乙型肝炎病毒基因型与变异

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乙型肝炎病毒基因型与变异

南方医科大学南方医院　 侯金林 曾国兵 前言 　　乙肝病毒是最小的人类DNA病毒，其基因组全长仅为3200个碱基，以部分环状双链存在。其中负链为完整的环链，包括四个相互重叠的读框：前C/C基因、P基因、S基因和X基因。1988年，Okamaoto等比较了18株HBV全基因序列，将它们分为四组，并命名为A－D， 并指出，依据核苷酸序列异质性≥8% 可将HBV毒株分成不同的基因型，这个分型标准延且至今。进一步研究HBV全基因序列以及它们之间的进化关系，发现另外三个基因型：基因型E、F和G。最近，一种新的HBV基因型在中美洲被发现。 本文就HBV基因型流行病学、分子生物学特征、临床特点以及对抗病毒治疗差异等方面的最新研究进展作一综述。本文结合南方医院感染科在HBV基因型研究方面的工作，主要讨论HBV基因型与慢性乙型肝炎关系研究中一些较为达成共设的发现以及一些尚有冲突的报道(参见Naoumov和侯金林Current Hepatitis Reports 2004, 3: 145-151) 。 流行病学 　　目前对于HBV基因型A－H的认识中，一个最显著的特征是HBV基因型呈一定的地理区域性分布，在不同人种中的流行也存在差异（表略）。A型主要分布于欧洲北部、西部及美国；B、C型主要分布于亚洲；D型是分布最广泛的基因型，是地中海地区和中东的优势基因型，也发现于亚洲少数地区。E型主要分布于非洲撒哈拉沙漠地带且与基因型D有类似的基因特征，异质性最为明显的F型主要分布于南美及中美洲。 　　除了上述主要的HBV基因型外，尚有一些基因亚型被鉴定。一种独特的HBV A基因型亚型在非洲土著居民中被发现并被命名为HBV A’（22，23）。随后在亚洲发现同样的亚群并被命名为Aa亚型（a代表Africa及Asia），将其与在欧洲白种人中发现的HBV Ae亚型（e代表European）分开。HBV Aa及Ae亚型可通过单个核酸多态性差异（SNPs）区分：几乎所有的HBV Ae亚型毒株在nt1809上为核苷酸G，在nt1812为C；而HBV Aa亚型毒株在nt1809及nt1812均为T。根据这些新发现的特点建立了限制性酶切分型技术，能较好地将HBV Aa及Ae亚型区分。 　　HBV基因型B也被分为两个亚型Bj（j代表Japan）与Ba(a代表Asia)。Ba亚型似乎是Bj亚型与HBV基因型C前C/C区重组的结果。Bj亚型在日本HBV B基因型携带者中占很高的比例；而Ba亚型流行于所有其它亚洲国家。从中国的HBV基因型B感染者中通过对前C/C区重组位点的鉴定，在中国东南地区发现另外一个HBV B基因型亚型，被认为是在宿主对前C/C区免疫压力下进化的结果。因而，越来越多的证据表明：不仅在HBV基因型之间，在HBV基因型亚亚之间也存在着地域分布及临床差异。（表略） 　　最近的人口学资料显示HBV基因型与人种以及人口迁移存在一定联系。一份来自香港的对776名慢性HBV感染者调查表明在该地区流行的HBV基因型主要为基因型B-32.5%(其中99%为Ba亚型)和基因型C－62.5%。而在美国的17个肝病中心的联合调查中，在694名连续HBV感染者中发现HBV基因A－G，而且HBV基因型与人种存在很强的联系。其中最多的是基因型A和C，其次为基因型B和D，而基因型E、F和G仅占2%。基因型A存在于白种人与黑种人，基因型B和C几乎均存在于亚洲人。出生于美国的病人中大部分（77%）感染HBV基因型A；出生于亚洲的病人大部分（89%）感染HBV基因型B或C。 　　我们最近中国大陆地区进行了一项研究，样本包括了1096例来自于全国9个省份的慢性HBV感染者标本，结果发现在我国大陆地区流行的HBV基因型有A、B、C、D四种，所占比例分别为1.2%、39.3%、50.2%、8.1%。各地区的HBV基因型分布也大不相同。在北方地区，以基因型C为主，占81.6%；南方则以基因型B为主，基因型C也占相当比例。两种主要的基因型B和C的临床特征比较发现，感染HBV基因型B的人群平均年龄较感染基因型C者小；随年龄增长，基因型C在感染人群中所占比例逐渐增加。在年龄大于30岁的感染者中，感染基因型C者e抗原阳性率显著高于基因型B组，但无论是肝功能受损程度还是肝组织炎症和纤维化程度来看，B型和C型感染者均不明显差异（曾国兵等Journal of Viral Hepatitis 2005）。 　　对慢性HBV感染者的HBV基因型测定可成为追踪人口流动的工具，因为不同的HBV基因型的分布反映出迁移人口的起源地。例如，在南非绝大多数HBV基因型A与D与来自欧洲西北部与南部、印度的移民有关。在新西兰与澳大利亚，基因型A与D同一定比例的基因型C共存，归因于从东南亚地区及亚太地区到该地区的移民。 分子生物学特征 　　一些研究显示，HBV基因型与病毒变异存在着一定的依从关系，特别是发生在C基因启动子区的T1762/A1764变异或发生在前C终止密码子G1896A变异将导致HBeAg表达下调（表略）。 基因型B、C、D与E较易出现前C终止密码子G1896A，而在基因型A则很少发生。这种基因型特异的变异产生的基础在于前C区含有一个发夹形的ε干襻结构，该结构的稳定性取决于nt1858与nt1896配对的情况。在基因型A， nt1858为C能与nt1896的G形成稳定的结构；而在基因型B、C、D与E，nt1858为T与nt1896为G形成的结构不稳定，nt1896的G变异为A可使该结构更为稳定，可以解释该变异在这些基因型中的高流行率。 　　前C区启动子T1762/A1764变异的发生率在基因型A的两个亚型发生率也明显不同，在基因型Aa中更为多见。在ε干襻nt1862的G/A点突变发生于84%的Aa毒株，而在基因型Ae则未有发现，这似乎提示两个亚型之间可能存在病毒复制与HbeAg翻译方面的差异。在基因型Aa最具型特异和最常见的变异为位于前C起始密码上游的T1809与T1812双突变（发生率分别为100%与96%），已往的研究表明该变异能减少HBeAg产生。而在另一个关于基因型A与基因型D的对照研究中，C基因启动子变异的发生率在基因型Aa及Ae均高于基因型D。 　　两个来自亚洲人群的报道指出基因型C较基因型B更易发生C基因型启动子T1762/A1764变异。而在基因B的两个亚型中Ba又较Bj更易出现C基因型启动子T1762/A1764变异。这些报道也说明在日本以外的其它亚洲国家，基因型B与基因型C的重组现象有很高的发生率，因而在感染基因型Ba的人群其HbeAg阳性率要明显高于感染基因型Bj者。 　　基因型特异的氨基酸变异将会影响T细胞表位。例如，HLA－A2限制性CD8+T细胞表位存在于HBV第18－27氨基酸，该表位在基因型A、D（valine at 27）与基因型B、C（isoleucin at 27）是不同的。这些差异可能会影响T细胞对不同基因型感染的免疫应答，但目前尚无相关研究报道。 　　HBV基因型多态性不仅是基因变异，也是基因型之间相互重组的结果。Morzov等分析了99株HBV全序列发现9%的毒株中有基因重组的现象。我们在中国病人的研究发现了基因型C与D重组的证据。对其中8例出现重组的标本进行了HBV全序列测定，与GenBank中已发表的32株HBV全序列进行比较，进化树分析发现以S基因进行分析，都归为D型，但以前C/C和X基因分析则归为C型，利用不同的开放读框做进化树分析，发现这8株均存在基因型重组，利用Simplot软件发现其中7株重组发生在前S2/S区从nt 10 到 nt 799，另1株重组发生在nt 10 到 1499。结果说明基因型间重组体可能有不同的病毒学特点，对HBV的诊断和治疗的影响有待进一步阐明。本研究论著已在Journal Journal of General Virology上发表。 　　其它一些研究也报道了基因型A与D、基因型B与C之间的重组现象。尽管其机理尚不明了，重组现象的发生可能是机体同时或序贯感染多个基因型毒株后长期演变的结果。 　　尽管发生率不高，机体仍有可能同时感染两种不同基因型的HBV毒株。Kato 等分析了8例基因型G感染者HBV病毒分子学特征，发现所有8株HBV基因G毒株均在前C区插入一36bp序列和两个终止密码。研究还显示，所有病人血清HBeAg阳性均为同时感染了基因型A的结果。另外在4例病例中，有3例发现了基因型A与G重组。来自法国的研究也报道了基因型A与基因型G混合感染与重组的现象。 诊断学方法 　　建立精确、简单和经济的基因分型方法对于慢性HBV感染的诊断与治疗具有重要的意义。目前使用的基因分型方法主要包括直接测序、RFLP、基因型特异的PCR，线性探针杂交技术以及酶联免疫吸附法，目前尚未对各分型方法的准确度作出对比与评价。 　　使用线性探针杂交技术检测来自中国和美国的600名HBV感染者证实了其准确性。除了能够对HBV进行基因分型外，该法还能对前C区终止子变异G1896A以及C基因启动子变异进行检测。在该研究中，发现了所有HBV基因型A－H，准确率达99.9%（一例不能检出）。令人关注的是，该方法能检测出多种基因型混合感染，且较直接测序更为敏感。另外的一项研究也证实了这种方法能准确地区分HBV基因型A－G。同前S1/S2区直接测序法相比，两种方法结果有81%样本相符合。而线性探针法在另外19个混合感染样本的检测显示出测序法所没有的优势。目前看来，线性探针杂交法为一种快速、较为准确而且适合临床常规检测的基因分型技术，同时它还能对前C区终止子变异A以及C基因启动子进行检测。 　　此外，还建立了以限制性酶切技术为基础的HBV基因分型方法，但其标准化程度稍差。这种方法主要是通过扩增HBV DNA某一片段后使用特异性内切酶进行分型。近来，区分HBV基因型B的两个亚型的RFLP方法业已建立；使用该法对313名日本HBV基因型B感染者进行分型发现，其中12%为Ba亚型而88%为Bj亚型。进一步的研究发现Ba亚型感染者较Bj亚型者有更高的HBeAg阳性率。这种亚型分型方法有得于对HBV基因型B的分布与特征进行更深入的研究。 值得注意的是由于不同基因型之间重组产生的HBV杂合体毒株可能会影响一些分型方法的准确性。对HBV杂合体感染的基因型分类（如基因型B与C杂合体，基因型A与G杂合体），使用序列不同区段进行测序与进化分析将产生不同的结果。 HBV基因与HBeAg 血清学转换 　　一些对亚洲HBV感染者的研究发现感染HBV基因型B的患者的HBeAg血清自然转阴率要高于感染基因型C的患者，这种现象主要发生在较年轻的患者（表略）。这个现象最初在一个台湾研究中报道，为后来另一包括了146名HBeAg阳性研究对象随访平均52个月的研究所证实。在该项观察中，基因型C的感染者较基因型B者HBeAg血清自然转阴率低，且发生转换的时间要晚10年。在日本，也发现基因型C感染者较基因型B者具有更高的HBeAg阳性率。而另一项来自中国地区的研究也证实以上类似观点为。同样的现象在香港地区也有报道：在年轻患者中感染基因型B者（99%为Ba亚型）较基因型C者有更高的累积HBeAg血清转阴率。与台湾研究有所不同的是，香港地区研究发现基因B与C感染者HBV DNA水平并无明显差异。 　　一项来自西班牙的研究比较了基因型A与基因型D之间的差异。该研究发现基因型A患者较基因型D患者有更高的生化学改善及HBV DNA清除率。另外，该研究还首次发现基因型A患者较基因型D者有更高的HBsAg转阴率。尽管HBeAb的出现率与基因型A或D并无明显关联，在发生血清学转换后持续改善方面，基因型A仍优于基因型D。另一项病例对照研究则比较了基因型A两个亚型之间的差异。研究发现基因型Aa感染者较Ab者HBeAg阳性率低，这可能与在基因型Aa常发生位于前C起始密码上游的T1809与T1812双突变有关。 　　最近，一项来自日本的队列研究发现，在年轻患者中基因型C感染者HBsAg阳性率显著高于基因型D感染者；而在HBsAg阴性患，C基因启动子变异的发生率在基因型C组明显低于基因型D组。 HBV基因型与肝脏病变 　　慢性HBV感染后具有较为广泛的肝脏疾病谱，从几无临床表现的轻症患者到肝硬化甚至肝细胞肝癌。台湾学者Kao首先对基因型与临床结局之间的关系进行了研究。该研究分析了270名主要感染HBV基因型B与C的患者，结果发现在50岁以上肝癌患者中，基因型C比例明显高于基因型B；而与此相反在50岁以下肝癌患者中基因型B则有较基因型C更高的比例。日本一项研究观察了585名HBV感染者以及74名乙肝相关肝癌患者，肝脏病理学证实在进展型肝纤维化患者中基因型B的比例明显低于基因型C中；这种现象只发生于年龄小于45岁的患者，而在大于45岁的患者中两者并未显示出差异；研究者认为基因型B感染较基因型C有更早的血清学转换、更低的肝纤维化程度及肝细胞癌发生率，但在存活期间发展为进展性肝病和肝细胞肝癌的风险两者并无显著差异。一项包括343名香港病例的研究得出相似的结论，在血清HBV DNA水平及肝功能改变方面，基因型B与C并无差异；且在非肝硬化及肝癌患者与肝硬化及肝癌患者组，两基因型分布也未见明显差异。基因型B似乎更易发生前C区终止密码子变异，基因型C则更易发生C基因启动子变异。该研究结论认为尽管基因型B较基因C有较早的HBeAg血清学转换,在向进展性肝病及肝细胞癌的演变两者并无显著差异。 　　HBV基因型对肝细胞癌发生的影响受到许多学者观注，但其中联系仍未十分清楚。最近香港学者对426例病例进行了分析（其中57%为基因型C，42%为基因型B），结论认为基因型C是肝细胞肝癌与肝硬化发展的高危因素之一；这与早些时间台湾的研究一致。但同一地区的其它研究结论则不尽相同。Yuen等研究了90例肝细胞肝癌病例及匹配的180例对象，结果发现基因型C以及C基因启动子变异在肝细胞癌组的发生率显著高于对照组。在感染基因型B（Ba）的病例中，肝细胞癌组C基因启动子变异发生也明显高于对照组。Logistic回归分析显示，与肝细胞肝癌相关的唯一因素为C基因启动子变异，由此可推测基因型C与肝细胞肝癌表现出的相关可能是由于基因型C的HBV毒株更易出现C基因启动子变异。来自台湾的研究也表明感染HBV　C基因启动子变异毒株者，无论其基因型B或C，均有更高的发生肝细胞肝癌的危险。在台湾地区年轻HCC患者中C基因启动子变异的发生率与年长HCC患者类似，但显著高于同等年龄组的静止期感染者（inactive）且与基因型B或C无关。在非洲的黑种人HCC患者中，其C基因启动子变异的发生率也明显高于无症状感染者。 　　有关HBV基因型B与HCC的关系，台湾与日本地区所报道结果也不尽相同。在日本，感染基因型B的HCC患者年龄平均在70岁以上；而感染基因型B者仅为55岁。而在台湾，感染基因型B的HCC患者年龄在50岁或以下，基因型C者则在59岁。这两个地区研究结果的差异可能是由于基因亚型存在所引起。基因亚型Ba存在于日本以外的亚洲地区，而在日本流行的HBV基因型B大部分为Bj亚型。基因亚型Ba较Bj更易出现C基因启动子变异。此外，在基因亚型Ba感染人群中，HCC患者较对照组有更高的C基因启动子变异。这些数据提示在HCC的高危因素中，C基因启动子变异较HBV基因型似乎起着更为重要的作用，这种假设有待的进一步深入的研究证实。 对抗病毒治疗的应答 　　在亚洲感染HBV基因型B或C的慢性肝炎患者对干扰素应答进行回顾性研究显示：基因型B感染者HBeAg血清转阴率较基因型C者高。我们分析了欧洲多个中心随访患者对干扰素应答情况，发现基因型A较基因型D对α干扰素有更好的应答。 　　对于拉米夫定治疗反应，感染HBV基因型B患者与基因型C者相比，两组在HBeAg的血清转阴率并无显著差异。同样的结果也出现在大样本的阿的福韦治疗研究中。两项国际性III期临床试验包括694名患者中，在不同基因型之间HBVDNA抑制与HBeAg的血清转阴率并无显著差异。但是，阿的福韦治疗的时间较短，HBeAg的血清转阴率相对较低；延长治疗时间后，在HBV基因型之间的差异可能显示出来。 最近一些研究还观察了HBV基因型与拉米夫定治疗耐药发生率的关系。在日本，观察213名拉米夫定治疗患者随访一年以上发现YMDD变异的发生率在基因型A、B、C中并无显著差异；但其发生率在基因型Ba中显著高于基因型Bj。在基因型A与基因型D之间也作了相似的研究。析因分素表明，HBV基因型与治疗前HBV DNA水平均与反转录酶区变异发生有关。基因型D感染者更易出现204I变异，而基因型A则更易出现204V与180M变异。这些发现说明在基因型A与D之间，由拉米夫定诱导的反转录酶区变异方式存在一定差异。 　　我们在南方医院收集了247例拉米夫定治疗病例血清标本，应用PCR-RFLP用于筛检拉米夫定耐药变异（YMDD变异），已发现42例感染有YMDD变异株，并进行了治疗前后P基因测序、前C/C变异及基因型分析，结合患者HBV DNA 定量和肝功能变化情况，研究发现治疗前HBeAg阳性和HBV DNA水平超过7.5106 copies/ml者发生YMDD变异的时间较短，YMDD变异出现后ALT水平的上升在HBeAg阳性患者中较明显，而出现YMDD变异后B基因型患者HBV DNA水平上升较C基因型患者更高。P基因测序还发现B基因型和C基因型在YMDD变异的形式上无明显差别（孙剑，等Journal of Medical Virology 2005）。 结论 　　目前的研究结果较为清楚地说明了在HBV基因型之间存在一定的流行病学与临床特征差异（表略）。HBV基因型与人种有很强的关联，通过HBV基因分型研究可以了解人口迁移并能更好地描述HBV感染的地理分布特点。除主要的基因型A－H外，一些亚型也陆续补发现，特别是亚型Ba与Bj、Aa与Ae。许多研究表明亚型与两种基因型的重组有关，这也是HBV病毒变异累积的结果，致使HBV家庭更加多样化。在HBV基因型与病毒变异方式（特别是调节HbeAg表达的变异）之间存在很强的关系，这些变异包括：C基因启动子变异、位于前C起始密码上游的T1809与T1812双突变以及最常见的G1896A终止变异。而HBeAg的转阴率（包括自然的或干扰素诱导）在基因型A显著高于基因型D，基因型B高于基因型C。 　　许多问题仍未十分清楚。需要更深入的研究分析不同HBV基因型之间病毒复制能力及T细胞应答是否存在差异。目前尚无关于HBV基因型之间T细胞应答是否存在差异的研究报道，而T细胞的应答是HBV感染后结局的重要因素。此外，不同HBV基因型的T细胞表位也不明晰。一些HBV基因型重组体被发现，而这些重组体的分布状况以及它们的临床意义仍不清楚。而HBV基因研究最大的障碍来自于其本身分布的地区特异性，大多数研究只能在特定的基因型之间进行比较，如基因型A与D，基因型B与C。开展国际多中心合作研究将有利于阐明所有基因型以及亚型与肝脏疾病发展以HCC发生之间的关系。对于临床工作，有必要建立一种标准化、简单而经济的HBV基因型诊断技术，能准确鉴定HBV基因型与亚型。 　　随着对HBV基因型重要性不断的认识，它将极可能成为HBV感染日常临床诊治工作的一部分；HBV基因型也有于人们进一步理解HBV流行病学与人口迁移；也将对慢性乙型肝炎患者的治疗与管理个体化产生积极的作用。