-- RNAi干扰抑制乙型肝炎病毒的研究进展
解放军第458医院全军肝病中心 孔祥平 任向荣
一、RNAi的机制 RNA干扰（RNA interference, RNAi）是1998年2月华盛顿卡耐基研究院的Fire和马萨诸赛大学癌症中心的Mello在《Nature》上提出的新概念，它是指由双链RNA(double strand RNA, dsRNA)介导的序列特异性的基因沉默（gene silencing）。这一机制首先在线虫内发现，随后，人们在真菌、拟南芥、锥虫、水螅、涡虫、斑马鱼等几乎所有真核生物中，甚至在大肠杆菌中也发现了类似RNAi的机制。RNAi在进化上非常保守，是真核生物中普遍存在的抵抗病毒入侵、抑制转座子活动、调控基因表达的监控机制。 RNAi一经发现，迅速成为生物学研究领域最为活跃的热点之一，《Science》在2001年将其列为十大科学成就之一，2002 年又将其列为十大科技之首； 《Nature》也将小RNA评为2002年度最重要的科技发现之一。 随着广泛深入的实验研究的进行，人们对RNAi的机制有了初步的了解。 对RNAi机制的认识主要来源于果蝇和线虫的研究成果（图1）。2000年，Zamore等在果蝇胚胎提取物中检测到～22-nt的小分子双链RNA片断，揭开了RNAi机制研究的序幕。根据生物体的不同，RNAi的诱导物可以是各种分子，包括长链dsRNA，质粒产生的小发夹RNA（short hairpin RNA, shRNA）或者内源性发夹样小RNA（hairpin micro RNA, miRNA）。目前认为RNAi的主要过程为：①RNAi的诱导物在细胞质内被RNaseⅢ Dicer切割成为21-23nt的小分子干扰RNA（small interfering RNA, siRNA），siRNA的结构特征是5\'端单磷酸，3\'端羟基，而且3\'端有2～3-nt的碱基突出；②siRNA与RNA诱导的沉默复合体（RNA-induced silencing complex, RISC）结合，随后被解链成为单链RNA；③siRNA中的反义链（antisense strand）引导RISC找到目的mRNA，并且按碱基配对原则与之结合；④RISC内的RNA内切核酸酶将靶mRNA切断（切割位置在siRNA的中央，距离5\'端10-nt），从而抑制目的基因的表达。miRNA导致基因沉默的机制与此稍有不同，它们与靶mRNA 3\'非编码区（untranslated region, UTR）通过不完全互补结合，抑制翻译过程和蛋白质的合成。但也有研究表明，miRNA可以与siRNA一样通过介导mRNA的切断来抑制基因表达。
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二、RNAi对HBV的抑制 作为一种快速、有效、特异的抑制基因表达的工具， RNAi的应用主要集中在三个方面：基因功能的研究，肿瘤的治疗和病毒性疾病（主要是艾滋病和肝炎）的治疗研究。以下着重介绍 RNAi抑制乙型肝炎病毒的进展。 乙型肝炎病毒（ hepatitis B virus, HBV）是嗜肝DNA病毒，其基因组结构独特，呈不完全闭合的双链形式，负（－）链为全长基因，约含3200个核苷酸，正（＋）链是负链长度的20～80%，病毒颗粒内含有DNA聚合酶。在所有已知可感染人体而且具有独立复制能力的双链DNA病毒中，HBV基因组是最小且最高效的。它具有以下4个鲜明特点：①不完全双链环状结构；②利用重叠的开放读码框（open reading frame, ORF）编码多个蛋白质；③所有调控序列均位于蛋白质编码区内；④基因序列具有多变性。HBV至少含有4个ORF, 即S区（包括preS1、preS2及S）、C区(包括preC和C)、P区和X区，ORF之间互相重叠。编码长度分别为3.5kb、2.4kb、 2.1kb和 0.7kb的4种转录子，共用一个PolyA加尾信号。 HBV的复制过程需要以转录的RNA为模板，3.5kb的前基因组mRNA比基因组的全长（3.2kb）还要长，包含了基因组的全部信息，既是翻译Pol蛋白、HBcAg和HBeAg的模板，也是基因组复制的模板。由于RNAi 的作用靶点是 mRNA，因此，从理论上讲，HBV基因组上的任何一段序列都可以成为RNAi的靶点，而不用顾及是不是在编码框内。同时，HBV 的4个ORF互相重叠，4条转录子共用一个PolyA位点，这使得在某些位点的siRNA可以同时攻击到2条或以上甚至是所有的mRNA，从而抑制多个蛋白的表达。HBV基因结构的这种特殊性为RNAi抗病毒提供了有利条件。 RNAi可能通过2种途径抑制HBV的复制：①抑制蛋白质的表达。RNAi能够抑制病毒聚合酶、核心抗原和表面抗原的表达，而这些蛋白对于病毒复制至关重要，没有它们，就不能完成病毒复制的过程。②降解3.5kb mRNA。3.5kb mRNA是病毒复制过程中逆转录的模板，由于它包含了HBV基因组的所有信息，所有针对HBV的siRNA都能与之特异性结合，继而对其切割，病毒的复制就会受到抑制。 自2003年以来，国内外陆续发表三十篇左右的文章，表明RNAi能有效抑制HBV的蛋白表达和病毒复制。这些实验结果有细胞水平的，也有动物水平的，有用合成的siRNA的，也有用载体细胞内表达siRNA的。针对的靶点主要是S区和C区。以色列的Shlomai等构建了体内表达shRNA的载体pSUPER，插入针对HBV的序列，与含有HBV基因组的载体共转染Huh7细胞，表明shRNA表达质粒可特异而显著地抑制病毒的蛋白合成和复制。Konishi 等用针对HBV基因组不同区域的化学合成的siRNA转染2.2.15细胞，用酶联免疫法检测发现，针对PA (polyadenylation) 区、前C 区和S 区的siRNA对HBsAg分泌量的抑制程度不同，与对照组相比分别下降了78%、67%和42%，说明针对PA区的siRNA能有效抑制HBsAg的表达。 McCaffrey 等采用水力转染( hydrodynamic transfection) 技术将含有HBV基因的质粒和表达HBV特异性shRNA的质粒一起注射小鼠尾静脉，小鼠肝脏HBsAg和HBcAg的表达在mRNA和蛋白质水平均明显降低，病毒复制得到抑制。德国的Klein等把有复制能力的HBV载体通过尾静脉注入NMRI小鼠，发现短时间内病毒可以在小鼠体内复制，在血清中可以检测到HBV抗原和DNA，多达10%的肝细胞HBcAg和HBsAg阳性。利用这一小鼠模型，同时转染化学合成的针对HBV的siRNA，导致HBsAg和HBeAg表达明显下降。Giladi等也证实合成的siRNA在细胞和小鼠水平都能抑制HBV蛋白表达和病毒复制。 2005年1月，美国的Chisari等在PNAS上发表文章，用HBV转基因小鼠作为动物模型，腺病毒载体表达shRNA，进行体内RNAi抑制HBV的实验，发现抑制效果非常明显，腺病毒感染后，小鼠的蛋白表达和病毒复制指标几乎检测不到，而且这种抑制效果可以持续至少26天。这一结果对RNAi用于慢性乙型肝炎的治疗提供了有力的支持。 从2002年初开始，我们确定了用RNAi抑制HBV的研究方向，当时这一领域还没有文献报道。经过三年的努力，取得了初步成果，在细胞和动物水平证明RNAi能有效抑制HBV的蛋白表达和病毒复制，为其用于乙型肝炎的治疗提供了实验依据。尤其是建立了稳定表达shRNA 的细胞株，不仅实现了对HBV蛋白表达和病毒复制的持续抑制，而且为RNAi抗HBV的机制研究搭建了一个良好的平台。在Journal of viral hepatitis和Journal of Hepatology上各发表1篇文章（SCI收录，影响因子分别超过3和5），申请专利1项，在国内处于领先水平。主要实验结果如下： 1．构建shRNA表达载体，在细胞水平筛选了12个干扰靶点。利用小鼠RNA聚合酶Ⅲ启动子U6构建了shRNA表达载体pU6P；在HBV基因组的保守区域选择了包含所有编码框在内的12个干扰靶点（表1），构建针对HBV的shRNA表达载体pU6-siHBV；pU6-siHBV转染2.2.15细胞，通过测定培养液内HBV抗原含量，发现12个质粒中的5个对抗原表达有明显的抑制作用，转染后4天达到高峰。对HBsAg 的抑制率最高达72.8%，HBeAg的抑制率最高为55.8%。定量PCR结果显示，质粒转染后培养液中HBV DNA的含量下降了1.9倍。细胞同时转染阴性对照质粒pU6-siGFP，对HBV蛋白表达和病毒复制没有影响，说明RNAi作用具有序列特异性。用文献报道的序列构建质粒，对病毒蛋白和复制的抑制与我们构建的质粒没有明显差别，证明了整个系统和靶序列的有效性。
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2．shRNA表达质粒稳定转染2.2.15细胞，HBV蛋白表达和病毒复制受到持续稳定的抑制。将shRNA表达质粒和空载体转染2.2.15细胞，经过抗生素筛选，分别得到8株和2株耐药细胞。对耐药株的鉴定实验表明，它们的染色体已整合了shRNA表达质粒和空载体基因。与2.2.15细胞相比，稳定表达shRNA的细胞株对培养上清中HBsAg的抑制率达95%左右，ELISA检测呈阴性；对HBeAg的抑制率在80%以上；而细胞免疫化学结果显示，在稳定株细胞中几乎找不到HBsAg或HBcAg阳性细胞；表明shRNA的持续表达对HBV蛋白表达的抑制非常明显，Northern Blot和Western Blot的结果也支持这一观点。稳定转染细胞株HBV DNA含量比2.2.15细胞降低10倍。经空载体稳定转染的细胞株对HBV的蛋白表达和复制没有影响，说明抑制效果确实是由RNAi作用引起的。 3．动物水平的抑制实验。为验证在动物水平RNAi的抗病毒作用，将shRNA表达质粒用hydrodynamics的方法经尾静脉注射到HBV转基因小鼠体内，注射后小鼠血清转氨酶有一过性升高，3天后降至正常，肝脏切片没有明显的病理性改变，说明这种注射方法是安全的。质粒注射后5天，血清HBsAg下降了56.7%，抑制作用至少持续2周。肝脏免疫组织化学结果显示HBcAg阳性细胞明显减少，说明RNAi能有效抑制转基因小鼠体内HBV的蛋白质表达。Northern Blot结果提示质粒注射后可在mRNA水平抑制蛋白表达。但HBV DNA定量没有明显降低，可能是注射剂量不足所致。 4．化学合成的siRNA的细胞实验。除上述质粒介导的病毒抑制实验外，我们还用化学合成的siRNA进行了细胞实验。结果显示siRNA最佳的作用浓度是100nM，转染后3天抑制率最高。蛋白质和mRNA水平的检测都证实siRNA能有效并且特异地抑制HBV蛋白质的表达。 三、RNAi的开发前景及面临的问题 由于RNAi技术的广泛应用，它已经从单一技术上升为一项产业。据美国商业报告，2003年全世界RNAi相关产品的产值达3亿美元，在今后3年中，这一数字将以300％的速度递增。到目前为止，全世界有十几家生物技术公司从事RNAi相关的药物研发工作。其中，美国Acuity、Sirna和Alnyalm制药公司分别有一个治疗眼科老年性黄斑病的siRNA药物进入Ⅰ期临床试验阶段，Benicec制药公司有一个针对HIV的多位点siRNA药物在2005年进入Ⅰ期临床。针对呼吸道合胞病毒和哮喘的药物即将在2006年进入Ⅰ期临床，其它还有治疗帕金森氏疾病、丙型肝炎病毒以及肿瘤等的多个siRNA药物正在临床前研究阶段。RNAi技术已成为生命科学、生物医药和药物研发最有力的工具之一，siRNA药物是众多生物制药企业努力追求的有巨大市场前景的新药。据权威商业研究报告，到2010年，几个siRNA药物进入市场后，其市场销售额至少将达到35亿美元。 尽管如此，在从实验室走向临床应用的道路上，siRNA药物还面临许多问题需要解决，最关键的是siRNA在血液中的稳定性，siRNA的导入途径以及药物作用的靶向性。针对这些问题，科学家们已经做了很多努力，如通过siRNA的化学修饰（主要有磷酸骨架修饰、核糖修饰和碱基修饰）增加siRNA的稳定性。由于siRNA带负电荷且有较强的亲水性，因此不易与带同样电荷的靶细胞接触，更不易透过由脂质双分子层构成的细胞膜进入细胞内与mRNA 发生作用，如果没有转染试剂或高压状态的存在，细胞很难摄取siRNA。因此，人们在siRNA 正义链的末端引入胆固醇等亲脂性基团，增加其透过细胞膜的能力。最近，在siRNA的导入途径方面也有很多进展，由于基于小鼠实验的hydrodynamic高压注射方法不能用于人类，人们便将修饰后的siRNA经病变部位局部注射、皮下注射或血管内灌注的方法导入动物体内，也有用病毒载体介导的导入方法。2005年8月，Sirna制药公司的Morrissey等在《Nature Biotechnology》上发表文章，表明用脂质包裹的经过修饰的siRNA可以通过静脉注射的方式抑制小鼠体内HBV的复制，这在导入方法上是一大进步。在靶向性方面，有人用HIV特异性抗体介导的siRNA可以特异性进入抗原表达的细胞并抑制相应基因的表达。所有这些改进在实验研究方面获得了一定的成功，但仍存在不足。如siRNA经化学修饰可能会导致毒性增加和沉默活性丧失；siRNA的用量太大，成本太高；病毒载体介导的导入方式可导致基因的插入突变以及存在其它的安全隐患等。与所有的基因治疗方法一样，安全、有效、特异、可控，是RNAi临床应用追求的目标，为了达到这一高度，还有许多路要走。 参考文献 1 Ren X, Luo G, Xie Z, Zhou L, Kong X and Xu A. 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发表于 2006-12-28 00:34
