核酸疫苗(基因疫苗)-DNA疫苗-RNA疫苗

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核酸疫苗研究概况

核酸疫苗研究概况 http://www.ivdc.gov.cn 03-06-30
　　摘 要：核酸疫苗是当今疫苗研究的最前沿领域，它随着科技的发展而发展。作为一种新型的疫苗，核酸疫苗能够诱发体液免疫和细胞免疫。本文简单介绍了核酸疫苗的产生背景、特点、免疫机理、免疫影响因素以及在畜禽传染病中的应用，此外还分析了核酸疫苗的发展前景等问题，从而为核酸疫苗的发展提供了新思路和新途径。
　　 　　关键词：核酸疫苗 免疫 传染病 应用 发展
　　

　　核酸疫苗（ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ ｖａｃｃｉｎｅ），也叫基因疫苗（ｇｅｎｅｔｉｃ ｖａｃｃｉｎｅ）、核酸免疫（ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ ｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ）、ＤＮＡ免疫（ＤＮＡ ｂａｓｅｄ ｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ），它是利用基因重组技术直接将编码某种抗原蛋白的外源基因（ＤＮＡ）与质粒重组后，直接导入动物细胞内，并通过宿主细胞的转录系统合成抗原蛋白，诱导宿主产生对该抗原蛋白的免疫应答，以达到预防和治疗疾病的目的。核酸疫苗包括ＤＮＡ疫苗（ＤＮＡ ｖａｃｃｉｎｅ）和ＲＮＡ疫苗（ＲＮＡ ｖａｃｃｉｎｅ），其中研究最多地是ＤＮＡ疫苗，它由于不需要任何化学载体，故又称为裸ＤＮＡ疫苗（ｎａｋｅｄ ＤＮＡ ｖａｃｃｉｎｅ）。核酸疫苗的出现，开拓了疫苗学的新纪元，被称为第三次疫苗革命。目前，核酸疫苗已在病毒性疾病、细菌性疾病、寄生虫免疫、抗肿瘤免疫、预防变态反应中发挥了巨大的作用，在畜禽传染病方面主要用于猪瘟、猪口蹄疫、禽流感、鸡新城疫、鸡马立克氏病、传染性支气管炎等。
　　 

　　１ 核酸疫苗的产生背景
　　

　　在过去的２０世纪中，疫苗研究取得了巨大成功，它是继柯赫、巴斯德等人的科学突破而迅速发展起来的，经历了一个由“期盼”到“实现”这样一个伟大的历史转变过程。疫苗免疫接种所经过的第一次重大变革是由Ｐａｓｔｅｕｒ等研制开发的减毒或灭活的疫苗（ｌｉｖｅ ｖａｃｃｉｎｅ），第二次是使用完整生物体的天然成分即亚单位疫苗（ｓｕｂｕｎｉｔ ｖａｃｃｉｎｅ）。它们虽然在一定程度上提高了免疫效应，但安全性不够，尤其是对免疫功能低下患者的风险较大。为此，人们进行了大量的试验。１９９０年Ｗｏｌｆｆ等偶然发现给小鼠肌肉注射外源性重组质粒后，质粒被摄取并能在体内至少两个月稳定地表达所编码蛋白。１９９１年Ｗｉｌｌｉａｍｓ等发现外源基因输入体内的表达产物可诱导产生免疫应答。１９９２年Ｔａｎｇ等将表达人生长激素的基因质粒ＤＮＡ导入小鼠皮内，小鼠产生特异性抗体，从而提出了基因免疫的概念。１９９３年Ｕｌｍｅｒ等证实小鼠肌肉注射含有编码甲型流感病毒核蛋白（ＮＰ）的重组质粒后，可有效地保护小鼠抗不同亚型、分离时间相隔３４年的流感病毒的攻击。随后的大量动物实验都说明在合适的条件下，ＤＮＡ接种后既能产生细胞免疫又能引起体液免疫。因此，１９９４年在日内瓦召开的专题会议上将这种疫苗定名为核酸疫苗。核酸疫苗的出现与发展是疫苗发展史上的第三次革命。
　　 

　　２ 核酸疫苗的特点
　　

　　２．１ 与传统的灭活疫苗、亚单位疫苗和基因工程疫苗相比，核酸疫苗具有如下优点：
　　 

　　２．１．１免疫保护力增强：接种后蛋白质在宿主细胞内表达，直接与组织相容性复合物ＭＨＣＩ或ＩＩ类分子结合，同时引起细胞和体液免疫，对慢性病毒感染性疾病等依赖细胞免疫清除病原的疾病的预防更加有效。
　　

　　２．１．２ 制备简单，省时省力：核酸疫苗作为一种重组质粒，易在工程菌内大量扩增，提纯方法简单，且可将编码不同抗原基因的多种重组质粒联合应用，制备多价核酸疫苗，这样可大大减少人力、物力、财力以及多次接种带来的应激反应。
　　 

　　２．１．３ 同种异株交叉保护：这是基因疫苗的最大优点之一。在制备基因疫苗时，可通过对基因表达载体所携带的靶基因进行改造，从而选择抗原决定簇。
　　

　　２．１．４ 应用较安全：接种核酸疫苗后，蛋白质抗原在宿主细胞内表达，无因毒力返祖或残留毒力病毒颗粒而引发疫病的危险，也不会引起对机体的不良反应。
　　

　　２．１．５ 产生持久免疫应答：免疫具有持久性，一次接种可获得长期免疫力，无需反复多次加强免疫。Ｗｏｌｆｆ等报道，在注射后１９个月仍可检测到外源基因相当数量的表达。
　　 

　　２．１．６ 贮存、运输方便：核酸疫苗的质粒ＤＮＡ稳定性好，便于贮存和运输，无须冷藏。
　　 

　　２．１．７ 可用于防治肿瘤：ＣＴＬ应答也是机体杀死癌变细胞的有效清除途径。若能找到在细胞恶性转化过程中的关键蛋白，就能制备肿瘤的ＣＴＬ疫苗。该基因疫苗接种后，可诱发机体产生ＣＴＬ免疫应答，对细胞的恶变进行免疫监视，对癌变的细胞产生免疫应答，从而为癌症的预防和免疫治疗提供强有力的新式武器。
　　 

　　２．２ 虽然ＤＮＡ疫苗可能会给某些疾病防治带来一场根本性的变革，但是还有许多急待解决的问题，例如疫苗的生产工艺、质量标准、制剂、效用和安全性等。这些潜在的危险因素主要概括为：
　　 

　　２．２．１ 质粒ＤＮＡ可能诱导自身免疫反应，但是人和动物的许多试验表明质粒ＤＮＡ诱发自身免疫性疾病的可能性较小。目前已有一项ＤＮＡ疫苗的接种研究表明，免疫动物血清中未检测到抗ＤＮＡ抗体。但在ＤＮＡ疫苗的临床试验中。应对接种者进行抗ＤＮＡ抗体检测。
　　

　　２．２．２ 持续表达外源抗原可能产生一些不良后果。质粒长期过高水平地表达外源抗原，可能导致机体对该抗原的免疫耐受或麻醉。在成年动物，尚未见到因ＤＮＡ疫苗接种而诱发免疫耐受的例子。但新生动物的免疫系统尚未成熟，可能将外源抗原认为自己成分而形成耐受。另外，持续低水平表达的抗原可能会被血中的中和抗体清除，不能引起足够的免疫应答，从而使疫苗的预防作用得不到充分的体现。
　　 

　　２．２．３ 肌肉注射质粒后，仅有很少部分被肌细胞所摄取，反复用ＰＣＲ技术检查血中质粒，结果为阴性，揭示肌注后逸入血流的疫苗质粒数量是微不足道的，质粒去向如何尚待进一步阐明。
　　 

　　２．２．４ 影响核酸疫苗诱发机体免疫应答的因素很多，目前已知的主要有载体设计、核酸疫苗的导入方法、佐剂及辅助因子会对其免疫效果有影响。另外年龄和性别因素、肌注剂量和体积、预先注射蔗糖溶液等都会对肌注质粒ＤＮＡ表达有影响。
　　

　　２．２．５外源ＤＮＡ注入体内后，可能整合到宿主基因组上，使宿主细胞抑癌基因失活或癌基因活化，使宿主细胞转化成癌细胞，这也许是核酸疫苗的诸多安全性问题中最值得深入研究的地方。Ｗｈａｌｅｎ等认为：通常用于实验核酸免疫的剂量（１００ｕｇ质粒）相当于１０１３拷贝，当注入肌肉后，绝大部分被降解和清除，但此问题仍待进一步研究证明。
　　 

　　３ 核酸疫苗的免疫机理
　　 

　　关于核酸疫苗的免疫机理，到目前为止还不十分清楚。综合各种论述，其免疫机理主要可以归纳为以下几点：
　　 

　　３．１ 核酸疫苗是近年发展的一种核酸介导的免疫接种疫苗，其本质是含有病原体抗原基因的真核表达载体
　　

　　当它被导入机体后，可被机体细胞所摄取并表达病原体的抗原蛋白，从而诱发机体对该蛋白的免疫反应。随着导入途径和部位的不同可引发全身或局部的免疫反应。在全身性的免疫应答反应中，既可激活体液免疫，也可诱发细胞免疫。
　　 

　　３．２ 核酸疫苗可以引发全面的免疫应答
　　 

　　当带有高效表达调控序列的保护性抗原基因导入动物体细胞（任何有核细胞）后，只有少量被细胞摄取而进入细胞核，在载体上的启动子调控下，转录出抗原基因ｍＲＮＡ，后者进入胞浆而转译出相应的抗原蛋白。抗原呈几种方式而呈递到免疫系统：①抗原在细胞内经加工后与ＭＨＣＩ分子结合呈递到细胞表面，刺激细胞毒性Ｔ淋巴细胞（ＣＴＬ）；②蛋白质从细胞中释放出来与Ｂ细胞受体结合，刺激Ｂ细胞；③部分释放出的蛋白质被抗原呈递细胞所吸收、降解，然后与ＭＨＣＩＩ分子结合后刺激辅助性Ｔ细胞，最终引发了免疫系统的响应。免疫系统的响应程度，它与不同的免疫部位、细胞的表达程度和是否增加免疫调节基因有关。
　　 

　　３．３ 核酸疫苗还可诱发局部的免疫应答和免疫记忆
　　

　　如果用基因枪将包裹有核酸疫苗的金颗粒导入粘膜下，即可能被粘膜下丰富的粘膜相关淋巴组织中的淋巴细胞或粘膜上皮细胞摄取并表达，产生的抗原蛋白也很容易被局部丰富的抗原提呈细胞（ＡＰＣ）识别、摄取、加工并提呈给ＴＨ细胞，进一步激活局部淋巴滤泡中的Ｂ细胞分化为浆细胞和Ｂｍ细胞，后者产生免疫记忆，前者可合成ＩｇＡ，且两个ＩｇＡ单体有Ｊ链连接在一起，通过粘膜时，由粘膜上皮细胞产生的分泌片与双体ＩｇＡ连接，组成稳定的分泌型ＩｇＡ随粘膜分泌液一起排出细胞，分布于粘膜表面，在粘膜局部防御感染中起十分重要的作用。
　　 

　　３．４ 近年来发现细菌ＤＮＡ本身也是一种免疫佐剂，可有效地激活免疫效应细胞
　　

　　介导这一作用是一类具有特征性的短核苷酸序列，被称为免疫刺激ＤＮＡ序列（Ｉｍｍｕｎｎｏ－ｓｔｉｍｕｌａｔｏｒｙ ＤＮＡ ｓｅｑｕｅｎｃｅ?熏 ＩＳＳ）。ＩＳＳ的发现以及对其生物学功能研究的不断深入，扩展了人们对ＤＮＡ生物学的新认识。有学者认为，对ＩＳＳ的研究有望提供一种高效、低毒、适用于人类及动物的新型佐剂。
　　 

　　３．５ 还有人认为ＤＮＡ免疫时，肌细胞和抗原提呈细胞（ＡＰＣ）均被转染，引起ＣＤ４＋、ＣＤ８＋Ｔ细胞亚群的同时活化，产生了特异性免疫应答。肌肉细胞如何吸收质粒ＤＮＡ，机制尚不明确。有人提示可能与骨骼肌纤维有丰富的含多处内折的Ｔ小管系统有关，其独特的解剖结构有助于质粒ＤＮＡ的吸收。
　　 

　　４ 核酸疫苗免疫效果的影响因素
　　 

　　４．１ 质粒载体和启动子的选择
　　

　　真核表达质粒是核酸疫苗的主体，表达载体表达抗原蛋白的能力越强，诱发宿主产生的免疫应答能力越强。不同类型的启动子／增强子、内含子序列、翻译起始序列、转录终止序列、ｍＲＮＡ的稳定性等调控元件可直接影响基因表达效率，其中启动子是影响核酸疫苗表达的最重要因素。ＲＳＶ启动子／增强子的表达水平比ＳＶ高１０００倍，ＣＭＶ启动子／增强子的表达水平又比ＲＳＶ高２倍。一般认为ＣＭＶ是最理想的启动子。强启动子可以产生较好的免疫应答，但弱启动子可能诱导长期的持续性免疫应答。总之，要求用作核酸疫苗的载体必须具备以下特点：在哺乳动物细胞内能高水平的表达目的基因；本身不复制；不会整合到宿主染色体中。
　　 

　　４．２ 注射途径与方法
　　

　　核酸疫苗免疫接种的方法主要分为三种：①可产生高转染效率的途径，如肌肉接种；②转染效率虽不高，但是经常被用于实验动物接种的途径，如皮下、腹腔内接种；③转染效率不高，但有高水平的局部免疫监视，如皮肤、呼吸道接种。一般地，用注射器直接注射要求ＤＮＡ为１０～２００ｕｇ，用基因枪注射要求的ＤＮＡ量可少至亚纳克级。Ｆｒｎａｎ用５０～１００ｕｇ甲型流感病毒血凝素（ＨＡ）基因的纯ＤＮＡ于０及４周各接种一次小鼠，比较了不同的注射途径和方法对核酸疫苗的免疫效果的影响。结果发现静脉内、腹腔内和肌肉内合并免疫及单独肌肉内、静脉内、鼻腔内、皮内、腹腔内和皮下免疫的各组存活率分别为９５％、９５％、８３％、７６％、７５％、６７％和０。说明多种途径合并注射免疫效果最好，其它依次为肌肉内、静脉内、鼻腔内、皮内和皮下接种。随着技术的发展，目前最为有效的核酸疫苗免疫途径是使用基因枪将ＤＮＡ包被的金颗粒注入表皮。这种方法只需比普通注射法低２～３个数量级的ＤＮＡ，即０．４ｕｇＤＮＡ免疫２次即可产生９５％的保护作用。Ｈｕｉ等首先报道了基因枪转染法诱导细胞介导的免疫应答。他们以１～２ＫｂＭＨＣ抗原基因通过外科手术暴露小鼠靶细胞后进行肌肉或脾内接种，结果产生了同样特异的ＣＴＬ应答。基因枪技术使有效的转染与有效的抗原提呈和识别相结合。ＤＮＡ包被的金颗粒射入表皮后，ＤＮＡ随之提呈细胞（ＡＰＣ）。此外，一些学者报道，用无针喷气注射器的免疫效果明显，优于常规注射器免疫。这种装置以压缩空气驱动活塞，高压下使接种物形成细流而穿过组织。临床上已被用于肌注传统疫苗及皮下接种药物（胰岛素）。以此法注射含报告基因的质粒后可测出报告基因的表达，虽然仅及肌注表达水平的１／１０，但能同时产生针对抗原的抗体和ＣＴＬ。
　　 

　　４．３ 接种部位的预处理
　　

　　Ｄａｖｉｓ等报告，试验组小鼠免疫前肌肉注射１００ｕｌ１０ｍｍｏｌ／Ｌ心肌毒素（ｃａｒｄｉｏｔｏｘｉｎ），对照组注射高渗蔗糖（２５％Ｗ／Ｖ，用ＰＢＳ溶解），然后两组分别接种等量ＨＢｓＡｇＤＮＡ疫苗。结果试验组抗～ＨＢｓ水平较对照组高１０倍以上。Ｄａｎｋｏ等报告，在ＤＮＡ接种前７天注射０．５％～０．７５％丁哌卡可使外源基因的表达提高４０倍以上，它能选择性地破坏肌细胞，引起肌细胞再生，而再生肌细胞表达外源ＤＮＡ的能力高于成熟肌细胞。
　　 

　　４．４ 接种剂量与次数
　　

　　核酸疫苗的特点是在体内的表达量低，但是持续时间长。核酸疫苗在动物或临床试验中的免疫程序一般都是３次，大动物或人体的接种量一般为５００～１０００ｕｇ。多数加强免疫在小动物中可以达到增强免疫应答和获得理想免疫保护效果的目的。Ｕｌｍｅｒ等报告，给小鼠分别注射１～１００ｕｇ甲型流感病毒ＨＡ或ＮＰ ＤＮＡ疫苗，结果抗～ＨＡ和抗～ＮＰ水平与接种剂量呈正相关。
　　 

　　４．５ 免疫佐剂
　　

　　免疫佐剂指与抗原同时或预先应用，能增强机体针对抗原的免疫应答能力，或改变免疫应答类型的物质，包括无机佐剂（如氢氧化铝）、有机佐剂（如脂多糖、分支杆菌）及合成佐剂?穴如双链多聚肌苷酸：胞苷酸?眼Ｐｏｌｙ Ｉ：Ｃ?演?雪。近年来随着细胞因子研究的进展，发现许多细胞因子也具有明显的免疫佐剂效应，能增强特异抗原的免疫原性或增强机体对抗原的反应性，这些细胞因子包括ＩＬ－１、ＩＬ－２、ＩＦＮ－ｒ、ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ－６、 ＩＬ－１２等。Ｗｅｉｎｅｒ等用包含ＣｐＧ序列（质粒骨架中含ＣｐＧ序列）的ＤＮＡ作为免疫佐剂和一种淋巴瘤抗原共同免疫小鼠，发现免疫后小鼠能抵抗攻毒试验，而且ＣｐＧ佐剂的毒性远低于完全福氏佐剂，另外，ＣｐＧ佐剂也能显著提高抗肿瘤单克隆抗体在小鼠中的抗肿瘤效果。
　　 

　　５ 核酸疫苗在传染病防治研究中的应用
　　 

　　近年来有关质粒ＤＮＡ疫苗在人类及动物产生预防和治疗作用的研究报道不断增加，应用范围也逐渐扩大。人们期望用核酸疫苗来征服诸如微生物感染性疾病、寄生虫病等顽症，并用于肿瘤、遗传病和其他多种疾病的基因水平治疗，所以作了多方面的尝试。
　　 

　　５．１ 病毒感染性疾病的核酸疫苗
　　

　　病毒的减毒、灭活疫苗已有成功的范例，但在艾滋病（ＡＩＤＳ）等病毒感染性疾病的应用中显然不够理想。目前，用于病毒性疾病治疗方面主要有牛疱疹病毒、禽流感（ＡＩ）、伪狂犬病、肺霉形体、狂犬病、牛病毒性腹泻、猪瘟病毒、猪口蹄疫病毒、甲型流感病毒核蛋白（ＮＰ）、轮状病毒以及乙型肝炎（ＨＢＶ）、丙型肝炎（ＨＣＶ）。
　　 

　　５．２ 非病毒微生物感染性疾病的核酸疫苗
　　 

　　非病毒微生物感染时，非病毒微生物蛋白都由微生物本身表达，而不是被宿主细胞表达，因此核酸疫苗免疫后，在真核细胞内表达的非病毒微生物蛋白有可能产生不同类型的非自然感染状态下的蛋白。但是迄今为止，许多实验表明，向动物体内注射编码非病毒微生物蛋白的核酸疫苗后，非病毒微生物蛋白可在注射部位原位表达，引发保护动物免受非病毒微生物攻击的免疫反应。目前，用于防治非病毒微生物引起的疾病主要有结核病、肺炎支原体感染、肺炎球菌感染、幽门螺旋杆菌感染、破伤风杆菌感染、布鲁杆菌感染、沙眼衣原体感染、考德里立克次体感染、莱姆病等。但是从目前的试验结果来看，核酸疫苗的预防疗效还存在着种种不足，尚进一步研究阐明。
　　 

　　５．３ 寄生虫核酸疫苗
　　

　　寄生虫所致疾病种类多、分布广、危害大。抗寄生虫感染是一个世界性的问题，但是由于虫体的抗药性，以及现有各种寄生虫疫苗存在的种种尚难解决的问题，寄生虫病还不能有效地进行防治。但是，核酸疫苗的出现给人类抗寄生虫感染带来了新的希望。迄今为止，主要开展了针对疟原虫、利氏曼原虫、血吸虫及囊虫病核酸疫苗的研究，取得了一定效果。
　　 

　　５．４ 肿瘤核酸疫苗
　　

　　肿瘤是机体中正常细胞在各种致瘤因素的长期影响和作用下，发生过度增生和异常分化所形成的新生物（ｎｅｏｐｌａｓｍ），通常表现为肿块。随着人类对肿瘤认识的加深，ＤＮＡ疫苗开始应用于肿瘤的预防和治疗，而且偏重于治疗，在这个意义上肿瘤的核酸疫苗同时又是核酸药物。目前，随着研究的发展，ＤＮＡ疫苗为治疗恶性肿瘤提供了新的思路，主要有：①激发免疫系统杀死致癌病毒；②激发免疫系统识别并消除表达共同癌细胞信号的癌细胞；③转染和表达基因工程蛋白，从而使癌细胞成为更好的免疫靶子。将编码肿瘤相关抗原的基因转导到肿瘤细胞内表达，可提高肿瘤的免疫原性，从而增强宿主抗肿瘤的免疫应答。
　　

　　６ 核酸疫苗的发展前景
　　

　　核酸疫苗的研究只是近十几年发展起来的一项新的生物技术，它已成为疫苗研究领域中的热点之一，特别是其研究方向与世界卫生组织儿童疫苗计划的长远目标（用一种疫苗预防多种疾病）相吻合。现在已获得了迅速的发展。它的研究具有深远意义，可用于细菌、病毒、寄生虫等多种疾病的防治，其多价、高效、廉价等优点使其潜在的应用价值不可估量。核酸疫苗可能对人类疾病的防治以及畜牧业的健康发展起到划时代的作用。
　　 

　　目前，人们对核酸疫苗的研究日益深入，其中艾滋病和Ｔ细胞淋巴瘤的核酸疫苗已进入了临床前阶段，前列腺癌、肺癌、乳腺癌等核酸疫苗也正处于研究阶段。美国ＦＡＤ已批准乙肝疫苗等１０余种ＤＮＡ疫苗进入临床试验，这预示核酸疫苗在２１世纪将成为人类和动物与各种疾病抗争的有利武器，也显示出核酸疫苗的巨大潜力和应用前景。
　　

　　但是，人们对ＤＮＡ免疫的作用机理和如何提高免疫水平仍然需要进一步研究。如外源ＤＮＡ进入体内后，就无法认定控制其免疫途径，外源ＤＮＡ在体内各器官是否表达，摄入ＤＮＡ后如何进行抗原呈递？如何增强其免疫应答水平？同时ＤＮＡ疫苗的构建以及生产方面还存在需要改进的地方。尽管核酸疫苗接种后引进的宿主细胞发生恶性转化的可能性很少，但在短期内很难代替目前大量使用的传统疫苗。
　　 

　　总之，核酸疫苗的未来研究方向是要朝着理想疫苗的方向发展，即从疫苗本身的角度出发，要朝向“原始疫苗的方向”发展，即注重个性，得到全息多表位的疫苗，还要注重载体及佐剂的研究。为此，要寻求病毒粒子中与致病力密切相关的安全性问题能够得到解决，再加上目前最有效的基因免疫接种方法——基因枪疫苗接种能够解决注射疫苗的费时、费力和需要反复注射（特别是对于动物）等问题，那么核酸疫苗就会成为疫苗的新希望，可能导致疫苗领域的一场革命。
　　
来源：中国饲料信息网

http://www.ivdc.gov.cn/xinwen/sy/t20030702_3696.htm

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http://web.gzsums.edu.cn/ykc/msgshow.php?bk=sys_bd_misc&newsid=8a4e446895399d723474db53b11b7233

http://www.hbvhbv.com/forum/viewthread.php?tid=286928&replyID=569448&skin=1

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rts6666

411的徒弟

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http://cmbi.bjmu.edu.cn/news/report/2004/vaccines.htm

	ISSN 1009-3079 CN 14-1260/R 世界华人消化杂志 2007年1月8日;15(1):61-63 小鼠对乙肝病毒小基因嵌合DNA疫苗免疫应答 张建军, 杨向东, 史小玲, 袁志平, 王 超
	张建军, 泸州医学院附属医院感染病科 四川省泸州市 646000 张建军, 杨向东, 泸州医学院附属医院分子医学中心实验室 四川省泸州市 646000 史小玲, 泸州医学院附属医院传染与免疫研究室 四川省泸州市 646000 袁志平, 宜宾市第二人民医院肿瘤科 四川省宜宾市 644000 王超, 山东省疾病控制中心 山东省济南市 2500014 四川省卫生厅资助项目, No. 000111 通讯作者: 张建军, 646000, 四川省泸州市, 泸州医学院附属医院感染病科. [email protected] 收稿日期: 2006-09-21 接受日期: 2006-10-11 Immunologic response to a hepatitis B virus small gene chimeric DNA vaccine in mice Jian-Jun Zhang, Xiang-Dong Yang, Xiao-Ling Shi, Zhi-Ping Yuan, Chao Wang Jian-Jun Zhang, Department of Infectious Diseases, the Affiliated Hospital of Luzhou Medical College, Luzhou 646000, Sichuan Province, China Jian-Jun Zhang, Xiang-Dong Yang, Central Laboratory for Molecular Medicine, the Affiliated Hospital of Luzhou Medical College, Luzhou 646000, Sichuan Province, China Xiao-Ling Shi, Department of Infectious Diseases and Immunology, the Affiliated Hospital of Luzhou Medical College, Luzhou 46000, Sichuan Province, China Zhi-Ping Yuan, Department of Oncology, the Second People’s Hospital of Yibin City, Yibin 644000, Sichuan Province, China Chao Wang, Shandong Provincial Center for Disease Provention and Control, Ji’nan 2500014, Shandong Province, China Supported by Sichuan Provincial Bureau of Health, No. 000111 Correspondence to: Jian-Jun Zhang, Department of Infectious Diseases, the Affiliated Hospital of Luzhou Medical College, Luzhou 646000, Sichuan Province, China. [email protected] Received: 2006-09-21 Accepted: 2006-10-11 Abstract AIM: To investigate the immunologic response to pcHBV-CD80, a hepatitis B virus (HBV) small gene chimeric DNA vaccine containing CD80, in mice. METHODS: Five randomly divided mouse groups were inoculated twice at a 2-week interval by intramuscular injection with pcHBV-CD80 (containing HBV-preS2 120-134, core 47-56, core 57-76, core 170-180 and human CD80 genes), pcHBV (containing HBV-preS2 120-134, core 47-56, core 57-76 and core 170-180 genes), pcDNA-CD80 (containing human CD80 gene), pcDNA3.1(empty plasmid), and normal saline, respectively. The levels of specific antibodies, interferon-γ (IFN-γ) and the rate of lymphocyte transformation in the mice were detected. RESULTS: Both plasmids pcHBV-CD80 and pcHBV induced the production of specific antibodies, and the levels of anti-preS2 and anti-HBc were not significantly different between the former two groups (anti-preS2: 15125.52 nkat/L vs 14463.56 nkat/L; anti-HBc: 7607.35 nkat/L vs 7711.21 nkat/L; both P > 0.05). However, pcHBV-CD80 had a higher efficacy in increasing the production of γ-IFN (1266.7 ng/L vs 986.3 ng/L, P < 0.01) and lymphocyte transformation rate than pcHBV did. CONCLUSION: HBV small gene chimerical DNA vaccine containing CD80 can stimulate the specific humoral and cellular immunologic responses in mice. Key Words: Chimeric DNA vaccine; Small gene; CD80 molecule; Hepatitis B virus Zhang JJ, Yang XD, Shi XL, Yuan ZP, Wang C. Immunologic response to a hepatitis B virus small gene chimeric DNA vaccine in mice. Shijie Huaren Xiaohua Zazhi 2007;15(1):61-63 摘要 目的: 探讨含CD80的乙肝病毒小基因嵌合DNA疫苗的免疫应答. 方法: 以乙肝病毒小基因嵌合DNA疫苗pcHBV-CD80(含CMV启动子、HBV-preS2片段、HBV-C片段和CD80)、pcHBV (含CMV启动子、HBV-preS2片段、HBV-C片段), 以及质粒pcDNA-CD80、pcDNA3.1和生理盐水, im免疫小鼠2次(间隔2 wk), 末次接种后2 wk时检测特异性抗体、γ-IFN水平和淋巴细胞转化率. 结果: 质粒pcHBV-CD80和pcHBV免疫后均可检测到特异性的抗体, 抗-preS2在pcHBV-CD80组和pcHBV组分别为15125.52 nkat/L和14463.56 nkat/L; 抗-HBc在pcHBV-CD80组和pcHBV组分别为7607.35 nkat/L和7711.21 nkat/L, 两组间无明显差异; 但pcHBV-CD80更能增加γ-IFN的产生(1266.7 ng/L vs 986.3 ng/L, P<0.01), 并增强免疫小鼠的激淋巴细胞转化. 结论: 含CD80的乙肝病毒小基因嵌合DNA疫苗可诱导特异性的体液免疫和细胞免疫应答. 关键词: 嵌合DNA疫苗; 小基因; CD80分子; 乙型肝炎病毒 张建军, 杨向东, 史小玲, 袁志平, 王超. 小鼠对乙肝病毒小基因嵌合DNA疫苗免疫应答. 世界华人消化杂志 2007;15(1):61-63 http://www.wjgnet.com/1009-3079/15/61.asp 0  引言 机体彻底清除受感染肝细胞内的乙肝病毒(HBV), 需要针对C抗原的细胞免疫功能, 即 CTLs的功能[1]. 我们选择已经明确之HBV preS2区主要编码B细胞表位的基因, 与C区T细胞表位编码基因相嵌合, 构建了小基因DNA疫苗, 再将共刺激因子CD80嵌合新型的疫苗, 免疫小鼠后, 研究该新型疫苗在小鼠中的体液免疫和细胞免疫应答情况. 1  材料和方法 1.1 材料 嵌合乙肝小基因DNA疫苗pcHBV和pcHBV-CD80由本室构建, 经测序确认前者含编码HBV-preS2 120-134, Core 47-56, Core 57-76, Core 170-180位多肽的嵌合基因, 后者含上述基因和人CD80基因(另文发表); 6 wk龄、清洁级的健康小鼠C57BL/6N, 由泸州医学院实验动物中心提供, 体质量18-22 g. 随机分为(1)pcHBV-CD80疫苗组; (2)pcHBV组; (3)pcDNA-CD80组; (4)空载体pcDNA3.1组和(5)空白对照组; 每组10只, 雌雄各半; 抗-preS2和抗-HBc EIA检测试剂盒购自北京肝炎试剂研制中心; IFN-γ检测试剂盒由晶美公司提供; MTT细胞增殖试验试剂盒购自Roche公司. 1.2 方法 取纯化后的质粒DNA 10 μL稀释至含9 g/L NaCl溶液的3 mL比色皿中, 以生理盐水为空白对照, 以A260/A280≥1.8为纯度合格要求, 稀释质粒DNA至1. 0 g/ L, -20℃保存备用. 第(1)、(2)、(3)、(4)组每只小鼠两侧股四头肌共注射100 μL(每侧50 μL) 相应质粒DNA, 第(5)组即空白对照组同法注射100 μL生理盐水; 2 wk后同法加强免疫一次. 1.2.1 抗-preS2、抗-HBc和IFN-γ的检测 末次免疫后2 wk处死小鼠, 心脏采血, 3000 r/min离心30 min分离血清, -20℃冻存, 按北京肝炎试剂研制中心的抗-preS2和抗-HBc EIA检测试剂盒进行检测, 方法按说明书进行. IFN-γ的检测, 按晶美公司ELISA检测试剂盒说明书操作. 1.2.2 脾淋巴细胞转化实验 于免疫后的第5周, 每组随机抽取5只小鼠, 无菌取脾, 常规方法制备脾细胞悬液, 用1640液调细胞浓度至1×1010/L时, 作ConA(5 mg/ L)刺激, 并以单纯1640培养液作对照孔; MTT(5 mg/L) 染色, 测A570, 计算刺激指数(SI)∶SI = ConA 刺激孔A均值/对照孔A均值.     统计学处理 组间计量资料采用校正t检验, 双侧检验, α = 0.05.     2  结果 2.1 诱导小鼠抗-preS2、抗-HBc和IFN-γ的产生 免疫后第2周, 抗-preS2在(1)和(2)组分别可检测到15 125.52±377.24 nkat/L和14 463.56±331.07 nkat/L; 抗-HBc在(1)和(2)组分别可检测到7607.35±428.59 nkat/L和7711.21±312.90 nkat/L, 两组抗体滴度无显著差异; 而(3), (4), (5)组未检测到相应抗体. IFN-γ的产生, 在不同的组间, 出现比较大的差别: (1)组平均值高达1266.7 ng/L, (2)组也平均产生了986.3 ng/L, (3)组平均533.6 ng/L, (4)组和(5)较低(表1). 　 表1 IFN-γ的检测结果(mean±SD, ng/L)   2.2 淋巴细胞转化实验结果 (1), (2), (3), (4)和(5)组的淋巴细胞转化实验刺激指数均值分别为4.914±0.667、3.421±0.352、2.353±0.264、1.356±0.135和1.313±0.198, (1)组与其他各组有显著性差异; (2)组与(3), (4)和(5)有显著性差异; (3)组与(4)和(5)有显著性差异; 而(4)和(5)间无差异.    3  讨论 1970年代, 乙型肝炎(HB)病毒(HBV)的发现和HB的肆虐, 催生了HBV疫苗. 30余年来, HBV疫苗的种类已由最初单一血源HBV疫苗发展为目前的多种基因重组HBV(rHBV)疫苗[1-3], 而用于免疫治疗研究的, 则多为核酸疫苗(DNA疫苗).     蛋白质抗原抗原提呈细胞摄取后, 将被降解成8-12个氨基酸的短肽, 这些短肽带有不同的抗原表位, 分别与MHCⅠ类和MHC Ⅱ类分子结合并被提呈到细胞表面, 与MHCⅠ类分子结合的短肽激活CD8+T细胞(CTL), 与MHCⅡ类分子结合的短肽激活CD4+T细胞, 而分泌到细胞外的抗原则被表达相应抗体的B细胞捕捉, 并在Th细胞分泌淋巴因子的刺激下转化为浆细胞, 大量分泌抗体. 人体感染HBV后, 血清中病毒主要依靠特异性保护抗体, 即抗-HBs清除, 而肝细胞中的病毒, 则需要特异性细胞毒淋巴细胞(CTLs)来清除, 主要是针对HBcAg的CTLs[4-5]. 根据这个原理, 治疗慢性HBV感染的疫苗, 应该满足既能诱导体液免疫、又能激发细胞免疫. DNA疫苗, 或核酸疫苗, 应用于慢性HBV感染治疗的研究, 已经取得了初步的效果. DNA疫苗可以明显增强受试者的细胞免疫应答[6-7]. 而只含有HBcAg第18-27位氨基酸的疫苗, 也能诱导明显的T细胞应答[5], 说明只含有B细胞表位和T细胞表位的疫苗, 能够取代大分子的亚组分疫苗. 本研究选择含编码HBV-preS2 120-134, Core 47-56, Core 57-76, Core 170-180位多肽[8]的嵌合基因, 所构建的DNA疫苗, 在小鼠体内, 能够诱导出特异性抗体, 也能有效刺激γ-IFN和淋巴细胞转化. 国内赫兢等研究也发现, HBV preS2核酸疫苗的免疫接种效果, 比S核酸疫苗好[9].     有研究显示, 与乙肝疫苗强应答者相比, 无、弱应答者外周血单个核细胞(PBMC)体外对外源性rHBsAg刺激的增殖反应明显低下, PBMC 共刺激分子CD80, CD86的表达显著降低, IL-12和IL-10的产生均有所减少, 说明rHBsAg诱导的免疫应答中, 共刺激信号以及促进TH1细胞和TH2细胞增殖分化的细胞因子都明显不足[10]. 向机体APC细胞提供CD80分子, 增加表达, 应该是解决该问题的思路之一. 本研究所构建的嵌合DNA疫苗pcHBV-CD80, 尽管在诱生抗体水平, 与无CD80质粒间无差异, 但其IFN-γ水平、淋巴细胞转化方面, 明显优于无CD80质粒. 本研究显示, preS2区主要编码B细胞表位的基因, 与C区T细胞表位编码基因, 以及CD80嵌合的新型疫苗, 能够有效诱导机体体液免疫和细胞免疫应答. 4    参考文献 1     洪源, 成军. 肝炎病毒DNA疫苗的研究. 世界华人消化杂志  2002; 10: 221-222  WCJD 2     陈仕珠, 高建宏. 乙肝病毒疫苗的类型及其免疫原性和安全性. 世界华人消化杂志  2006; 14: 2696-2700  WCJD 3   洪源, 成军, 董菁, 李克, 王琳, 王刚, 刘妍. 乙型肝炎病毒HBsAg重组疫苗与表面抗原DNA疫苗诱导H-2b小鼠免疫应答的实验研究. 世界华人消化杂志  2002; 10: 137-140  WCJD 4   梁扩寰, 李绍白. 肝脏病学. 北京: 人民卫生出版社, 1995: 496 5     Huang CF, Lin SS, Ho YC, Chen FL, Yang CC. The immune response induced by hepatitis B virus principal antigens. Cell Mol Immunol   2006; 3: 97-106   PubMed 6     Shata MT, Pfahler W, Brotman B, Lee DH, Tricoche N, Murthy K, Prince AM. Attempted therapeutic immunization in a chimpanzee chronic HBV carrier with a high viral load. J Med Primatol  2006; 35: 165-171   PubMed 7     Thermet A, Rollier C, Zoulim F, Trepo C, Cova L. Progress in DNA vaccine for prophylaxis and therapy of hepatitis B. Vaccine  2003; 21: 659-662    PubMed 8     Engler OB, Dai WJ, Sette A, Hunziker IP, Reichen J, Pichler WJ, Cerny A. Peptide vaccines against hepatitis B virus: from animal model to human studies. Mol Immunol  2001; 38: 457-465   PubMed 9     赫兢, 辛绍杰, 毛远丽, 貌盼勇, 沈宏辉, 杨健洋, 徐军,孔维. 前S2抗原对乙型肝炎DNA疫苗免疫应答的影响. 世界华人消化杂志  2004; 12: 2196-2198  WCJD 10  黄茵, 陈智, 徐承槐, 黄茵, 陈智, 徐承槐, 李敏伟, 蔡玲斐, 金建华. 乙肝疫苗无、弱应答与B72CD28及IL-12、IL-10的相关性. 免疫学杂志  2002; 18: 452-455