融合基因“智斗”肝硬化

DNA

   世界第一个治疗肝硬化的融合基因，终于在实验室里诞生，尽管它小到我们用肉眼根本无法看到，但它却承载着人类太多的希望肝硬化这一世界医学难题有望攻克！这是刚刚从哈尔滨医科大学第一临床学院传来的好消息。我国著名肝脾外科专家姜洪池教授与博士生代文杰在世界上首次采用融合基因防治肝硬化获成功，引起医界广泛关注。今天就让我们走进这间实验室，共同体味一下医学研究的艰辛与乐趣吧。



承载生命希望的答辩



   当你走进哈医大一院宽敞明亮的普外科实验室，一群体态浑圆，毛色光亮的大鼠，便会透过笼子向你投来新奇的目光。要知道，此前不久，这群大鼠还在肝硬化的折磨下苟延残喘呢。那么，是什么让它们起死回生的呢？在博士生代文杰刚刚结束的论文答辩会上，我们找到了答案。



   参加代文杰博士的论文答辩，就好象是在看一场别开生面的“科技电影”，这部叫做《人白细胞介素—10与人肝再生增强因子融合基因靶向表达与抗肝硬变作用》的“影片”，说的是这位年轻的博士生为了实现治愈肝硬化的梦想，在导师的指导下，如何寻找融合基因并利用它为一群老鼠治疗肝硬化的过程。参加论文答辩的专家们都被课题研究者新颖独特的构思、清晰严谨的技术路线、先进的实验手段和可靠的实验结果所折服，纷纷称赞这一科研成果为人类肝硬化的基因防治“趟”出一条路，也让世界亿万肝脏病人看到了生命的曙光。



可怕的肝硬化



   大家都知道，壁虎的尾巴断了，很快便能长出一个相同的新尾巴。人类的肝脏也同样具有这种快速的再生功能，稍有风吹草动（肝部分切除、中毒、肝炎病毒感染）便会引起肝细胞数量的增加、功能的更新以及肝组织结构的变化。不同的是肝脏再生的结局与壁虎的尾巴截然相反。因受伤而“房倒屋塌”的肝细胞，就好比是一个个需要修缮的“蜂巢”，可机体向肝细胞派出的“维修队”，却没有蜜蜂的群体那么齐心合力，一些偷工减料的“维修队”会肆无忌旦地用一些“假冒产品”———纤维结缔组织，来填充和取代那些受伤的肝细胞和肝小叶，而使修复后的肝细胞面目全非，最终整个肝脏便会象疤痕修复后的皮肤那样，被“维修”成又硬又小的“石头工程”。至今为止，世界上还没有哪一种药物能够成功打击这些“假冒伪劣”者，扼制肝硬化结局的发生，这便是肝硬化的可怕之处。



   据世界卫生组织1987年报告，全世界肝硬化人群的平均发病率为17．1／10万，而且近10年来病死率仍在不断上升。中国是世界人口大国，也是肝病大国，由于病毒性肝炎的广泛传播，以及嗜酒“瘾君子”队伍的不断扩大，肝硬化已经成为我国常见疾病和主要死亡原因之一。在我国每年内科总住院人数中，肝硬化病人就占4．3％－14．2％，发病的高峰年龄正是年富力强的青壮年（35－48岁），而且男性占其中大部分（男女比例为3．6－8∶1）肝硬化已经像癌症一样成了百姓心中无法预防、无药可救的顽症。专家们也将其视为医学领域不可扼制、无法逆转的一大治疗难题。而近代可以明显提高晚期肝硬化存活率的肝移植手术，又因供体匮乏，费用高昂而难以普及。因此，为肝硬化寻觅更为有效的治疗方法和途径，便成为众多临床医学科学家的梦想。

随着基因工程技术的发展，基因治疗为临床医学科学家圆梦提供了较为理想的研究平台。一向紧跟国际医学研究热点，曾成功实施世界首例同种异体劈裂脾移植的全国著名肝脾外科专家姜洪池教授，于1998年将26岁的博士生代文杰，托举到了基因治疗这个当今医学研究领域的最高起点。



突发奇想的灵感



   1998年代文杰在查阅和检索了大量国内外文献后，根据肝细胞修复过程中“优劣”因子双方的相互作用，大胆提出向肝细胞内导入优势外源基因，去伪打假、保护肝脏的研究思路。肝脏的损伤和修复是由促使肝脏纤维化、硬化的诸多因子，以不同的角色、在不同的时间参与的。如果治疗时仅派一种外源基因进入，可能会因势单力薄而难以阻止或逆转肝脏纤维化和硬化的进程。而同时选派多种基因联合进入，单基因之间的相互影响在理论上又不好界定。就在代文杰百思不得其解时，一个突发奇想触动了他的灵感：能否将功能各异的几种基因融合成为一体，使其成为可发挥多重因子作用的高效、多功能的“特种维修队”呢？至此，一个采用融合基因治疗肝硬化的创意便在他的脑海中形成了。（史凤芝）



   这一创意非同小可。因为在当时世界医学研究领域里，单基因的治疗研究刚刚起步，联合基因治疗肝硬化还属空白，代文杰想一步跨过单基因、联合基因两个台阶，直接进入高难度的融合基因治疗研究，不仅成败难料其难度和压力也可想而知。



融合基因



   面对诸多抗肝硬化的因子，选择谁来做研究的对象呢？经过一番筛选和对比，有两个在肝细胞修复过程中起着重要作用的抗肝硬化因子，人白细胞介素－10（ⅠL－10）因子和人肝再生增强因子（ALR）吸引了代文杰的视线，它们一个可以阻断肝细胞硬化的进程，一个可以刺激硬变肝脏中肝细胞的再生。而更重要的是这两个基因的片段都不很长，融合后继续保持较高的基因表达效率是完全可能的。因此，设法将IL－10和ALR基因合二为一，便成为代文杰实现科研梦想的第一步。



   巧妇难为无米之炊。没想到实验一开始，代文杰便遇到了无米下锅的难题。该课题实验所需的基因样本，国内外仅有少许几家科研机构拥有，代文杰在多方求助无果的情况下，一头扎进实验室，咬紧牙关背水一战。他一次次地抽出自己的血，一遍遍地进行着分离、培养、提取、克隆、测序……三个月后，几度失败的代文杰，终于成功克隆出了实验所需的基因———人白细胞介素－10。此举不仅为东北三省基因克隆的研究添补了一项空白，也为下一步的基因融合备足了“原料”。



   有了“原料”的代文杰立刻马不停蹄地进入了基因融合的研究。然而，要想把两个毫不相干的基因融合在一起，可不像我们平时接个线头那么简单。两个基因的接头处一但错位，融合基因的整体结构排序便会因错位而“乱码”，以此为模板翻造出来的“产品”（蛋白质）也将必错无疑。可喜的是，经过两个月复杂分子生物学操作，代文杰终于将IL－10与ALR这两个功能不同的活性因子巧妙地分隔并连接在了一起，世界第一个治疗肝硬化的融合基因终于“诞生”了！



成功建立模型



   代文杰成功克隆融合基因并将其制成重组质粒的过程，就好像是一个摄像师将演员的表演摄在了录像带上一样。但若想将融合基因这盘“录像带”成功地转移到肝细胞内，并保证它在其中稳定、持久、可控地“放映”，还需要一个高效、持久、安全、实用的“放像机”，也就是基因转移载体。



为此，代文杰又苦熬了近两个月，克服了基因酶切位点的选择、基因片断衔接时正反向的判定等一系列难题，终于将融合基因成功地“装”进了“放像机”（真核表达载体）中。并开始为融合基因出台“表演”准备“屏幕”了（大鼠肝纤维化和肝硬化模型）。



  开始为大鼠注射药物的时候，代文杰低估了老鼠的反抗能力，结果双手几次被这些小家伙咬破了。后来代文杰干脆做了一个乙醚麻醉罐，每次注射前都要先请鼠入罐“麻”它一下，再打针时老鼠就老实多了。从此，几乎每隔一天，代文杰就要从另一个实验室赶回医院，在那面一人高的“鼠笼墙”前，为他饲养的近四百只大鼠逐—麻醉、称重、注射。四个月后，代文杰终于完成了基因克隆、融合和大鼠肝硬化模型的建立，并依据大鼠肝脏病变的程度，建立了科学的病理学分级，为实现从体外实验到体内实验的跨越，欣赏外源基因在老鼠体内的精彩表演（基因表达），准确评价基因治疗的效果奠定了基础。



成果展望



  自从代文杰将第一针装载着融合基因重组质粒的“药液”通过肌肉注射到被肝病折磨得瘦骨嶙峋、毛色晦暗、倦缩一团的大鼠体内那天起，代文杰的心里便一直忐忑不安。随着基因治疗次数的增加，融合基因在大鼠肝细胞内开始了连续不断地、高质量地“表演”，大鼠的病情也一天好似一天，特别是那些肝硬化大鼠，体重眼瞅着一天天地增加，晦暗的毛色也逐渐变得光亮柔顺了，捉它们时又能叽叽喳喳地满笼子乱跑了。随着课题研究渐入尾声，令代文杰和导师兴奋的科研数据（血液、病理解剖等）也接踵而来，病鼠的血清肝功酶学检查及病理解剖的数据表明，输入的外源基因已经成功阻止了致病因素对肝细胞的继续破坏，病鼠的肝纤维化向肝硬化演变的进程明显延缓，肝细胞修复再生的质量以及肝硬化大鼠的存活率显著提高。



   这一结果可谓石破天惊！因为，在此之前世界上还没有哪一种药物和治疗手段，能像基因治疗这样全面、快速、有效地阻止肝脏病变、刺激肝细胞再生和延缓肝脏硬化的进程。



   然而在世界的东方，在改革开放的中国，终于打开了基因治疗肝硬化这扇科学之门。相信该研究的成功创意不仅为今后肝硬化的基因治疗奠定了坚实的理论和实验基础，还将有力地撞击各学科基因治疗的“多米诺骨牌”，推动人类基因治疗的进步与发展。基因治疗造福于人类将指日可