第二军医大学长征医院 缪晓辉 今天的传染病科（感染病科）或肝病科医生比若干年以前轻松了许多，这源自可供治疗慢性乙型肝炎的干扰素的发现和核苷（酸）类似物在临床上的广泛使用。当然，得益的更是为数众多的广大慢性乙型肝炎感染者，尤其是在中国，HBV慢性感染及其相关严重肝病的相对和绝对人数均为全球之首，严重危害国人的健康和生命。抗病毒药物在部分患者中使用并获得疗效，在改善 HBV 感染者生活质量、延长寿命的同时，也由于HBV携带群体明显下降，使得垂直传播和水平传播机会减少，另外，全国性新生儿及儿童预防性乙肝疫苗免费接种，我国近年来HBV感染率已经明显降低。然而，完全攻克慢性乙型肝炎的时间表还无法制订，打破制约抗病毒效果的瓶颈还有待时日。本文分别阐述慢性乙型肝炎治疗的重要进展和限制因素。 一、慢性乙型肝炎抗病毒治疗方面的重大进展 （一）干扰素的发现 1957年Issacs和Lindenmann报告了他们的重要研究结果：细胞用灭活的流感病毒处理之后，不再被其他病毒感染，他们从这种细胞培养上清液中提纯出一种蛋白质，加入未经病毒刺激的细胞后同样出现了保护细胞免受病毒攻击的现象。他们把这种现象称为干扰（interference），把发挥干扰作用的蛋白质称为干扰素（interferon）。干扰素不直接灭活病毒，也不需要免疫细胞参与，它直接激活靶细胞使细胞建立一种保护状态（有数种所谓“抗病毒蛋白质”发挥作用）。后来发现它的生物活性还有抗细胞增殖、抗肿瘤、免疫调节等，但是，干扰素的抗病毒活性仍然最受人们关注，包括沿用至今的干扰素的生物活性测定法，即“细胞病变抑制试验”，就是一种体外干扰素抗病毒活性检测技术，这种试验是基于假设待测标本中含有干扰素，那么检测细胞与待测标本共孵育之后细胞建立了抗病毒状态，随后的病毒攻击不再致细胞“病变”，标本中干扰素的浓度通过半数细胞得到保护时的稀释倍数来定量。 随着对干扰素研究的不断深入，科学家们试图把干扰素作为新型抗病毒和抗肿瘤药物进行开发。早期从人脐带血、淋巴母细胞中提取的天然干扰素在临床使用过程中，对毛细胞白血病、肾癌和慢性乙型肝炎的确发挥了一定的治疗作用。但是，天然干扰素制备十分困难，产量很低，价格昂贵，不能满足临床之需。但它毕竟还是给医务工作者带来了一线希望。 （二）基因工程、修饰干扰素的发明与应用 又一次革命性的变化出现在20世纪70年代末80年代初，当时基因克隆、基因重组和蛋白质纯化技术已经成熟。Taniguchi在1979年首先获得了β－干扰素的cDNA，并在大肠埃希菌成功表达具有活性的β－干扰素蛋白。1980，Nagata等报告从人白细胞中成功克隆出人α－干扰素基因，并得到相应的基因工程α－干扰素产物。从此以后，重组干扰素的批量生产和临床普遍应用成为可能，继美国FDA批准基因工程α－干扰素用于治疗慢性乙型肝炎之后，我国自制的重组干扰素也很快问世。大量的临床研究和应用表明，干扰素对HBV感染具有确切的治疗作用，尽管其近期疗效（完全应答）在40％左右，长期完全应答效果不超过30％。干扰素除了具有直接抗乙肝病毒作用外，尚有直接防治肝纤维化和减少肝硬化患者肝癌发生率的作用。但是干扰素的副作用也比较明显，比如流感样症状、白细胞和血小板下降、可能会加重肝损害，尤其是胆红素升高等，限制了它的使用适应证和患者的依从性。 为了减少干扰素的副作用、进一步提高抗病毒效果，临床医生和药物研发人员都作出了很大的努力。比如，围绕提高临床疗效的问题，尝试过加大使用剂量、联合用药、序贯用药等等措施，这些措施不同程度上取得了一定的效果，但是在远期疗效方面没有发生根本性的改变。药物研发人员试图在改变干扰素剂型方面进行尝试，最初有人研发脂质体包裹的干扰素，以期延缓吸收时间，提高血药浓度，后来发现脂质体本身不稳定，以及“包裹”效率有限，所以脂质体干扰素并没有发挥预期的效果。 聚乙二醇化干扰素（PEGylated interferon）的研制成功成为慢性乙型肝炎治疗史上的一次重要突破。聚乙二醇在橡胶、纺织、金属制造、化妆品等制造领域的应用已经有近百年的历史。这样一个中性、水溶性和无毒的化学物质很快得到制药业的重视。第一个聚乙二醇化蛋白质制品—聚乙二醇化裂解酶于1977年问世后，聚乙二醇即被用于修饰多种蛋白质。聚乙二醇化干扰素在20世纪末首先被用于治疗慢性丙型肝炎，与利巴韦林合用，对HCV2、3 基因型感染的持久疗效接近70％，这也是一个突破性的数据，在中国的上市时间是2003年，直到2005年2月欧盟委员会才批准了瑞士罗氏公司研发的聚乙二醇化干扰素（商品名为“派罗欣”）用于慢性乙型肝炎的治疗，我国在此之前也进行了3期临床试验。聚乙二醇干扰素有如下特点，第一，半寿期长，可以在血液内达到血药稳态浓度，形成对病毒的持久抑制作用，所以又称其为“长效干扰素”；第二，只需一周给药一次，减少痛苦，方便用药，提高了患者的依从性；第三，与普通α－干扰素相比，毒副反应没有增加；第四，聚乙二醇干扰素治疗慢性乙型肝炎的持久应答效果比普通α－干扰素提高了 10 ％左右；第五，临床研究还证明它对普通α－干扰素治疗无效的患者可以获得疗效。就干扰素而言，聚乙二醇干扰素的研发成功和临床应用，也是一个重要的里程碑。 （三）新一代核苷（酸）类似物的研制与应用 自1965年Blumberge发现澳大利亚抗原以及随后的一系列研究证实HBV是“血清型肝炎”的致病因子以来，各国学者一直在寻找有效的抗HBV的化学药物。历史上曾经被尝试过的有阿糖腺苷、膦甲酸钠、泛昔洛韦、庚昔洛韦等等，但是无一令人满意。1987年，加拿大魁北克生化制药公司启动了一项旨在研发抗HIV感染药物的项目，首先筛选了两种能够抑制病毒逆转录酶的双脱氧核苷类似药－ddC和AZT，并与当年4月被批准用于AIDS治疗。1989年Bernard Belleau和NgheNguyen-Ba从一系列化合物中发现了拉米夫定（2'-3'-dideoxy-3'-thiacytidiine,3TC），它是一种很强的逆转录酶抑制剂，因而成为抗HIV的另一个可选择的药物，自1995年美国FDA批准上市后，作为鸡尾酒疗法的药物之一，在AIDS治疗方面发挥了很重要的作用。后来的研究证实，它还可以抑制HBV多聚酶（对人细胞多聚酶也有轻度抑制作用），而且抑制HBV复制的有效药物浓度远远低于抑制HIV之所需，因此转而成为抗HBV研究的重点药物。1998年美国FDA批准将拉米夫定（贺普丁，葛兰素史克公司购买了专利权）治疗慢性乙型肝炎纳入新的适应证，很快（1999 年）就占据了中国医疗市场，成为继干扰素之后的第一个全新的抗乙肝病毒药物。该药的主要特点是抑制HBV复制的能力强、完全应答率比较高、为口服药物，患者的依从性好、副作用较少和较轻等。但是该药被认为可以诱发HBV YMDD变异，产生临床耐药，以及停药后有可能加重病情，迄今无法确定疗程等缺陷，更重要的是，比拉米夫定更具优越性的新的核苷类似物已经上市，使得该药的临床应用收到一定影响。尽管如此，拉米夫定在慢性乙型肝炎抗病毒治疗史上的确留下了辉煌的一页，它未来何去何从还有待观察。 继拉米夫定之后，国外多个公司致力于研究高效、副作用小，尤其是避免或减少耐药发生率的核苷类抗乙肝病毒药物。同样由葛兰素史克公司生产的阿德福韦（贺维力）于2002年得到美国FDA批准用于治疗慢性乙肝，2005年下半年在中国上市。该药除了与拉米夫定一样有依从性好、抗病毒效果确实等特点外，它的另一个特点是对拉米夫定耐药的患者有效，故可以作为既往使用拉米夫定后发生临床耐药的替代药物，也可以用于初治患者。但是该药抑制病毒复制的作用比拉米夫定弱，用药后发生病毒学应答的速度慢，另外，长期使用可能有潜在的肾毒性。 2005年3月29日美国FDA批准由百时施贵宝公司研发的恩替卡韦（博路定）用于治疗慢性乙型肝炎，同年11月也在中国上市。恩替卡韦一经上市即引起不小的轰动，原因有二：对HBV的抑制作用很强，优于现已上市的所有核苷（酸）类似物，初治患者使用恩替卡韦后的完全应答率优于拉米夫定；对拉米夫定耐药的病例使用一年后仅1％、二年后仅9％发生耐药，而且无需与拉米夫定重叠用药。另外，目前尚未发现明显和严重的毒副反应。中国的临床医师也已经积累了一定的用药经验，唯该药价格较高，不能适应国人的经济承受能力。 总之，新型核苷（酸）类似药改变了全球抗乙型肝炎病毒慢性感染的治疗状态，扩大了慢性乙型肝炎患者的受益群体，提高了他们的生活质量，减少了相关慢性严重肝病的发病率，其贡献是有目共睹的。 （四）全球抗病毒治疗规范化 国际上有几个著名的肝病学术组织，其中有三个学会，即美国肝病学会（American Association for the Study on Liver Diseases, AASLD）、欧洲肝病学会（European Association for the Study of the Liver, EASL）、亚太肝病学会（Asian Pacific Association for the Study of the Liver，APASL）在各种肝病，包括慢性乙型肝炎规范性治疗方面发挥了十分重要的作用，这些学术团体或组织不仅定期召开学术研讨会，更重要的是发挥国际著名组织机构或专家的作用，制订肝病的防治指南或共识等。我国在肝病领域有两个著名的学会，即中华医学会肝病学分会和中华医学会感染病学分会，这两个学会分别在2004年和2005年制定了两个重要的《指南》：《丙型肝炎防治指南》和《慢性乙型肝炎防治指南》。国际和国内的各种共识与指南，对于指导和规范慢性乙型肝炎的防治起到了很大的推动作用。比如在我国，一项由中国肝炎基金会所做的调查显示，仅有不到20％的专业医生认为抗病毒是慢性乙型肝炎治疗的关键措施。这种认识上的误区的消除必须通过广大专业人员认真学习《指南》，同时更需要医学会专家的指导，因此我国肝病学会和感染病学会在指南制定后不久就制订了在全国各大省会城市开展《指南》的解读活动的计划，目的是使基层医务人员消除慢性乙型肝炎防治中的一些模糊甚至错误的认识。国际国内学术组织积极介入临床医生诊治慢性乙肝的行为是一种进步，对医患双方均具有积极的意义，这也是近年来的一大突破。 （五）人工肝和肝脏移植术救治急性肝衰竭 肝衰竭是各种肝病的最严重的表现形式。我国由于慢性乙型肝炎发病率居于首位，因此而发生的急慢性肝衰竭也排列在第一位。肝衰竭的病死率很高，急性者高达90％，慢性者不低于50％。医学界对肝衰竭的救治十分重视，也取得了很大的进步。很多地区在20世纪80年代就成立了攻关组，通过去除导致肝衰竭的因素、免除肝脏再受打击、积极治疗在肝病基础上的各种并发症、合理使用多种维护内环境稳定和对残留肝细胞具有一定保护作用或者具有一定促进肝细胞生长的药物等措施，肝衰竭的救治成功率有了明显提高。但是疗效远不尽如人意。 1956年Sorrentino证明了新鲜肝组织匀浆能代谢酮体、巴比妥和氨，首次提出了“人工肝脏”的概念。人工肝脏是借助体外机械、化学或生物性装置，暂时或部分替代肝脏功能，从而协助治疗肝脏功能不全或相关疾病。目前，人工肝脏已经成为医疗体系中重要的器官支持疗法。但是，早期人们对人工肝寄寓了过高的期望，以为它能够达到类似于人工肾的治疗效果。实践证明，人工肝只是一种临时治疗措施，它通过一个体外的机械或理化装置，担负起暂时辅助或部分代替严重病变肝脏的功能，清除部分有害物质，代偿肝脏的部分代谢功能，直至自体肝脏功能恢复或进行肝脏移植。问题在于与肾脏相比肝脏的功能强大且复杂，肝衰竭的病理生理过程又十分复杂，机械性人工肝肯定不能替代肝功能，临床应用结果也表明它不能提高生存率。生物人工肝还处于研制阶段，而且目前看来前景不太乐观。但又不可否认，人工肝可以在短时间内缓解病情，为“后续”治疗奠定基础。 所谓“后续治疗”即肝脏移植术。第一例人肝脏移植术是在1963年3月由美国的Starzl实施，我国的第一例是在1977年完成。早期的肝脏移植受体主要选择了那些预后极差的晚期肝病，预后不良。以后的临床研究注重了受体患者的肝病及其全身状况，一定程度上提高了存活率，但排异和移植后HBV再感染的问题没有解决，直到环孢素及拉米夫定的问世，以及肝移植术本身的技术水平提高，肝移植术的发展加快。1983年美国国家卫生研究机构正式承认肝移植是终末期肝病的一种治疗方法。进入21世纪以后，肝脏移植术趋于成熟。截止目前我院肝脏移植术已经累计超过500例，在全国位居前列。值得一提的是，我院较早为慢性乙型肝炎基础上发生的肝衰竭患者行肝移植术，目前手术成功率超过90％，1年以上存活率超过80％。在病例选择上我院偏重内科保守治疗无效的患者，这无疑很大地提高了肝衰竭的综合治愈水平。 二、抗病毒治疗方面存在的问题和解决策略 （一）旨在提高抗乙肝临床疗效的措施没有实质性的突破 无论是抗病毒药物的更新换代，还是各种旨在提高临床疗效的措施的改进，抗乙肝病毒治疗经历了三十余年的努力，虽然已经取得了很大的进步，但是总的来说，抗病毒疗效还是不能令医患双方面满意。 在我国，HBV感染率高达60％，但是慢性感染者的比例在10％左右，一部分感染者表现为急性经过，或者是隐性感染。那么什么因素决定了感染HBV后的转归？机体的免疫状态可能是决定性的因素之一，而免疫状态更多的是由宿主遗传背景决定的，这种现象已经在多种感染性疾病中被观察到。同理，对抗乙肝病毒药物的应答率的高低，涉及的因素也应该包括宿主和病毒两个方面。今后需要做更多的努力，尤其要大力开展病毒与机体相互作用关系的研究，因为，我们无法解释为什么疗效是“部分的”，与有应答者相比，那些无应答者机体内究竟有何缺陷和如何克服这种缺陷正是我们今后要努力探索的奥秘，只有解决了这些深层次的问题，才有可能获得重大突破，才能在抗乙肝病毒治疗方面更为理性和科学。 （二）病毒变异导致的临床耐药 就抗细菌感染而言，我们已经习惯了接受这样一个事实：一般来说对某一个体，抗菌药物治疗只有“有效”和“无效”两者之一的结果，对于由于发生细菌耐药而产生的“无效”结果，我们还可以有许多可选择的抗生素，从而向“有效”的方向转化。遗憾的是，在HBV治疗上，我们不仅面临了抗病毒药物本身疗效的有限性，还面临了比抗生素耐药更为棘手的问题：临床医生可选择的空间太小！自从拉米夫定在临床上广泛应用以来，科研人员和医务人员对于病毒耐药的认识都在不断加深，对于“基因耐药”、“表型耐药”和“临床耐药”这些原本十分生疏的名词，基本上有了正确的认识。部分慢性HBV感染者，体内病毒YMDD变异导致拉米夫定不再有效，甚至使病情恶化是当前抗病毒治疗过程中最受关注的问题之一；HBV基因前C区变异，使得e抗原表达缺失，各种抗病毒药物的疗效均劣于e抗原阳性患者，包括干扰素治疗效果不佳等同样令人困惑；新的抗病毒核苷类似药使用后还会很快遇到耐药的问题，更使人沮丧。 HBV虽然是一种DNA病毒，但是它变异速度惊人，一方面由于它在复制过程中有逆转录过程，另外，这个种属的病毒结构很特别：闭环的、由三千余碱基对组成的基因组竟然有四个开放读码框架，而且不同的基因序列被不同的读框重复利用。且不谈HBV亚型的问题，最近国内外学者提出了HBV准种的概念，即同一感染者体内可能存在许多SNP的病毒株，这使得病毒变异与抗病毒疗效之间的关系变得更为复杂。目前对乙型肝炎病毒本身的许多问题的认识还远远不够，今后必须加强基础研究，只有进一步弄清病毒的本质，包括病毒的起源等问题，才有可能在研发高效抗病毒药物上有所作为。 （三）缺乏清除HBV cccDNA的手段 当前没有任何抗病毒药物能够进入细胞核清除核内的HBV cccDNA，核内cccDNA 既是HBV复制的模板，也是病毒基因储存池，是当前抗病毒药物治疗后有效者复发的根源，可见其重要性。当前学术界对HBV cccDNA的研究是一个热点，遗憾的是目前还没有解决最基础的问题：即建立敏感、特异和相对便捷的检测技术。笔者及同事们一直致力于cccDNA检测技术的建立，查阅国外大量文献资料之后发现各个学者报告的 cccDNA 检测技术在方法学上差异很大，敏感度、特异性和精确度也高低不等。利用各自建立的检测技术测定肝组织、外周血、外周血单个核细胞等，无论是载量还是阴阳性结果都有很多分歧。然而，不少作者利用尚不成熟的检测技术进行抗病毒药物疗效研究，却得出有关抗病毒药物“彻底清除细胞内cccDNA”的结论。笔者所在的研究小组，把现有的各种检测手段进行筛选和组合，建立了重复性好、敏感度较高、特异性比较强的cccDNA定量检测技术。多次重复试验结果表明，血清HBV DNA（松弛环状DNA， rcDNA）阳性者，肝细胞中含有cccDNA，而外周血单个核细胞（PBMCs）中不能检出cccDNA。说明抗病毒治疗的关键还是在于清除肝细胞中的cccDNA。文献报告的所谓肝细胞内cccDNA被清除的现象，除了技术方法的可靠性有待验证外，即使是“清除”，可能还是强大的抗病毒药物抑制了胞浆内病毒的复制，使核内cccDNA消耗到不可测水平，而非真正意义上的清除。今后研发新药，应当把消除cccDNA作为突破口，抗病毒应答的标准必须包括 cccDNA的彻底清除，否则就难以判定病毒是否完全被清除，从而也就难以判断停药后是否复发。 （四）肝移植术后的HBV再感染难以避免 如前所述，我国肝移植术已经走向成熟，对慢性乙型肝炎病毒感染相关严重肝病实施肝移植术治疗已经取得了巨大成功，然而，这类患者术后面临的最重要的问题却不是器官排异，而是乙型肝炎的复发。当前预防复发的手段包括手术前使用核苷类似药，术后在继续使用抗病毒药物的同时，使用大剂量HBIG。但尽管如此，仍然不能保证HBV不再感染。需要提出的问题是：既然HBV是一种嗜肝病毒，作为HBV储存体的肝脏被切除后，感染移植肝（新肝）的HBV源自什么器官或组织？我们的研究发现一个有趣的现象：慢乙肝肝移植患者术后血清中检测不到HBV rcDNA，但在PBMCs却呈阳性。进一步研究发现PBMCs中并不能检出cccDNA，说明PBMCs不能支持HBV复制，进而也不可能作为肝移植术后HBV cccDNA储存池，但却有可能是HBV的携带工具。只有澄清肝移植术后HBV复制池的来源，才能在预防肝移植术后复发方面有所突破，需要在这方面进行深入研究。 三、展望 近年来慢性乙型肝炎抗病毒治疗取得了令人瞩目的成就，作为公认的抗乙肝病毒治疗有效的药物－干扰素类和核苷（酸）类似物发挥了很大的作用。如果继续围绕这两类药物开展各种研究工作，仍有可能达到进一步提高临床疗效的目的，但是预计不会取得重大和突破性的进展。今后应该把乙肝病毒、乙肝病毒感染者和抗病毒药物三者联系起来，加强基础和临床相结合的科学研究，更需要加强从事不同专业的研究人员之间的学术交流，通过优势互补、相互协作、相互促进，有望不断提高慢性乙型肝炎病毒感染及其相关肝病的治疗效果，并有可能寻求到一个或几个突破口，最终征服慢性乙型肝炎。 | 
发表于 2006-6-6 02:31
