慢性肝病与成体肝干细胞

2002落叶

尽管肝细胞可以从概念上被看作单能干细胞，对于成体肝脏中是否存在肝干细胞或肝前体细胞一直争论了6O余年。 现在普遍认为成体肝脏中存在类似于动物致癌、损伤模型中卵圆细胞的肝前体细胞，本文就近年文献报道的慢性肝病中肝前体细胞研究作一综述。

一、肝细胞与干细胞

     正常成体肝细胞是具有合成和代谢功能的高度分化细胞，本身具有增殖和分化潜能。成年哺乳动物肝组织非常稳定(单个肝细胞寿命可超过1年)，正常状态下极少有肝细胞增殖。但在肝实质损伤(如CC14中毒)，尤其是肝大部切除后，肝组织可通过高效的自我增殖来修复肝脏，啮齿类动物在2／3肝切除后1O天即可恢复原肝体积，并重建肝小叶结构。体外培养的成体肝细胞在一定条件下可表达不同胚层(间叶、神经、造血)前体细胞标记(如CK7、connexin 43、NCAM、AFP、nestin、Thy1) 表明成熟肝细胞巨大的可塑性和分化潜能，肝细胞可以看作成体单能干细胞。近6O年对这种再生过程已了解得相当详尽，目前主要集中于从分子水平揭示肝细胞的增殖调控机制。慢性肝炎中也存在肝细胞再生，利用病毒感染动力学数学模型，可以估计出慢性肝炎每天有0．3 ～3 的肝细胞(约10⁹个)死亡，剩余肝细胞增殖以保持肝细胞总数的稳定；慢性乙型和丙型肝炎肝细胞增殖水平与细胞消亡水平基本一致，增殖细Ki-67阳性率为1%～14%。这种持续的增殖过程随着慢性丙型肝炎组织损害的加重而逐渐加强，一直到发展为肝硬化时，肝细胞增殖速率才开始回落。Marshall对这种增殖速率回落的解释是此时肝细胞分化潜能已过极限，增殖能力开始衰退。Clouston认为HCV感染导致的肝细胞再生受阻，加之肝脂肪变性加剧，引起肝前体细胞(卵圆细胞)活化，用p21和Ki-67标记肝细胞增殖状态，发现肝细胞增殖受阻与肝前体细胞增殖增加相关。这种肝前体细胞增殖被描述成“胆管反应”(ductular reaction，DRs)，类似于肝再生和肝癌动物实验模型中的卵圆细胞。

二、肝前体细胞

      (一)卵圆细胞 近年对人肝病中肝前体细胞的研究或多或少受到动物模型的启发。1944年Opie用化学致癌剂诱导啮齿类动物门管区胆管网细胞增生，1955年Farber首先将其描述为卵圆细胞(oval cel1)。19 8年Wilson首次用电镜观察卵圆细胞，发现细胞内张力微丝和细胞间连接结构，认为二者是卵圆细胞区别于肝内其它细胞的典型特点。常用方法是利用肝毒性药物2一乙酰氟胺、dipin等抑制或消除残余肝实质细胞的再生能力，继用2／3肝切除诱导肝再生，此时由于肝实质细胞增殖受抑制，导致卵圆细胞的增殖和分化为肝实质细胞。肝卵圆细胞的增殖也常见于P21CIP1／WAF1转基因小鼠，此种基因的过度表达常导致肝细胞生长受阻。人和动物模型中卵圆细胞的特点是细胞小，约为正常肝细胞的1／4至1／2大小，核大而胞浆少，呈圆形，核染色质以常染色质为主，内质网、核糖体、线粒体均不发达，表现出原始幼稚未分化细胞的超微结构特征，在酶化学、免疫组织化学、分子生物学方面同时兼备肝细胞和胆管细胞的表型特点，同时还具有表达多胚层(造血、神经、间叶)前体细胞标记物的潜能。Suzuki用流式细胞仪和单细胞分析技术分离肝干细胞，体外培养后移植到胰腺，能分化成胰腺腺泡和胆管上皮，证明其还可以向胰腺分化。普遍认为卵圆细胞是肝干细胞到成熟肝细胞的中间体，主要来源于Hering管。1999年以后有学者认为存在骨髓、胰腺来源的肝干细胞 。

      国内胡锡琪1987年曾报道在6例重度慢性活动性肝炎肝组织坏死背景上可见活跃的卵圆细胞增生。De Vos(1992年)也在慢性肝炎组织中观察到了卵圆细胞增生。Fa1kowski通过对830例不同肝硬化组织观察其间隔内的肝细胞(Intraseptal hepatocyte，ISHs)，有775例(94％)ISHs出现与CK19阳性的胆管反应有关系，并对ISHs和胆管树结构进行三维重建图像分析(3D-reconstruction)发现，ISHs是从胆管树直接以“生芽”方式形成。现已发现人慢性肝病组织如肝硬化、亚大块肝坏死后肝再生、儿童先天性肝外胆道闭锁、遗传性血色病、慢性病毒性肝炎、原发性肝癌中都存在类似于卵圆细胞的肝前体细胞。这种肝前体细胞定位于汇管区、纤维间隔、汇管区旁肝实质、假小叶及炎症边界。各种慢性肝病导致的肝细胞再生受阻，使肝前体细胞通过不同中间状态的子代细胞最终分化成肝细胞和胆管上皮。根据超微结构特点可分为三型 (见表1略)。

    Lowes KN的研究证实卵圆细胞数目与慢性肝病的严重程度密切相关，病情越重，卵圆细胞数就越多，增生就越活跃_l 。邱德凯[20]探讨了卵圆细胞数目与慢性肝病肝纤维化分级的关系，发现卵圆细胞主要存在于肝组织的汇管区和纤维间隔内，卵圆细胞数目与肝纤维化分级显著正相关(r=0．88，P<0．01)。Clouston AD对115例慢性丙型肝炎进行研究，用P21和Ki一67标记肝细胞和卵圆细胞，对与卵圆细胞增殖原因进行多元相关性分析，统计学结果显示：胆管反应面积与纤维化程度正相关(r-O．453，P< 0．001)；肝前体细胞的数量与胆管反应面积(r-O．624，P<0．001)、纤维化(r=0．544，P< 0．001)均相关；脂肪变和肝前体细胞的数量(r-O．372，P=0．004)、胆管反应(r=O．374，P< 0．001)相关；P21测出肝细胞增殖受阻单独与肝前体细胞增殖增加(P=0．02)、体重指数增加相关(P< 0．01)、小叶炎症(P—O．05)相关。Fotiadu A也用94例慢性病毒性肝炎做出相似结果，肝前体细胞的数量与分级(HAI，炎症的组织学活动指数)、分期(纤维化程度)平行ll 。在重症肝炎胆管反应区域远大于普通急、慢性肝炎；亚急性、慢性重症肝炎胆管反应区域又大于急性重症肝炎，并且肝炎程度不同，再生现象也不一样。急性肝炎(G1—2)再生主要是肝细胞，慢性(G3—4)则有肝前体细胞参与，但肝前体细胞不是直接分化成各种成熟形态，而是形成各种中间或转化形态，表现为胆管样卵圆细胞和小肝细胞ll 。另外，各种疾病引起的胆管反应和卵圆细胞增生表达模式并不完全相同，如DMBT1在慢性乙型肝炎肝组织的卵圆细胞中表达，但在原发性胆汁性肝硬化、原发性硬化性胆管炎及一些胆管阻塞性疾病不表达。目前，因缺乏肝干细胞特异的分子标记，对实验模型、成体肝干细胞的认识主要依赖一系列标记物(见表2略)。

(二)小肝细胞

     有学者从大鼠的肝脏中分离到一种“小肝细胞”(small hepatocyte)，大量的形态学研究证实了人病肝中也存在一种小肝细胞，多个实验小组认为这种“小肝细胞”就是肝干细胞或与肝干细胞有密切联系。这些细胞大都具有克隆化长能力，体外培养时具备干细胞表型，但是它们在肝脏中的定位及起源仍不明确。Roskams T在对2O例亚大块肝坏死及3O例胆管阻塞性疾病研究中发现，在肝再生后期及淤胆时除了胆管反应，还有一个明显特征就是出现肝细胞样的中间体细胞(又称为过渡细胞)，这种细胞比成熟肝细胞小，嗜碱性，表达OV6、CK7、CgA，在亚大块肝坏死肝再生中随着时间推移PSC：原发性胆汁性肝硬化；PBC：原发性硬化性胆管炎；HBV：慢性乙型肝炎；HCV：慢性丙型肝炎；SH：重症肝炎；FNH：局灶性结节性增生；MHN：大块状肝坏死；ALD：酒精性肝病；EHBA：肝外胆道闭锁；FHF：爆发性肝衰竭；LC：肝炎后肝硬化；GH：遗传性血色病．数量越来越多，且延伸进入小叶，而在淤胆进展期，这种细胞越来越少，形成汇管区旁玫瑰花结状或呈簇状排列，由此认为至少有部分肝细胞样的中间体细胞是由肝前体细胞或卵圆细胞活化分化而来。Hu ZJ也在59例重症肝炎的研究中描述过这种小肝细胞，表达c-Kit、GST-P、CK18，但是CK19、CD34、AFP均为阴性，和其中出现的卵圆细胞表型相似，但卵圆细胞CK19为阳性。在人局灶性结节性增生组织附近也发现有类似小的未成熟肝细胞，常规HE染色很难区别二者，这些细胞表达OV6、CK7、CgA、CK19，偶尔表达CD56。有学者认为胚肝发育晚期，肝母细胞要先发育成小肝细胞，然后才能到成熟肝细胞，而在成体，小肝细胞是由卵圆细胞分化而来。

(三)骨髓源肝干细胞

     1999年Petersen BE提出部分卵圆细胞来源于骨髓，他们将Y染色体sry区DNA探针标记的雄性供体骨髓细胞移植到经致死剂量照射的雌性受体大鼠，受体大鼠经2一乙酰氟胺和CC14处理造成急性肝损伤，在雌性受体大鼠肝中可见带有雄性sry标记的肝细胞。Alison MR发现，接受男性骨髓移植的女性患者体内出现了男性肝细胞。分析表明，它们是由捐赠骨髓中的造血干细胞发育而成。胚胎造血干细胞最早出现于卵黄囊，首先移居肝脏，最后定居于骨髓。慢性肝病中卵圆细胞可以和造血干细胞共表达许多标记物如c-Kit、CD34、Thy-1等，肝源性有丝分裂原一肝细胞生长因子也可以是造血干细胞生长因子，均证实了骨髓与肝脏的联系。

(四)肝干细胞与胰腺

     人胚胎发育中肝脏肝憩室形成于第4周，位于前肠末端腹侧壁，胰腺腹胰芽形成于第4周末，位于前肠末端腹侧近肝憩室的尾缘，同是来源于前肠内胚层，因此具有相似的胚胎起源。前述肝干细胞可以向胰腺分化，同样，胰腺干细胞也可以分化成肝细胞。Zulewski H等从人的胰岛分离出来表达nestin阳性干细胞置于适当的培养体系中，这些nestin阳性干细胞可分化成肝细胞。

三、结语

     在慢性肝病中不仅有肝细胞参与肝脏修复，还存在类似于动物致癌、损伤模型中卵圆细胞的肝前体细胞，这些细胞的活化与临床慢性肝病的发生发展密切相关。成体肝脏内存在具有干细胞潜能的细胞这一观念已被普遍接受。目前对成体肝干细胞的认识主要依赖一系列标记物，尚无肝干细胞特异的分子标记，所以对成体肝干细胞的来源、定位、生物学特性、开发前景的认识有待深入研究。