的序列在126位上均为苏氨酸 ，但第3对母儿与第3对父儿为丙氨酸，其他学者也有类似研究［6］，如131位丝氨酸 到脯氨酸，134位苯丙氨酸到丝氨酸变异，当前基因库中的序列131位为苏氨酸134位为苯丙 氨酸与酪氨酸，可见当前基因库中来自中国的太少，因此建立我国的HBV基因库是乙型肝炎 预防研究中要解决的问题。

　　本研究序列测定的实验工作在全军及广东省重点实验室、第一军医大学南方医 院传染科实验室完成，对骆抗先教授的指导及实验室全体同志的帮助，谨致谢意。



作者单位：王珊珊（510507　广州,广州军区军事医学研究所）

姜普林（510507　广州,广州军区军事医学研究所）

彭桂福（510507　广州,广州军区军事医学研究所）

曾年华（510507　广州,广州军区军事医学研究所）

王志斌（510507　广州,广州军区军事医学研究所）



参考文献

1，王珊珊，肖乐义，徐德忠，等.乙型肝炎病毒的垂直传播.中华流行病学杂志，1 991，11：33-35.

2，王珊珊，姜普林，曾年华.乙型肝炎病毒的子宫内传播.中华实验和临床病毒学杂志，199 5，9：178-179.

3，赵连三，刘晓松，张智翔，等.乙型肝炎病毒感染经精子传播的可能性研究.中华传染病 杂志，1998，16：154-157.

4，Hou J, Karayiannis P, Waters J, et al. A unique insertion in the S gene of surface antigen negative hepatitis B virus Chinese carriers. Hepatolo gy, 1995, 21:273-278.

5，骆抗先.乙型肝炎——基础和临床.第1版.北京：人民卫生出版社，1996.40-43.

6，范金水，庄辉，李远贵，等.我国八城市乙型肝炎病毒S基因片段序列比较.中华预防医学 杂志，1997，31：140-143.