RNAi干扰抑制乙型肝炎病毒的研究进展

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解放军第458医院全军肝病中心 孔祥平 任向荣
 

一、RNAi的机制

RNA干扰（RNA interference, RNAi）是1998年2月华盛顿卡耐基研究院的Fire和马萨诸赛大学癌症中心的Mello在《Nature》上提出的新概念，它是指由双链RNA(double strand RNA, dsRNA)介导的序列特异性的基因沉默（gene silencing）。这一机制首先在线虫内发现，随后，人们在真菌、拟南芥、锥虫、水螅、涡虫、斑马鱼等几乎所有真核生物中，甚至在大肠杆菌中也发现了类似RNAi的机制。RNAi在进化上非常保守，是真核生物中普遍存在的抵抗病毒入侵、抑制转座子活动、调控基因表达的监控机制。

RNAi一经发现，迅速成为生物学研究领域最为活跃的热点之一，《Science》在2001年将其列为十大科学成就之一，2002 年又将其列为十大科技之首； 《Nature》也将小RNA评为2002年度最重要的科技发现之一。 随着广泛深入的实验研究的进行，人们对RNAi的机制有了初步的了解。

对RNAi机制的认识主要来源于果蝇和线虫的研究成果（图1）。2000年，Zamore等在果蝇胚胎提取物中检测到～22-nt的小分子双链RNA片断，揭开了RNAi机制研究的序幕。根据生物体的不同，RNAi的诱导物可以是各种分子，包括长链dsRNA，质粒产生的小发夹RNA（short hairpin RNA, shRNA）或者内源性发夹样小RNA（hairpin micro RNA, miRNA）。目前认为RNAi的主要过程为：①RNAi的诱导物在细胞质内被RNaseⅢ Dicer切割成为21-23nt的小分子干扰RNA（small interfering RNA, siRNA），siRNA的结构特征是5'端单磷酸，3'端羟基，而且3'端有2～3-nt的碱基突出；②siRNA与RNA诱导的沉默复合体（RNA-induced silencing complex, RISC）结合，随后被解链成为单链RNA；③siRNA中的反义链（antisense strand）引导RISC找到目的mRNA，并且按碱基配对原则与之结合；④RISC内的RNA内切核酸酶将靶mRNA切断（切割位置在siRNA的中央，距离5'端10-nt），从而抑制目的基因的表达。miRNA导致基因沉默的机制与此稍有不同，它们与靶mRNA 3'非编码区（untranslated region, UTR）通过不完全互补结合，抑制翻译过程和蛋白质的合成。但也有研究表明，miRNA可以与siRNA一样通过介导mRNA的切断来抑制基因表达。

二、RNAi对HBV的抑制

作为一种快速、有效、特异的抑制基因表达的工具， RNAi的应用主要集中在三个方面：基因功能的研究，肿瘤的治疗和病毒性疾病（主要是艾滋病和肝炎）的治疗研究。以下着重介绍 RNAi抑制乙型肝炎病毒的进展。

乙型肝炎病毒（ hepatitis B virus, HBV）是嗜肝DNA病毒，其基因组结构独特，呈不完全闭合的双链形式，负（－）链为全长基因，约含3200个核苷酸，正（＋）链是负链长度的20～80%，病毒颗粒内含有DNA聚合酶。在所有已知可感染人体而且具有独立复制能力的双链DNA病毒中，HBV基因组是最小且最高效的。它具有以下4个鲜明特点：①不完全双链环状结构；②利用重叠的开放读码框（open reading frame, ORF）编码多个蛋白质；③所有调控序列均位于蛋白质编码区内；④基因序列具有多变性。HBV至少含有4个ORF, 即S区（包括preS1、preS2及S）、C区(包括preC和C)、P区和X区，ORF之间互相重叠。编码长度分别为3.5kb、2.4kb、 2.1kb和 0.7kb的4种转录子，共用一个PolyA加尾信号。

HBV的复制过程需要以转录的RNA为模板，3.5kb的前基因组mRNA比基因组的全长（3.2kb）还要长，包含了基因组的全部信息，既是翻译Pol蛋白、HBcAg和HBeAg的模板，也是基因组复制的模板。由于RNAi 的作用靶点是 mRNA，因此，从理论上讲，HBV基因组上的任何一段序列都可以成为RNAi的靶点，而不用顾及是不是在编码框内。同时，HBV 的4个ORF互相重叠，4条转录子共用一个PolyA位点，这使得在某些位点的siRNA可以同时攻击到2条或以上甚至是所有的mRNA，从而抑制多个蛋白的表达。HBV基因结构的这种特殊性为RNAi抗病毒提供了有利条件。

RNAi可能通过2种途径抑制HBV的复制：①抑制蛋白质的表达。RNAi能够抑制病毒聚合酶、核心抗原和表面抗原的表达，而这些蛋白对于病毒复制至关重要，没有它们，就不能完成病毒复制的过程。②降解3.5kb mRNA。3.5kb mRNA是病毒复制过程中逆转录的模板，由于它包含了HBV基因组的所有信息，所有针对HBV的siRNA都能与之特异性结合，继而对其切割，病毒的复制就会受到抑制。

自2003年以来，国内外陆续发表三十篇左右的文章，表明RNAi能有效抑制HBV的蛋白表达和病毒复制。这些实验结果有细胞水平的，也有动物水平的，有用合成的siRNA的，也有用载体细胞内表达siRNA的。针对的靶点主要是S区和C区。以色列的Shlomai等构建了体内表达shRNA的载体pSUPER，插入针对HBV的序列，与含有HBV基因组的载体共转染Huh7细胞，表明shRNA表达质粒可特异而显著地抑制病毒的蛋白合成和复制。Konishi 等用针对HBV基因组不同区域的化学合成的siRNA转染2.2.15细胞，用酶联免疫法检测发现，针对PA (polyadenylation) 区、前C 区和S 区的siRNA对HBsAg分泌量的抑制程度不同，与对照组相比分别下降了78%、67%和42%，说明针对PA区的siRNA能有效抑制HBsAg的表达。

McCaffrey 等采用水力转染( hydrodynamic transfection) 技术将含有HBV基因的质粒和表达HBV特异性shRNA的质粒一起注射小鼠尾静脉，小鼠肝脏HBsAg和HBcAg的表达在mRNA和蛋白质水平均明显降低，病毒复制得到抑制。德国的Klein等把有复制能力的HBV载体通过尾静脉注入NMRI小鼠，发现短时间内病毒可以在小鼠体内复制，在血清中可以检测到HBV抗原和DNA，多达10%的肝细胞HBcAg和HBsAg阳性。利用这一小鼠模型，同时转染化学合成的针对HBV的siRNA，导致HBsAg和HBeAg表达明显下降。Giladi等也证实合成的siRNA在细胞和小鼠水平都能抑制HBV蛋白表达和病毒复制。

2005年1月，美国的Chisari等在PNAS上发表文章，用HBV转基因小鼠作为动物模型，腺病毒载体表达shRNA，进行体内RNAi抑制HBV的实验，发现抑制效果非常明显，腺病毒感染后，小鼠的蛋白表达和病毒复制指标几乎检测不到，而且这种抑制效果可以持续至少26天。这一结果对RNAi用于慢性乙型肝炎的治疗提供了有力的支持。

从2002年初开始，我们确定了用RNAi抑制HBV的研究方向，当时这一领域还没有文献报道。经过三年的努力，取得了初步成果，在细胞和动物水平证明RNAi能有效抑制HBV的蛋白表达和病毒复制，为其用于乙型肝炎的治疗提供了实验依据。尤其是建立了稳定表达shRNA 的细胞株，不仅实现了对HBV蛋白表达和病毒复制的持续抑制，而且为RNAi抗HBV的机制研究搭建了一个良好的平台。在Journal of viral hepatitis和Journal of Hepatology上各发表1篇文章（SCI收录，影响因子分别超过3和5），申请专利1项，在国内处于领先水平。主要实验结果如下：

1．构建shRNA表达载体，在细胞水平筛选了12个干扰靶点。利用小鼠RNA聚合酶Ⅲ启动子U6构建了shRNA表达载体pU6P；在HBV基因组的保守区域选择了包含所有编码框在内的12个干扰靶点（表1），构建针对HBV的shRNA表达载体pU6-siHBV；pU6-siHBV转染2.2.15细胞，通过测定培养液内HBV抗原含量，发现12个质粒中的5个对抗原表达有明显的抑制作用，转染后4天达到高峰。对HBsAg 的抑制率最高达72.8%，HBeAg的抑制率最高为55.8%。定量PCR结果显示，质粒转染后培养液中HBV DNA的含量下降了1.9倍。细胞同时转染阴性对照质粒pU6-siGFP，对HBV蛋白表达和病毒复制没有影响，说明RNAi作用具有序列特异性。用文献报道的序列构建质粒，对病毒蛋白和复制的抑制与我们构建的质粒没有明显差别，证明了整个系统和靶序列的有效性。

2．shRNA表达质粒稳定转染2.2.15细胞，HBV蛋白表达和病毒复制受到持续稳定的抑制。将shRNA表达质粒和空载体转染2.2.15细胞，经过抗生素筛选，分别得到8株和2株耐药细胞。对耐药株的鉴定实验表明，它们的染色体已整合了shRNA表达质粒和空载体基因。与2.2.15细胞相比，稳定表达shRNA的细胞株对培养上清中HBsAg的抑制率达95%左右，ELISA检测呈阴性；对HBeAg的抑制率在80%以上；而细胞免疫化学结果显示，在稳定株细胞中几乎找不到HBsAg或HBcAg阳性细胞；表明shRNA的持续表达对HBV蛋白表达的抑制非常明显，Northern Blot和Western Blot的结果也支持这一观点。稳定转染细胞株HBV DNA含量比2.2.15细胞降低10倍。经空载体稳定转染的细胞株对HBV的蛋白表达和复制没有影响，说明抑制效果确实是由RNAi作用引起的。

3．动物水平的抑制实验。为验证在动物水平RNAi的抗病毒作用，将shRNA表达质粒用hydrodynamics的方法经尾静脉注射到HBV转基因小鼠体内，注射后小鼠血清转氨酶有一过性升高，3天后降至正常，肝脏切片没有明显的病理性改变，说明这种注射方法是安全的。质粒注射后5天，血清HBsAg下降了56.7%，抑制作用至少持续2周。肝脏免疫组织化学结果显示HBcAg阳性细胞明显减少，说明RNAi能有效抑制转基因小鼠体内HBV的蛋白质表达。Northern Blot结果提示质粒注射后可在mRNA水平抑制蛋白表达。但HBV DNA定量没有明显降低，可能是注射剂量不足所致。

4．化学合成的siRNA的细胞实验。除上述质粒介导的病毒抑制实验外，我们还用化学合成的siRNA进行了细胞实验。结果显示siRNA最佳的作用浓度是100nM，转染后3天抑制率最高。蛋白质和mRNA水平的检测都证实siRNA能有效并且特异地抑制HBV蛋白质的表达。

三、RNAi的开发前景及面临的问题

由于RNAi技术的广泛应用，它已经从单一技术上升为一项产业。据美国商业报告，2003年全世界RNAi相关产品的产值达3亿美元，在今后3年中，这一数字将以300％的速度递增。到目前为止，全世界有十几家生物技术公司从事RNAi相关的药物研发工作。其中，美国Acuity、Sirna和Alnyalm制药公司分别有一个治疗眼科老年性黄斑病的siRNA药物进入Ⅰ期临床试验阶段，Benicec制药公司有一个针对HIV的多位点siRNA药物在2005年进入Ⅰ期临床。针对呼吸道合胞病毒和哮喘的药物即将在2006年进入Ⅰ期临床，其它还有治疗帕金森氏疾病、丙型肝炎病毒以及肿瘤等的多个siRNA药物正在临床前研究阶段。RNAi技术已成为生命科学、生物医药和药物研发最有力的工具之一，siRNA药物是众多生物制药企业努力追求的有巨大市场前景的新药。据权威商业研究报告，到2010年，几个siRNA药物进入市场后，其市场销售额至少将达到35亿美元。

尽管如此，在从实验室走向临床应用的道路上，siRNA药物还面临许多问题需要解决，最关键的是siRNA在血液中的稳定性，siRNA的导入途径以及药物作用的靶向性。针对这些问题，科学家们已经做了很多努力，如通过siRNA的化学修饰（主要有磷酸骨架修饰、核糖修饰和碱基修饰）增加siRNA的稳定性。由于siRNA带负电荷且有较强的亲水性，因此不易与带同样电荷的靶细胞接触，更不易透过由脂质双分子层构成的细胞膜进入细胞内与mRNA 发生作用，如果没有转染试剂或高压状态的存在，细胞很难摄取siRNA。因此，人们在siRNA 正义链的末端引入胆固醇等亲脂性基团，增加其透过细胞膜的能力。最近，在siRNA的导入途径方面也有很多进展，由于基于小鼠实验的hydrodynamic高压注射方法不能用于人类，人们便将修饰后的siRNA经病变部位局部注射、皮下注射或血管内灌注的方法导入动物体内，也有用病毒载体介导的导入方法。2005年8月，Sirna制药公司的Morrissey等在《Nature Biotechnology》上发表文章，表明用脂质包裹的经过修饰的siRNA可以通过静脉注射的方式抑制小鼠体内HBV的复制，这在导入方法上是一大进步。在靶向性方面，有人用HIV特异性抗体介导的siRNA可以特异性进入抗原表达的细胞并抑制相应基因的表达。所有这些改进在实验研究方面获得了一定的成功，但仍存在不足。如siRNA经化学修饰可能会导致毒性增加和沉默活性丧失；siRNA的用量太大，成本太高；病毒载体介导的导入方式可导致基因的插入突变以及存在其它的安全隐患等。与所有的基因治疗方法一样，安全、有效、特异、可控，是RNAi临床应用追求的目标，为了达到这一高度，还有许多路要走。

 

参考文献

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MP4-FTTD@HBVHBV

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http://www.sirna.com/wt/page/anti_viral

http://www.jskintop.com/hdpharm/cn/htm/index_drug2.htm

www.newrayjay.com

http://www.topbt.com/web/shop.asp?action=all&id=1286

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中国医药数字图书馆网站    王彩娟

2006-10-31

美国默克公司（默沙东，Merck & Co.）周一（10月30日）表示，公司正以每股13美元的现金价格收购专长于RNA干扰技术的小型生物技术公司Sirna Therapeutics。该交易的总价可达11亿美元左右，预计整宗交易将于2007年首季完成。

Sirna公司主要以RNA干扰技术为基础开发化合物，默克认为该技术将给疾病治疗带来深远影响。默克指出，公司可采用Sirna的技术开发抗肿瘤化合物。默克还指出，Sirna处于领先地位的在研药物Sirna-027（与Allergan公司合作开发）正进入治疗湿性年龄相关性黄斑变性的中期研究。此外，Sirna还在运用其RNA干扰技术与葛兰素史克公司（GlaxoSmithKline）合作开发呼吸系统疾病治疗药物。

默克在上述交易中的出价高出了Sirna当日（10月30日）收盘价的2倍，在RNA干扰技术领域，也可称得上是一场豪赌了。在满足惯例成交条件后，Sirna将成为默克的全资子公司。

http://www.pharmadl.com/pharmadl/publish/view_news.aspx?contentid=103482

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华裔科学家利用纳米技术治癌获突破 作者:  来源:中新网  发布者: 亦云  类别:专题13-RNA研究  日期: 2005-09-17  今日/总浏览: 2/1451

美国普度大学华裔科学家利用纳米技术治疗癌症获得新突破，建立纳米技术医学应用的里程碑。   　　据美国《侨报》报道，普度大学14日宣布，该校癌症研究中心科学家郭裴旋(人名均音译http://www.vet.purdue.edu/PeixuanGuo/,)率领郭松川、李锋等科学家利用国家卫生院和国防部研究经费，将RNA纳米技术研制成基因材料颗粒，将抗癌药剂直接运送到癌细胞内，成功阻止癌细胞生长、扩散。新技术目前已应用于老鼠和实验室培育的人体细胞。随着新技术的不断完善和风险的降低，科学家们将用于人体试验。   　　郭裴旋介绍说，癌症治疗的关键是将合适的药剂同时运入癌细胞内，这也是癌症研究迄今面临的障碍。纳米技术的超微小颗粒为攻克这一难关提供了通道，可以称为纳米技术医学应用的里程碑。但科研小组还需跨越一些障碍，提高安全系数，才能开始人体试验。一旦成功，将是人类治疗癌症的重大进展。         美国普渡大学的研究人员利用遗传物质链构建出了一种能够携带抗癌药物直接到达受感染细胞的微小传递系统。这一技术为治疗慢性癌症提供了一种非常有潜力的新疗法。         虽然这种载体进入身体后的任务是卸货，但它的外形和运货的卡车没有任何相似之处。这些所谓的纳米颗粒由三种短的核糖核酸即RNA装配而成，类似缩微的三角形。这种微小颗粒具有进入细胞的合适尺寸和携带其他治疗性RNA链的合适结构。研究组已经通过检测证明这种纳米颗粒能够成功抑制小鼠的癌症生长和实验室培养的人类细胞中的癌症生长。         虽然，研究人员一直认为RNA具有成为癌症治疗药剂的巨大潜力，但是却苦于没有一个能将治疗药剂直接送入特定癌细胞的有效传递系统。因此，研究人员希望纳米技术能够解决这个问题。         利用这种设计，研究人员能够将三种不同的治疗性药剂（RNA）同时传递到一个细胞中。这项研究的结果分两篇论文叙述并分别刊登在Nano  Letters  和Human  Gene  Therapy上。         Guo领导的研究组通过将不同类型的RNA连接起来创造出了这种纳米颗粒。在用几种RNA构成一个微小的“发动机”的若干年后，研究组知道了如何操控这些线状分子变成不同的形状，如棒状、三角形和矩阵。         研究人员指出，这些结果非常有价值，但是目前在进行人类试验之前还有许多篱障需要破除：首当其冲的是必须确保它的安全性，因为有些RNA对非癌变细胞有毒性。（生物通记者杨淑娟）

http://www.biotech.org.cn/news/news/show.php?id=26841

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强劲的分子发动机---RNA纳米马达

[作者:Tino] [发布时间:20040928] [来源:http://www.sciscape.org/news_detail.php?news_id=1606]

美国普渡大学研究人员成功地把RNA组成3D数组 (3D arrays)。 　　一般来说，具有遗传信息的去氧核糖核酸DNA可以转译成核糖核酸RNA，但是RNA分子结构比DNA分子结构具有多样化的特性，也就是RNA可以形成多样的结构（诸如：单体monomer、双合体dimer、三合体trimer、六合体hexamer等等）。 　　普渡大学分子病毒学教授Peixuan Guo的研究团队，早于1987年在phi29病毒里发现一种特殊的RNA结构，它称为pRNA(packaging RNA)，其pRNA单体(monomer)之间可以互相联结组合成六合体（hexamer）环状结构，而这种六合体环状结构又称做纳米马达（nano-motor），它可以用来包装DNA，把DNA分子送入病毒衣壳（procapsid）里头。 　　Peixuan Guo等人目前正把纳米马达的概念应用在设计人工RNA纳米装置中，他们已经成功地从RNA形成的模块中建造出3D数组，并且这些3D数组更可以延伸至数个微米(micrometers)，进而搭起纳米制造（nanofabrication）与微米制造（microfabrication）之间的桥梁。而消息已刊登在2004年八月的《纳米通讯期刊》 (Nano Letters)。 Peixuan Guo指出，在生物体内具有各式各样的纳米机器，例如细胞膜上的帮浦(pump)或马达(motor)等，他们正致力在把这些生物体内的纳米装置，拿到外界也就是活体外的环境下来表达，正如同上述的RNA六合体环状结构，就可以用来当成精小但强又有利的纳米马达。而目前这些RNA的3D数组还是处于初期研发的阶段，他们希望未来能够把这些3D数组应用在病理诊断芯片、微小感应器、基因治疗使用的基因输送载体以及电子仪器等研发。 原始论文： Shu D, Moll D, Deng Z, Mao C, and Guo P. 2004. Bottom-up assembly of RNA arrays and superstructures as potential parts in nanotechnology. Nano Letters 4: 1717-1724.   --参考来源： ScienceDaily: No Longer Just For Biology, RNA Can Now Be Built Into 3-D Arrays

http://www.chinainfo.gov.cn/data/200409/1_20040928_91028.html

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http://www.nucleonicsinc.com/products/hepb.html

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http://www.dxy.cn/bbs/post/view?bid=116&id=7305957

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ISSN 1009-3079 CN 14-1260/R 世界华人消化杂志 2006年4月28日;14(12):1172-1177
RNA干扰抑制HepG2-N10细胞系中HBV基因表达及复制

潘金水, 任建林, 程 通, 董 菁, 黄松洁, 施华秀

潘金水, 任建林, 董菁, 施华秀, 厦门大学附属中山医院消化内科 福建省厦门市 361004
程通, 福建省分子医学病毒研究中心, 厦门大学细胞生物学与肿瘤细胞工程教育部重点实验室 福建省厦门市 361004
黄松洁, 厦门大学附属中山医院厦门市临床检验中心 福建省厦门市 361004
潘金水, 在读硕士研究生, 厦门大学附属中山医院消化内科主治医师, 主要从事消化道肿瘤分子生物学研究.
通讯作者: 任建林, 361004, 福建省厦门市, 厦门大学附属中山医院消化内科. [email protected]
电话: 0592-2292017 传真：0592-2292017
收稿日期: 2006-02-22 接受日期: 2006-03-15

RNA interference inhibits hepatitis B virus gene expression and replication in HepG2-N10 cells

Jin-Shui Pan, Jian-Lin Ren, Tong Cheng, Jing Dong, Song-Jie Huang, Hua-Xiu Shi

Jin-Shui Pan, Jian-Lin Ren, Jing Dong, Hua-Xiu Shi, Department of Gastroenterology, the Affiliated Zhongshan Hospital of Xiamen University, Xiamen 361004, Fujian Province, China
Tong Cheng, Fujian Research Center of Medical Molecular Virology, Key Laboratory of Cell Biology and Tumor Cell Engineering of Ministry of Education, Xiamen University, Xiamen 361002, Fujian Province, China
Song-Jie Huang, Xiamen Center of Clinical Laboratory, the Affiliated Zhongshan Hospital of Xiamen University, Xiamen 361004, Fujian Province, China
Correspondence to: Professor Jian-Lin Ren, Department of Gastroenterology, the Affiliated Zhongshan Hospital of Xiamen University, Xiamen 361004, Fujian Province, China. [email protected]
Received: 2006-02-22   Accepted: 2006-03-15

Abstract
AIM: To evaluate the effect of vector-based small interfering RNA promoted by U6 (pSilencer2.0-U6) on the inhibition of hepatitis B virus (HBV) replication in HepG2-N10 cells.

METHODS: Several sequences targeting on different regions of HBV genome were inserted into pSilencer vectors. The expression plasmids were then transfected into HepG2-N10 cells, a cell line which stably expressed HBsAg, HBeAg and adw2 subtype Dane Particles. Viral antigens were measured by enzyme linked immunosorbent assay (ELISA). Viral mRNA was analyzed by reverse transcription-polymerase chain reaction (RT-PCR). The covalent closed circular DNA (cccDNA) secreted into the culture media were measured by quantitative real-time PCR.

RESULTS: Vector-based RNA interference potently reduced HBsAg and HBeAg expression in cell culture. Furthermore, RT-PCR analysis showed that viral mRNAs were effectively degraded, thus eliminating the messengers for protein expression as well as templates for reverse transcription. Quantitative Real-time PCR analysis of cccDNAs revealed that vector-based RNA interference inhibited HBV replication efficiently (HBV DNA log10: pS: 4.00 ± 0.13; pC: 4.08 ± 0.10; pX: 4.28 ± 0.06; pN: 5.05 ± 0.07; HepG2-N10: 4.74 ± 0.06; HepG2: <2.70).

CONCLUSION: RNA interference can inhibit HBV gene expression and virus replication.

Key Words: Hepatitis B Virus; RNA interference; Virus replication

Pan JS, Ren JL, Cheng T, Dong J, Huang SJ, Shi HX. RNA interference inhibits HBV gene expression and replication in HepG2-N10 cells. Shijie Huaren Xiaohua Zazhi 2006;14(12):1172-1177

摘要
目的：评估以U6启动子作为启动序列(pSilencer2.0-U6)载体介导的小RNA干扰片段在培养细胞株中抑制HBV复制的效应.

方法：将针对HBV基因组不同区域(S, X及C区)的核苷酸序列插入至pSilencer载体中, 并将重组后的pSilencer质粒(分别为pS, pX及pC)载体转染入HepG2-N10细胞株(可稳定表达HBsAg、HBeAg及adw2亚型Dane颗粒)中. 以ELISA法检测病毒抗原, 以逆转录-聚合酶链反应法(reverse transcription-polymerase chain reaction, RT-PCR)检测病毒mRNA, 并以荧光定量PCR法检测分泌入培养基的共价闭合环状DNA(covalent closed circular DNA, cccDNA).

结果：质粒载体介导的RNA干扰能明显抑制培养基中HBsAg及HBeAg的表达. 并且RT-PCR法检测显示病毒mRNA也被降解了, 从而减少了蛋白表达及病毒逆转录复制的模板. 荧光定量PCR法检测显示分泌入培养基的cccDNAs明显下降(HBV DNA log10: pS: 4.00±0.13; pC: 4.08±0.10; pX: 4.28±0.06; pN: 5.05±0.07; HepG2-N10: 4.74±0.06; HepG2: <2.70).

结论：RNA干扰能抑制HBV基因表达及病毒复制, 并且RNA干扰可能为HBV的治疗带来巨大的变化.

关键词: 乙肝病毒; RNA干扰; 病毒复制

潘金水, 任建林, 程通, 董菁, 黄松洁, 施华秀. RNA干扰抑制HepG2-N10细胞系中HBV基因表达及复制. 世界华人消化杂志 2006;14(12):1172-1177
http://www.wjgnet.com/1009-3079/14/1172.asp

0 引言
HBV可导致急慢性肝炎及肝细胞癌. 目前全球范围内约3.5亿人携带有HBV, 而其中每年约有100万死于HBV感染的慢性并发症, 如肝硬化、肝癌或两者并存[1]. 虽然目前已有预防用疫苗供应, 但是对于慢性感染者的治疗选择仍然有限. 研究表明, 拉米夫啶治疗1 a后能出现病毒学及生化反应[2-3]. 然而, 多数研究表明, 继续治疗每年约有20%患者产生耐药现象[4]. α-干扰素及聚乙醇化干扰素抗病毒效应也较强, 但停药后应答持续时间较短[5-6]. 阿迪福韦治疗144 wk后能取得病毒复制抑制、酶学正常及组织学反应改善等益处.然而, 常出现耐药突变现象[7]. 因此, 必须寻找可供替代的现症感染治疗方法. RNA干扰是双链RNA引发同源mRNA降解这一现象[8]. 在过去应用于打断由HIV-1、肝炎病毒、流感病毒等引起的疾病过程[9-12]. 业已证明, 在体外试验中将小干扰片段或干扰片段表达盒导入细胞中能抑制HBV基因表达及病毒复制[10-11]. 这些结果表明高效率转染的小干扰片段可能将有效地抑制慢性感染患者中HBV的复制. 然而, 多数这类研究先在体外合成干扰片段, 然后将其转染入细胞内. 体内转运、血浆中稳定性低及细胞摄取率低仍是目前最主要的困难[13-14]. 为了解决这些问题, 学者们在质粒[15-17]或病毒载体[18-20]基础上建立了几个哺乳动物源性表达载体. 我们建立了以U6启动子启动的质粒表达载体(pSilencer 2.0-U6), 旨在观察该表达载体产生的小干扰片段能否抑制培养细胞中HBV的复制.

1 材料和方法
1.1 材料 Trizol试剂及阳离子脂质体Lipofecta-mine购自Invitrogen公司. Dulbecco改进的Eagle培养基(DMEM)、 胎牛血清及抗生素购自Hyclone公司. DNA测序及发夹RNA (short hairpin interfering RNAs, shRNAs)合成由Invitrogen上海公司进行. 质粒pSilencer 2.0-U6由Ambion公司提供. HBsAg及HBeAg ELISA试剂盒购自厦门新创公司. RT试剂盒、T4 DNA连接酶、Taq DNA聚合酶购自Promega公司. HepG2-N10细胞株 (承蒙福建省分子医学病毒研究中心, 厦门大学细胞生物学与肿瘤细胞工程教育部重点实验室夏宁邵教授惠赠)能稳定表达HBsAg, HBeAg以及adw2亚型Dane颗粒, 并且HBV 4个开放读码框(open reading frame, ORF)转录的mRNA也能由RT-PCR法检测出来[21]. HepG2-N10细胞株的培养条件包括DMEM培养基, 并含有100 mL/L胎牛血清, 2 mol/L的L-谷氨酰胺, 100 mg/L青霉素及100 kU/L链霉素. 培养条件包括: 增湿的37℃温箱, 含有50 mL/L 的CO2. 细胞活力以台盼蓝染色排除法判断. HepG2-N10细胞在转染前24 h内铺入24孔板. 以Lipofectamine阳离子脂质体作为转染试剂, 转染后48 h收获细胞. 每种质粒分别转染3个细胞孔. 单独转染环状pSilencer阴性质粒作为阴性对照. 该阴性对照质粒能表达与任何已知的人类、小鼠及大鼠基因同源性均极低的siRNA. 每种质粒转染均重复3次.
1.2 方法 应用Ambion公司在线软件, 我们选择了3个adw2基因亚型HBV(GenBank编号: AY707087)基因位点作为靶序列, 并命名为si-HBVS, X及C. si-HBVS的靶序列位于HBV基因组的S区及P区(nt 593-611), si-HBVX的靶序列位于X区(nt 1648-1666), si-HBVC的靶序列位于C区(nt 1923-1941). 这3对完全与靶位点配对的核苷酸片段由Invitrogen上海公司合成, 序列如下: si-HBVS正义链为5'-GATCCATTGCACCTGTATTCCCATTTCAAGAGAATGGGAATACAGGTGCAATTTTTTTGGAAA-3', 反义链为5'-AGCTTTTCCAAAAAAATTGCACCTGTATTCCCATTCTCTTGAAATGGGAATACAGGTGCAATG-3'; si-HBVX正义链为5'-GATCCGGTCTTACATAAGAGGACTTTCAAGAGAAGTCCTCTTATGTAAGACCTTTTTTGGAAA-3', 反义链为5'-AGCTTTTCCAAAAAAGGTCTTACATAAGAGGACTTCTCTTGAAAGTCCTCTTATGTAAGACCG-3'; si-HBVC正义链为5'-GATCCAGAATTTGGAGCTACTGTGTTCAAGAGACACAGTAGCTCCAAATTCTTTTTTTGGAAA-3', 反义链为5'-AGCTTTTCCAAAAAAAGAATTTGGAGCTACTGTGTCTCTTGAACACAGTAGCTCCAAATTCTG-3'. 每条正义链分别与其反义链退火后, 可形成一个限制性核酸内切酶BamHI 及HindⅢ的黏性末端. pSilencer 2.0-U6表达质粒由供应商分别以BamHI及HindⅢ酶切处理, 形成线性化片段, 并除去酶切下来的小片段而纯化, 因此他不能发生自身连接. 按照供应商的说明, 应用T4 DNA连接酶将退火后的双链核苷酸片段插入线性化的载体. 按照说明, 将退火后的双链核苷酸片段插入pSilencer 2.0-U6载体BamHI及HindⅢ位点中. 这样, 即完成了可分别表达针对S区, X区及C区shRNA表达质粒的构建. 这3种表达质粒分别命名为pS, pX及pC. 同样地, 阴性对照质粒命名为pN. 所有构建好的质粒经Invitrogen上海公司DNA 测序后加以确认.分泌入培养基的HBsAg及HBeAg采用ELISA诊断性试剂盒(厦门新创公司)测定, 并按试剂盒说明操作.
1.2.1 病毒RNA的RT-PCR分析 按照供应商说明, 以Trizol试剂提取转染后细胞的总RNA. 以DNaseI消化30 min除去残存DNA, 总RNA以Trizol试剂再次提取, 离心沉淀后溶解入DEPC-水. 以oligo (dT) 18作为引物, 总RNA1.0 mg在Mu-MLV逆转录酶(Promega公司)的催化下生成互补DNA.并使用合成的引物PCR法扩增四个开放读码框及β-肌动蛋白相应的互补. 逆转录酶经95℃加热5 min预灭活. PCR扩增反应体系设定为20 mL, 并含有模板2 mL, 0.18 mmol/L的dNTP混合物, 3.00 mmol/L MgCl2, 1.96 mL的10×嗜热缓冲液, 上游及下游引物各750 nmol/L. 并设立阳性对照与空白对照. 经电泳及扫描后, 所有PCR产物条带经β-肌动蛋白标化后由分析软件Gel Pro analyzer32测定. 引物信息如表1所示, PCR条件如表2所示.

表1 CR扩增引物信息

表2 CR扩增条件

1.2.2 HBV DNA的荧光定量PCR法测定 分泌入培养基的共价闭合环状DNA以一个敏感的荧光定量商业试剂盒(深圳市匹基生物工程有限公司)测定. 测定下限为500×103拷贝/L. cccDNA的提取及测定在转染后2 d进行. 所有操作步骤均按说明进行. 100 mL的培养基与等量的提取液Ⅰ混合. 混合物以13 000 r/min离心10 min, 在移去上清液后加入25 mL的提取液Ⅱ, 充分重悬浮沉淀物后再次以2 000 r/min离心10 s, 并100℃水浴10 min. 当混合物经第二次13 000 r/min离心10 min后, cccDNA即溶解入上清液中. 每40 mL的反应体系含有2 mL的上清液(模板). PCR扩增反应在PE Gene Amp 5700荧光PCR仪 (美国Perkin-Elmer公司)上进行. PCR扩增反应程序设定为37℃ 5 min, 94℃ 1 min, 95℃ 5 s, 60℃ 30 s, 扩增40个循环
  统计学处理 HBsAg及HBeAg测定及病毒mRNA RT-PCR结果采用方差分析. HBV DNA测量值取对数后亦采用方差分析. HBV DNA测量值低于检测下限(500×103拷贝/L)的将其假定为499×103拷贝/L. 所有统计分析均采用双侧检验, 显著性水平设为0.05.

2 结果
2.1 siRNA对HBsAg表达水平的影响 为了评估HBV特异性siRNA对HBV基因表达的影响, 以诊断性ELISA试剂(厦门新创公司)于转染后48 h分别测定处理组及对照组培养基中的HBsAg水平. 经pS-Lipofectamine复合物处理48 h后HepG2-N10细胞的HBsAg表达水平较阴性对照组下降47%, 并且具有显著性差异(P<0.05). 与阴性对照组相比, 经pX-Lipofectamine及pC-Lipofectamine处理后HBsAg表达水平分别下降30%及25%(表3).

表3 HBsAg及HBeAg的测定水平 (mean±SD, A)

2.2 HBV特异性siRNA对HBV转录产物的影响 假定siRNA能导致特异性的靶mRNA降解, 可以预计经pS, pX及pC处理后HBV转录产物水平将下降. 相应地, HBV的mRNA表达水平采用RT-PCR法分析测定. 与经pN-Lipofectamine处理后细胞的S基因mRNA (条带5)相比, 经pS-Lipofectamine处理后同一mRNA有明显下降(条带11, 图1). HBV-mRNA水平经过同一标本的β-肌动蛋白mRNA标化处理. 与阴性对照组相比, 经pC-Lipofectamine处理后C基因mRNA表达水平下降46%, 并有显著性差异(P<0.001). 同样地, 经pX-Lipofectamine处理后相应mRNA表达水平下降47%, 亦有显著性差异(P<0.001, S-pN: 0.75±0.11; X-pN: 0.59±0.13; C-pN: 0.61±0.03; S-pS: 0.34±0.07; X-pX: 0.31±0.07; C-pC: 0.33±0.08).

图1 HepG2-N10细胞mRNA表达水平(RT-PCR法). 1: Marker, 上: 0.5 kb; 2, 6, 8, 10: β-肌动蛋白; 2, 5经pN处理; 3: X基因mRNA; 4: C基因mRNA; 5: S基因mRNA; 6, 7: 经pX处理; 7: X基因mRNA; 8, 9: 经pC处理; 9: C基因mRNA; 10, 11: 经pS处理; 11: S基因mRNA.

2.3 表达质粒对HBV cccDNA的影响 HBV cccDNA的表达水平采用荧光定量PCR法测定, 该法测定下限为500×103拷贝/L. 与阴性对照组相比, 经pS, pC-Lipofectamine处理后HBV cccDNA的表达水平下降. 有趣的是, 实验中尚发现经pX-Lipofectamine处理后HBV cccDNA的表达水平下降亦达83%, 并且差别具有显著性(P<0.001, HBV DNA log10: pS: 4.00±0.13; pC: 4.08±0.10; pX: 4.28±0.06; pN: 5.05±0.07; HepG2-N10: 4.74±0.06; HepG2: <2.70).

3 讨论
虽然RNA干扰的发现仅有数年, 但是他已经成为分析基因功能及治疗肿瘤、感染性疾病及遗传性疾病的有力工具. 然而, 血浆中稳定性差、细胞摄取率低及非特异性免疫刺激对发展RNA干扰技术仍是巨大的挑战[13-14,22]. 为了克服这些困难, 设计了几种哺乳动物源性表达载体以产生内源性shRNA[15-17]. 近来, RNA干扰的体内外抗HBV效应已有报道[11,23-24]. 我们的结果表明, 载体介导的RNA干扰能显著抑制HBV抗原表达(HBsAg及HBeAg). 我们的结果还表明, 针对HBV基因组特定位点的shRNA能抑制HBV复制, 导致能稳定表达HBV的细胞株中HBV抗原的下降. 之所以选用HepG2-N10细胞株, 是因其能组成性表达HBV, 并且mRNA及相关抗原表达较为恒定. 他是个较为理想的细胞模型, 因为HBV基因组已整合入宿主基因组. 因此, 即使所有具有复制能力的中间体均被siRNA所降解, HBV的复制亦能恢复, 除非抑制作用能无限期持续下去. 在出现不可逆转的肝损伤之前清除HBV是最好方法. 然而, 清除HBV是难以实现的, 由于肝外HBV储存库的存在、HBV DNA可整合入宿主基因组中, 并且存在不需重感染即可扩增转录模板库(cccDNA)的细胞内转化途径. 因此, 停药后常伴有快速病毒反弹. 由于细胞株和自然感染株具有相同的靶序列, 因此本实验中所使用的siRNA对自然感染株可能亦有抑制作用. 然而, 对自然感染株的抑制作用能否与本实验中所观察到的抑制同等有效尚有待于进一步观察.
  应用siRNA抗HBV富有吸引力, 因为HBV的mRNA有着极大的经济性, 由于其长度较小并且具有重叠读码框, 使得我们可能设计一条siRNA即可同时降解几条mRNA. si-HBVS的选择即是基于这种设想, 由于si-HBVS的靶位点同时位于HBV基因组的S区及P区. 尽管如此, 多条siRNA同时作用于HBV的不同位点发挥的抑制HBV复制作用可能比本实验所报告的单一siRNA要大. 但是, 应用这一策略发生非特异性及意料外的效应可能增加, 并导致不相关的mRNA降解(RNA干扰的“脱靶效应”[25-26]). 脱靶效应指的是与一个内源性基因某一位点并不完全同源的RNA亦能通过抑制翻译而导致基因表达的静默. G-U摆动配对可能是其主要的原因. 长度为21 nt的siRNA是达到较高的序列特异性与较低的脱靶效应的理想平衡点[27]. 在所选择的siRNA中, pS具有最强的抑制HBV复制作用. 由于pS编码产生的siRNA作用于病毒的S区, 病毒的多种mRNA均可被抑制. 除此之外, 他还能下调P基因的表达(因为S基因位于P基因内), 因此能发挥反式抑制HBV复制的作用. 这些因素可能部分解释了pS编码产生的siRNA具有最强的抑制HBV复制作用. 而且, 我们还观察到经过pX-Lipofectamine处理后的细胞株, HBV DNA的拷贝数亦有明显的下降. 这提示X蛋白可能在HBV的复制中起到重要的作用. X蛋白由X基因编码产生, 是一个小分子量蛋白质, 可能与肝细胞癌的发生[28]及病毒复制[29-30]有关. 然而, X蛋白在这两个过程中的作用机制尚有待阐明. Leupin et al[31]研究表明X蛋白刺激HBV基因组复制可能与DDB1依赖途径有关.
  总之, 我们的数据表明RNA干扰是抑制HBV复制的一个令人感兴趣的新策略. 然而, 在RNA干扰上升为一个可能的治疗方法之前尚必须克服一些困难. 最大挑战是RNA干扰试剂在体内的输送. 血浆中稳定性低、跨膜摄取率差也是显著的困难. 另一问题是病毒可能产生变异体以逃避siRNA的抑制. Das et al[32]观察到在培养几周之后, HIV-1即可产生不受siRNA抑制的变异株. Wu et al[33]也在HBV中观察到类似的现象. 虽然RNA干扰现象是近来发现的, 并且存在上述的不足之处, 但是这一领域还是取得快速的突破. 越来越明确, RNA干扰是真核生物在演变过程中形成的控制基因表达及保护自身基因组免受外来入侵的高度保守的分子机制. 最新的数据表明这一古老的防御机制可以作为抗HBV及其他病毒的强有力武器. 简而言之, RNA干扰可能为HBV的治疗带来革命性的变化.

4   参考文献(略)