3. MTT法检测细胞的抑制率:取对数生长期的HepG2、QSG-7701细胞以4×103/孔传入9孔培养板,孵育24h后每孔加入不同药物浓度(0.1、1.0、10μmol/L)的罗非昔布100μl(对照组中加等量等渗盐水,选药浓度依据为其血药峰值浓度的0.1~10倍),分别于加药后12、24、48、72h检测细胞活力。按公式“细胞增殖抑制率(%)=1-实验组A值/对照组A值×100%”计算不同药物浓度和作用不同时间的罗非昔布对细胞的增殖抑制率。 4. 流式细胞仪检测细胞凋亡:常规消化不同浓度、作用不同时间的细胞,离心收集固定后的细胞,用磷酸盐缓冲液(PBS)清洗。加入500μl结合缓冲液重悬细胞,立即加入AnnexinⅤ-异硫氰酸荧光素(FITC)和碘化丙啶(PI)各5μl,100μg/ml的核糖核酸酶A的溶液中重悬细胞沉淀, 流式细胞仪检测细胞凋亡率。 5. 免疫细胞化学检测:用罗非昔布作用不同时间的HepG2、QSG-7701细胞分别涂片,晾干,95%乙醇固定,PBS冲洗,再滴加正常非免疫动物血清。接着分别加Bcl-2和Fas的第一抗体、第二抗体,二氨基联苯胺(DAB)染色,苏木素复染,PBS冲洗,光学显微镜下计数。表达强度的判断:Bcl-2、Fas基因表达阳性表现为细胞质黄褐色染色。选取连续5个视野(×400)作为观察区,求5个视野内阳性细胞数的平均值。Bcl-2和Fas基因阳性表达的标记指数(LI)根据以下公式计算:LI=阳性细胞数/计数细胞总数×100%。 6. 逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测:取处于对数生长期的HepG2及QSG-7701细胞,提取细胞总RNA,合成cDNA,然后以cDNA为模板进行PCR扩增、电泳。将含有产物条带的电泳图谱扫入电脑,以“凝胶分析软件”对条带进行分析,读取其积分吸光度值,以Bcl-2和Fas平均积分吸光度值/β-肌动蛋白平均积分吸光度值来表示相对表达强度。其中引物根据Bcl-2和Fas基因自行设计,由上海申能博彩生物工程公司合成,预期产物大小为298、316bp。Bcl-2引物序列上游:5′-GGATG TTCTGTGCCTGTAA-3′,下游:5′-TTCTCAACCCTTG AAGTCTA-3′;Fas引物序列上游:5′-GCCATAAGCC CTGTCCTC-3′,下游:5′-TGAGTGGTCGTTGTGGTT-3′。 7. 统计学分析:数据由WStata统计软件进行方差分析。 |