肝脏常见几种酶组织化学变化

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 肝脏常见几种酶组织化学变化

2006年7月20日  来源：健康前沿

 （一）琥珀酸脱氢酶（SDH，EC1.3.99.1，四氮唑盐法显示）

 
    属于琥珀酸氧化酶系统的酶，存在于所有有氧呼吸的细胞，定位于线粒体内膜嵴，与线粒体膜结合牢固，主要以离子键与线粒体内膜结合，而疏水键则起辅助作用，它是脱氢酶中最重要的

、惟一不需要辅酶的酶。 )肝脏SDH的活性很强，它的活性能反映肝内三羧酸循环的情况，是三羧酸循环中的限速酶，也是肝脏线粒体的标志酶。SDH的底物为琥珀酸钠，最适宜的pH为7.6，对固定剂很敏感，显示此酶一般用新鲜的冰冻切片（恒冷箱切片或半导体冰冻切片），大鼠的肝脏只能耐受冷甲醛固定5-15min，戊二醛可完全抑制此酶的活性；国内有报道，经固定可显示肝脏的SDH，但其效果不如新鲜冰冻切片。一般用四氮唑盐（如硝基四氮唑蓝，Nitro-BT等）作受氢体，SDH的活性赴呈现蓝色细小的甲簪颗粒。在肝小叶内带状分布明显，周边区活性最强，中央区最弱，中间区的SDH活性介于两者之间。肝脏的SDH活性定位于肝细胞质内，核呈阴性，在细胞的自行分解过程中酶的反应较稳定。近年肝脏实验医学研究证明，肝组织中酶的活性减弱，有的消失，但也可见局部酶活性增强，因病灶而异。药物中毒引起肝细胞损害时，如四氯化碳引起的肝细胞受损，此酶活性明显下降。急性传染性肝炎（急性期肝穿组织）此酶的活性降低，其降低程度与病变严重程度成正相关。慢性肝炎则SDH活性显著增强。脂肪肝SDH的活性下降。

    （二）乳酸脱氢酶（LDH，EC1.1.1.27）

    LDH和其他许多酶一样，它为同工酶的混合，LDH分子由四个亚基组

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成，每一同工酶是H.M二个亚基不同的组合，它的5个同工酶即H4、H3M1、H2M2、H1M3、M4。它属于广泛分布的可溶性酶，为糖酵解的酶系（无氧代谢），催化乳酸和丙酮酸互变反应，四氮唑盐接受还原型辅酶1的氢而被还原为深色不溶解的甲簪沉淀（紫蓝色）；底物为乳酸钠，最适宜的pH为7.4。此酶不能固定，用新鲜冰冻切片，LDH极为分散。肝脏受损或肝脏疾病LDH的活性显著增强，肝癌组织因糖酵解增强，故LDH活性增强很快，且和肝癌的恶性程度呈正相关变化。因此微量肝穿刺活检可以作为早期诊断方法。

    （三）三磷酸腺苷酶（ATPase，EC3.6.1.4）

    根据酶的定位可分为三种，即肌球蛋白（ATPaseEC3.6.1.3）又称钙激活ATPase，膜ATPase主要是指Na+-K+ATPase；此外还有线粒体ATPase（EC3.6.1.4），又称镁激活AT-Pase（Mg-ATPase）。肝脏的ATPase属于这一类，定位于线粒体内膜嵴。大量研究表明，线粒体ATPase是一个很复杂的复合体，它是偶联磷酸化的关键装置，分子量为448000。镁离子对它有激活作用，最适宜的pH为7.2，在肝脏主要显示于毛细胆管，呈棕黄色树枝状，靠近门静脉分支的肝细胞ATPase活性最强，肝窦及中央静脉部分也呈阳性反应。药物引起的肝脏损害（如四氯化碳、酒精中毒等），此酶活性显著下降。胆道淤积性黄疸（肝外胆道阻塞）ATPase活性也明显下降。中药当归及“超短波”对急性肝损害的ATPase活性有明显的恢复作用。

    （四）葡萄糖6-磷酸酶（G-6-Pase，EC3.1.3.9）

    它定位于肝细胞光面内质网，分解糖原为葡萄糖，是维持血糖的重要

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 酶，也称为内质网的标志酶。底物为葡萄糖-6-磷酸二钠盐，最适宜pH为6.8。在肝细胞内为棕色颗粒，胞质内分布于核周区最多，肝小叶内带状分布明显，小叶周边区活性最强，中央区活性较弱，中间带的G-6-Pase活性介于两者之间；但有时也可见肝小叶内呈均匀分布。肝糖原贮积病此酶活性下降，说明糖原分解不旺盛。糖尿病时G-6-Pase活性显著升高，说明糖原分解旺盛。药物造成肝细胞损害时G-6-Pase活性下降。此外当归和超短波对改善肝脏的G-6-Pase活性有明显的作用。

    （五）5’核苷酸酶（5’Nase，EC3.1.3.5）

    5’核苷酸酶常与膜结合，是膜的标志酶，在肝脏的毛细胆管和肝细胞膜上显示十分清楚。它催化核糖核苷和去氧核糖核苷，在C-5位置水解磷酸酯。中性5’-核苷酸酶最适宜的pH为7.5，镁和锰离子可以激活此酶活性。肝脏急性损害时（如D-氨基半乳糖所致肝损伤动物模型），5’Nase的活性明显消失，当归可恢复肝细胞膜的5’-Nase活性。因此检测肝细胞的5’-Nase活性，可观察急性肝损害的程度，配合ALT试验以预测肝功能的恢复程度。一般取微量肝穿组织即可得到理想的结果。

    （六）单胺氧化酶（MAO，EC1.4.3.4）

    一般用四氮唑盐还原法显示，它属黄素蛋白酶类，底物为盐酸色胺，不同的底物氧化速度不同，肾上腺素、5-羟色胺被MAO氧化最快。MAO能使有毒胺氧化脱氨，并破坏体内各种具有生物学活性的有害的肾上腺素和5-羟色胺等，在调节细胞代谢中起重要作用。此酶在匀浆的线粒体部分，与线粒体结合紧密而不溶，定位较好；一般认为MAO定位于线粒体外膜，它与细胞色素C还原酶、辅酶Ⅰ（NAD）常一起存在，它们主要是在线粒

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体外膜与呼吸链之间来回穿梭。在氧化磷酸化之间供给一个交替的连锁物。正常肝细胞质内MAO活性最强，用N-BT法显示呈蓝色甲簪颗粒。在肝小叶内带状分布明显，周边区的活性强，而中央区的活性较弱。它与单胺类神经递质的关系密切，与胆碱酯酶的活性有相互关系，如肝脏MAO的活性增强时，胆碱酯酶的活性则减弱；肝脏实验研究发现，在肝脏纤维化过程中，MAO参与胶原成熟最后阶段的“架桥”，此时血清MAO活性升高，酶的组织化学也可同时显示，故MAO可以用来诊断肝脏纤维化，既使血清MAO活性不升高，MAO酶组织化学仍能显示为强阳性；因此MAO活性的升高反映了肝内活动性炎症过程中的纤维化变化。此外在转移性肝癌时MAO活性也升高，脂肪肝只有在十分严重时MAO活性才升高。

    （七）胆碱酯酶（ChE，EC3.1.1.8）

    一般可分为乙酰胆碱酯酶（AchE）和胆碱酯酶（ChE），后者为假性胆碱酯酶。酶组织化学方法用Karnovsky-Root-亚铁氰化铜直接显示，底物为碘化硫代乙酰胆碱，它属于非特异性酯酶。大部分酯酶和块粒结合，特别是微粒体部分，酶主要和脂滴、光面内质网的泡有关。鼠类肝脏ChE活性很强，呈棕褐色，在胞浆内显示清楚，核呈阴性反应。肝细胞ChE活性的变化与肝脏蛋白质合成功能及储备功能的好坏呈正相关。肝脏疾病血清ChE活性与酶组织化学ChE活性变化是同步的，胆碱酯酶活性降低程度与血清白蛋白值的下降相平行。ChE是肝脏制造的，分子量比白蛋白大而半衰期比较短，因此肝细胞功能障碍时，血清ChE下降较早，ChE酶组织化学变化在肝细胞内的显示可以较长；因而ChE是一种敏感的反映肝合成障碍的指标。ChE活性下降反映肝细胞功能明显降低；它是诊断严重肝实质病变的可靠指标。脂肪肝ChE活性升高，肝硬化时则ChE活性低下；肝硬化合并肝癌ChE活性也降低，全身营养不良、恶液质、有机磷农药中毒 时，ChE活性明显下降。

    （八）碱性磷酸酶（ALP，EC3.1.3.1）

    ALP是酶组织化学中常研究的酶，来自肝、肠、骨骼、中性粒细胞、平滑肌，经胆道系统排泄，在肝脏定位于肝脏内皮、血管内皮（如中央静脉、门静脉各级分支）。碱性磷酸酶主要集中于α2、β和α1球蛋白内，在碱性范围内催化各种醇和酚的磷酸酯水解。在匀浆中主要位于微粒体和上清液部分，底物为β甘油磷酸钠，最适宜的pH为8-9，铅离子对它有激活作用。当肝功能异常时肝窦可以出现异常的吸收和分泌增高，ALP活性明显增高。ALP有六种同工酶，其中ALP1、ALP2和ALP6均来自肝脏，当胆汁淤积时ALP1活性增加；肝炎、肝硬化和肝癌时ALP2活性增加；ALP5在肝硬化病例中有40%出现阳性，因此有人分析ALP5可能来自纤维母细胞。药物中毒引起肝脏损害早期ALP活性增强，晚期ALP活性明显下降。慢性肝炎、脂肪肝和嗜酒者ALP活性可轻度升高。一般认为，ALP与LDH的活性异常增高对于肝炎的病例要注意是否合并肝癌。综上所述ALP对于诊断和鉴别诊断肝胆疾病有一定的意义。

    （九）酸性磷酸酶（ACP，EC3.1.3.2）

    ACP广泛分布于动物的组织内，它定位于溶酶体内，属于一种高浓度的水解酶。底物为P-甘油磷酸钠，最适宜的pH为4.5-5.9。肝细胞内ACP活性为弱阳性。Bancroft改良法显示在肝细胞质呈黄色细小颗粒，核为阴性。肝脏ACP活性比较稳定，当不良因素影响到溶酶体外面的脂蛋白膜，该膜的通透性遭到破坏，酶就逸出而ACP活性增加，在细胞内与各自的底物进行消化活动。例如肝细胞因各种因素受损，ACP活性处则呈大小不等

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的棕黄色颗粒，肝细胞受损的程度与ACP活性增高，几乎呈平行关系。肝小叶内ACP在门静脉分支范围活性显著增强，Kupffer细胞也呈阳性反应。药物引起的肝损害、酒精中毒引起的肝炎、胆汁淤积性黄疸，肝脏ACP活性明显增高。当归对保护肝脏溶酶体膜的通透性有良好的作用，它可以使ACP活性恢复正常。ACP活性的强弱对反映肝脏功能的变化和肝细胞受损程度有较大的意义，可以和ALT的生化学检查起相互印证作用。

    （十）一氧化氮合酶（NOS）

    与肝脏NOS在不同的组织中所含的亚基种类不同。一般可分为原生型（cNOS）和诱导型（iNOS），其中cNOS又分为神经元型（nNOS）和内皮型（eNOS）。cDNA克隆的结果表明，nNOS与eNOS是结构酶，其活性具有Ca2+的依赖性；而iNOS是诱导酶，它的活性不受Ca2+的调节，但需要脂多糖和细胞因子的诱导。此三种酶的C末端均有NADPH，FAD，FMO和钙调蛋白的结合位点，其N末端均含有cAMP依赖性的磷酸化激酶的结合位点，表明NOS由多种因子调节。

    1989年Billiar等首先报道肝细胞也可利用L-精氨酸生成NO，以后人们对肝脏生成NO及作用进行了广泛的研究。发现肝脏的所有细胞在NOS的催化下均能生成NO。由于还原型辅酶Ⅱ-黄递酶（NADPH-d）与NOS在化学结构、组织定位有极高的相等性，且与NO的生成也密切相关，故人们广泛采用NADPH-d的方法来显示NOS的活性。

    从我们的实验显示在肝细胞质内，肝窦内皮细胞的NOS均为蓝色的阳性反应，肝功能受损时NOS活性明显增强。有人用免疫电镜的方法证明NOS主要定位于线粒体内膜及嵴上。以上内容提示在肝脏的NOS有内皮型（eNOS）和诱导型（iNOS）等。此外，门脉高压时NOS的活性也可增加，在门脉高压症的家兔胃壁血管及肌间神经丛呈阳性反应。这种反应提示来自胃肠的内毒素未经肝脏解毒，经侧支循环直接进入体循环，刺激NOS的合成增加。它可能既有神经元型（nNOS），也有诱导型（iNOS）等。

    关于肝内生成NOS的意义，目前尚未明确，综合有关资料，有以下的可能性：NO具有调节肝脏血流，导致血液重分布，参与肝脏损害与保护作用。其中主要是通过抑制肝细胞线粒体功能，抑制核酸酶的活性，抑制蛋白质合成；抑制糖代谢和参与损害及抗氧化损害等过程，从而调节肝脏的功能活动。

    综上所述十种肝脏常用的酶组织化学变化，可以说明肝脏酶组织化学检查完全可以用于临床诊断，特别是广泛应用于肝脏实验医学研究。其他几种酶，如细胞色素氧化酶、葡葡糖-6-磷酸脱氢酶、异柠檬酸脱氢酶、酒精脱氢酶，核苷酸合成酶系和形成多聚核苷酸酶均逐步应用于肝脏医学的研究，说明肝脏酶组织化学的应用在我国方兴未艾，有待大力推广和加强基础与临床的协作研究，以期在为肝脏病学的诊断和治疗中发挥更大的作用。