病毒性肝炎肝细胞凋亡及与肝纤维化的关系

药罐

中华实验和临床病毒学杂志2000年第14卷第1期



病毒性肝炎肝细胞凋亡及与肝纤维化的关系



辛绍杰　赵景民　王林杰　王松山



　　摘　要　目的　研究病毒性肝炎肝细胞凋亡及与肝纤维化的关系。方法　以原位末端标记及免疫组化检测40例慢性病毒性肝炎(CH)肝组织细胞凋亡相关线状断裂DNA以及Fas抗原、转化生长因子β1(TGF-β1)、Ⅲ型前胶原肽(PⅢP)在肝组织中的表达；以酶联免疫吸附测定(ELISA)检测血清可溶性Fas(sFas)及TGF-β1。结果　CH肝细胞DNA损伤与肝组织Fas抗原、TGF-β1表达及血清sFas、TGF-β1水平明显相关(r＝0.6219，0.5368，0.5564，0.5996。P<0.05～0.01)；重度CH及肝硬变患者DNA损伤程度明显高于轻度CH患者，且与肝组织PⅢP、TGF-β1的表达明显相关。结论　sFas可能也是促进肝细胞凋亡的因素之一。在肝细胞凋亡的同时伴有胶原等细胞外基质合成的增加，而TGF-β1在细胞凋亡与肝纤维化之间可能起着极为重要的桥梁作用。





　　关键词：肝炎，慢性活动性　脱噬作用　肝硬化



　　为了解慢性病毒性肝炎(CH)肝细胞凋亡的发生机制及与纤维化关系，我们以原位末端标记(TUNEL)及免疫组化检测了细胞凋亡相关线状断裂DNA、Fas抗原、转化生长因子β1(TGF-β1)、Ⅲ型前胶原肽(P Ⅲ P)在肝组织中表达，同时以ELISA检测血清sFas及TGF-β1，探讨了CH肝细胞凋亡及与肝纤维化的关系。



1　材料和方法



1.1　研究对象及诊断标准　40例病人均为302医院住院病人。男性34例，女性6例，年龄15～73岁。按照1995年北京第五次全国传染病与寄生虫病学术会议修订的病理诊断标准，其中CH轻度18例，中度11例，重度5例；肝硬变6例，均为死亡患者。病原学诊断，乙型肝炎31例，丙型肝炎6例，乙丙重叠感染3例。肝穿活检前后2 d空腹抽血，24 h内分离血清，-20℃冻存备用。死亡患者死后立即肝穿，同时留取静脉血或心血分离血清。

1.2　主要试剂及方法　TUNEL试验主要试剂与方法：末端脱氧核糖核酸转移酶(TDT)、生物素化dUTP(Bio-11-dUTP)分别为Progema公司、Sigma公司产品，亲和素-辣根过氧化物酶(Avidin-HRP)购自华美生物工程公司。方法按文献［1］进行。阳性对照片标记前以0.7 mg/ml DNase Ⅰ室温处理10 min；阴性对照片不加TDT。结果判定参照文献［2，3］按-、+、+　+、+　+　+作半定量记分。肝组织免疫组化采用ABC法，ABC试剂盒购自华美生物工程公司。抗人Fas抗体购自中山公司，结果判定同TUNEL。兔抗人TGF-β1为美国ZYMED公司产品，抗人PⅢP抗体为Sigma公司产品。用彩色医学图像分析仪对切片进行图像处理，以百分比表示阳性反应所占比例。

1.3　血清sFas和TGF-β1的检测　采用ELISA法，试剂盒为美国Genzyme公司产品，操作按说明书。



2　结果



2.1　肝细胞凋亡与肝组织及血清Fas、TGF-β1表达的关系　表1结果表明，肝细胞凋亡与肝组织及血清Fas、TGF-β1表达明显相关。



表1　肝细胞凋亡与肝组织及血清Fas抗原及TGF-β1表达关系(x±s)

Tab.1　Correlation between the apoptosis of hepatocytes and the expression of Fas and TGF-β1 in serum and liver tissue(x±s)



TUNEL试验

TUNEL test 例数

Cases 肝组织Fas表达

Expression of Fas

in liver tissue 肝组织TGF-β1

Expression of TGF-β1

in liver tissue 血清sFas(ng/ml)

Level of sFas

in serum 血清TGF-β1(ng/ml)

Level of TGF-β1

in serum

- 7

0.89±0.20 6.44±3.52 15.71±5.48 16.88±7.66

+ 21 1.09±0.83 8.32±5.87 18.55±7.13 18.71±8.48

+　+ 9 1.42±0.75 16.39±6.41 23.17±10.50 32.15±12.13

+　+　+ 3 1.83±0.55 29.45±12.04 26.33±11.48 46.47±20.50

r? 　 0.6219 0.5368 0.5564 0.5996



　　*Spearman秩相关检验,P<0.05

　　　Spearman's test, P<0.05



2.2　肝细胞凋亡与肝纤维化关系　表2结果表明，肝细胞凋亡程度与肝纤维化程度及TGF-β1、PⅢP在肝组织中的表达明显相关。



表2　肝细胞凋亡与肝纤维化关系(x±s)

Tab.2　Correlation between apoptosis of hepatocytes and liver fibrosis(x±s)



病理诊断

Pathological diagnosis 例数

Cases TUNEL试验

TUNEL test 肝组织PⅢP表达

Expression of PⅢP in liver tissue 肝组织TGF-β1表达

Expression of TGF-β1 in liver tissue

S0-S1 18 0.83±0.62 6.58±2.13 9.47±3.55

S2-S3 11 1.00±0.63 11.75±5.91 11.22±4.34

S4+Lc 11 2.00±0.71 19.53±7.82 29.45±9.85

F 　 11.1000* 7.3954** 9.1342**



　　　　　*P<0.01, **P<0.05

3　讨论



　　目前对慢性病毒性肝炎细胞凋亡机制的研究较多的是Fas-Fas配体系统。Fas抗原在肝细胞凋亡中起重要作用［2，3］。我们的结果表明，CH肝细胞凋亡与肝组织Fas抗原、TGF-β1表达及血清sFas、TGF-β1水平明显相关(表1)，提示影响CH肝细胞凋亡是极为复杂的，同时证明在CH sFas可能并不阻断细胞凋亡，而是促进肝细胞凋亡的因素之一。CH肝细胞凋亡的意义尚不十分清楚，DNA损伤程度与肝纤维化程度及肝组织PⅢP、TGF-β1的表达明显相关。PⅢP是Ⅲ型胶原生成细胞的标志［4］，提示在肝细胞凋亡的同时伴有胶原等细胞外基质合成的增加，因此在CH发病机制中细胞凋亡可能与CH肝纤维化的发生有密切关系。TGF-β1与肝纤维化有密切关系，可能通过刺激星状细胞，大量合成细胞外基质，最终导致肝纤维化［4］。同时TGF-β的激活是肝细胞再生终止信号之一［5］，TGF-β是肝细胞发生凋亡的启动因子［6］，本文结果显示TGF-β1与肝细胞凋亡及肝纤维化均有密切关系。因此TGF-β1在CH细胞凋亡与肝纤维化之间可能起着极为重要的桥梁作用。



作者单位：辛绍杰（100039　北京，解放军302医院三科）

　　　　　赵景民（100039　北京，解放军302医院三科）

　　　　　王林杰（100039　北京，解放军302医院三科）

　　　　　王松山（100039　北京，解放军302医院三科）



参考文献



1，Nakagawa S, Shiraishi T, Kihaa S, et al. Detection of DNA strand breaks associated with apoptosis in human brain tumors. Virchows Arch, 1995,427:175-179.

2，秦波，张定凤，马英，等.乙型肝炎患者肝组织Fas/FasL表达及其在肝细胞凋亡中的作用.中华肝脏病杂志，1997，5：88-90.

3，朱幼芙，骆抗先，何海棠，等.慢性乙型肝炎肝细胞Fas表达和凋亡.中华肝脏病杂志，1997，5：86-87.

4，徐冬波，翟为溶，周莜梅，等.细胞因子TGF-β1、PDGF-BB、bFGF在人肝纤维化中的作用. 上海医科大学学报，1996，23：203-206.

5，Fausto N. Hepatocyte apoptosis: is transforming growth factor--B1 the kiss of death? Hepatology, 1993,18:1536-1537.

6，Oberhammer F A, Pavelka M, Sharma S, et al. Induction of apoptosis in cultured hepatocytes and in regressing liver by transforming growth factor β. Proc Natl Acad Sci U S A, 1992,89:5408-5412.