乙肝病毒编码x蛋白与肝细胞癌的关系研究现状与展望
在我国，慢性乙肝病毒感染者有1亿多人，感染率接近人口总数的1/10,其中发病者1500万左右，少数病人经慢性反复迁延不愈逐步发展至肝硬化和肝细胞癌，其中乙肝病毒相关肝细胞癌的发生率较正常未感染人群明显升高，其机制尚不清楚，但一致认为HBV感染是本病发生的最重要的危险因素之一。大多数HBV相关的HCC均有HBVDNA的整合，而整合物中最常包括的是HBX基因区【I . 2]。目前，研究的热点主要集中在乙肝病毒基因组x区编码的具有反式激活作用的多功能调节蛋白上，HBV编码的HBVx蛋白与HCC的发生关系密切:HBX蛋白能够调节HBV复制，反式激活多种细胞与病毒基国，体内外的不少实验表明HBX对于人类HCC的发生具有重要促进作用〔'1x蛋白是乙肝病毒(HBV) DAN中最小的一个开放读码区，编码基因位于1374-1383核昔酸酸之间，其编码的x蛋白由154氨基酸组成。1989年，shirakala等[A]首先报道通过X基因片段表达载体转染小鼠成纤维细胞系NIH3T3，诱发其体外转化，经裸鼠移植可在裸鼠体内形成肿瘤。1994年koike等[5J将X基因导入CD-1鼠系的胚胎细胞中，诱发84%的雄鼠肝脏肿瘤并有X蛋白的高度表达。目前研究发现，x蛋白在体内和体外均可使肝细胞分裂周期失控，最终导致肝细胞癌的发生[6]，而表达x蛋白的转基因小鼠肝细胞经过18个月的观察亦可看到肝细胞的癌性增生〔71. X蛋白诱导肝细胞癌的发生可能通过一下机制。
1.原癌基因的激活
HBV能异常调控原癌基因，影响细胞周期，引起肿瘤促进细胞周期靠正向调节的原癌基因表达产物，即周期蛋白(cyclins)和周期蛋白的依赖性激酶(CDKs) o正常情况下，,cyclinD与CDK4/6结合，活化的CDK使控制细胞周期G1末期R点的RB蛋白(PRB)磷酸化而失活，从中释放活化的转录因子E2F·它能使cyclinE和CDK2及cyclinA和CDK2相结合，促细胞增殖(GI/S). cyclinA和CDK2的复合物同时也使。yclinB和CDKI结合，促进细胞分裂(G2/M)。原癌基因突变，使细胞周期失调，已被认为是引起肿瘤的先决条件。Masaki等[81在用LEC鼠研究HCC中周期蛋白及其激酶活性时，通过Westembolt和in-gel激酶分析，发现cyclinA. DI, E.Cdk4的蛋白水平和激酶的活活性同肝细胞癌(hepatocellularcarcinoma,HCC)的发展呈等比&vi的增加。在人类HCC中，Ohashi等〔，〕用Westemblot对33个经外科手术的HCC样本进行分析，发现78.8%的cyclinA和54.5%的cyclinE有过强表达。Luo等[fiol对40例HCC的癌及癌旁组织用免疫组化方法分析，发现40.0%的CDK4有异常表达。it。等〔u7在对104例HCC和99例对照的研究中，单变量分析发现cyclinD 1过度表达的P=0.0041,cyclinE过度表达的P=0.0572, Ozturk"z，认为病毒基因产物(如HBV的X蛋白)可使cyclinD和cyclinA过度表达。Bouchard等【I8]显示:HBX可活化cyclinA的启动子，诱导cyclinA和CDK2的复合物，通过Src酪氨酸激酶所参与的活化旁路，促进生长停止细胞进行G1期的循环，使生长停止的细胞对GO和G1细胞周期关卡失调。研究表明，x蛋白可与p53蛋白一起调节ras基因，使ras基因激活〔tat, ras基因编码蛋白质瞬1,户1具有高度的保守性，有类似G蛋白的作用，当它接受信号刺激时与GTP结合，形成具有GTP酶活性的p21-GTP复合物，这种复合物有传导细胞内信号的作用，并能与一些有生长作用的蛋白质相互作用，从而维持了对生长基因的放状态，导致细胞增殖失控，最终导致肝细胞癌的发生。HBV对其它原癌基因的作用机制，还有待做进一步的研究。
2.抑癌基因的失活
p53基因为一种抑癌基因，其编码的蛋白p53蛋白是一种转录因子，存在于细胞核中，以四聚体的形式与特异的】ANA序列结合，对靶基因的表达进行调控，当细胞DNA损伤时，p53对其细胞周期进行负调控，抑制G，晚期的基因转录，以保证基因的稳定表达和细胞分裂的忠实进行。p53缺失或表达突变型P53，则其丧失对细胞周期的控制作用["),HBV编码蛋白HBXAg可结合P53蛋白，1993年，Feitelson等[1e1首先应用免疫共沉淀的方法发现HBX抗原与p53蛋白能够相互结合，认为二者结合可能导致p53的抑癌功能不能正常发挥，促进原发性肝癌的发生。之后不少学者也相继报道了HBXAg与p53的结合作用。Elmore等[17]进一步观察了HBXAg与p53之间的物理性作用及其作用结果、体外用全长HBX及不同的HBX缺失变异翻译蛋白与GST p53进行结合试验，发现ayw, adr亚型HBV的HBX的C末端(111-154位氨基酸)是p53的结合部位，对于p53的胞浆定位以及取消p53介导的凋亡是必需的Lin等[181也定位了p53蛋白与HBXAg二者的相互作用点，
发现HBX蛋白包含一个反式活化功能Cx (51 - 148aa)与一个功能调节区(155aa)，用p53探针结合不同基因段的表达蛋白表明，p53结合点定位于HBX的反式活化区内部，而非调节区。进一步进行基因缺失研究认为，p53结合区位于HBX-000H末端102-136aa区域;p53蛋白分为3个功能区:NH2端、中间区、0000H端分别为反式活化区、DNA结合区、寡聚化区，HBX探针不能结合p53的反式活化区编码氨基酸，而能够结合另外两段功能区编码氨基酸，这表明p53具有两个独立的HBX结合点，分别定位于p53蛋白特异性DNA结合区及寡聚化区。p53与HBX蛋白的相互结合，能使p53的核定位改变为胞浆定位，导致p53蛋白胞浆滞留，这可能是HBV相关性肝癌中p53不能正常发挥作用的原因之一[19]。研究表明，从肝癌病人提取的乙肝病毒全基因序列在体外复制活性很高，由于这种高水平复制活性可激活机体的免疫机制而导致肝细胞发生变性坏死，处于Go期的肝细胞进入G1期进行修复，在这一过程中由于病毒X基因区编码的X蛋白的合成增加，且部分X基因发生终止密码子的突变，这种变异的X蛋白可使P53基因表达活性减低，P53蛋白合成减少，最终导致肝癌的发生[201。亦有研究表明，慢性乙肝病毒组与肝细胞染色体整合之后，其X区变异比较常见[21][22]这些突变体X基因的表达产物在体内外都显示有抑制P53基因的表达的作用，阻断了P53介导的细胞凋亡，因而亦有促使肿瘤发生的作用[23]。研究表明，X蛋白的表达可使肝细胞对黄曲霉素BI活性代谢产物诱导的细胞毒性作用的敏感性增加，在经常暴露于该致癌物质的人群中，P53突变的发生率高达50%以上，该突变体表达无活性P53蛋白，使其原本有的控制细胞周期的作用丧失，且又暴露于致癌物质，二者共同作用，使肝细胞分裂增殖失控〔z"', P53基因具有多种功能[25.26]:监督细胞基因组稳定性、调节DNA损伤反应、促进细胞老等 53蛋白通过结合特异性DNA序列及其他细胞因子，可以导致细胞G1期阻滞，调节DNA损伤，诱导细胞凋亡。变异、缺失以及与病毒或细胞蛋白结合导致的p53活性的破坏可能是HCC发生的一种重要机制。P16基因是另一种抑癌基因，p16基因位于染色体9p2.1上，全长8.5kb，包含2个内含子和3个外显子(exon),编码近I &D，含148个氨基酸的蛋白，是1994年从肿瘤病毒转化细胞中作为细胞周期素依赖性蛋白激酶CDK4的相关蛋白而被鉴定的。p16蛋白参与对正常细胞周期的调控，能特异性地抑制细胞周期蛋白D(cyclinD) CDk4复合物的活性;p16基因与Rb(编码分子量为105xl03- 110X103的核磷蛋白pRb),p53等抑癌基因有密切关系，被称为多瘤抑制基因(mutiple tumorsuppressor MTS-1)，其改变广泛而高频率地存在于头颈部肿瘤、肺癌、乳腺癌、膀肮癌等多种人的肿瘤细胞中，p16对细胞周期调控是通过p16/cyc LidN/pRb途径得以实现的:cyclinDl被认为是一个癌基因，其作用是与CDK4结合并使之激活，从而催化p Rb磷酸化，使细胞从G1期进入S期。而p16蛋白可特异性地直接与CDK4亚单位结合，竞争性抑制了。yclinD 1与之结合，则CDK4不能被激活，,pRb不被CDK4磷酸化，细胞被阻滞于G1/S期[27,28[。可见p16是CDK4特异性的抑制子(inhibitor)，故p16又被称为p 161NK4。如果p16功能丧失，细胞就可能异常增殖而
恶变。因此，,p16蛋白的缺失对HCC的进展有促进作用「29]而在乙肝病毒感染病人中，这种缺失又比较常见。
3.影响转化生长因子一01
转化生长因子一01 (TGF-01)分子量为25KD，来源于未定植的小鼠胚胎或晚期胚胎，也广泛分布于成熟的体细胞或培养的细胞中。通常以复合物的形式分泌至细胞外。TGF- H 1的作用教复杂，它对调节细胞的增殖和分化过程有促进和抑制的双重作用，一般认为它对间皮起源的细胞具有生长刺激作用，而对上皮起源的细胞是一种潜在的生长抑制因子，而它的抑制作用，如抑制干细胞的过速分化，使它维持一定的比数，对细胞的发育和细胞的继续分化和增殖有一定的意义[30]。在慢性肝炎、肝硬化和肝癌病人的肝组织中高频度的检测到TGF-13 1和HBX蛋白的同时存在说明TGF- 0 1与肝脏疾病的发病机制有关，而x蛋白的表达也可能与TGF- R 1有关。Y00等检测了表达x基因的转基因小鼠其肝脏的TGF- 5 1的表达，发现这些小鼠中的两者的表达类型相似。X蛋白能激活转染的肝细胞瘤细胞内TGF- D 1基因的转录。由x蛋白调控的TGF- 0 1基因内，其顺式激活元件就是转录子Egr家族的结合位点。进一步研究发现Egr-1蛋白与x蛋白相关，允许x蛋白参与im-mediate-early基因的转录和调控。X蛋白可能通过转录子Egr蛋白诱导HBV感染早期的TGF- P 1的表达[311。Oshikawa观察了转染和未转染x基因的不同细胞对加入TGF- 0 1后产生的不同生长抑制作用。将PRc/CMV细胞内的x基因转染入MVILU细胞并获得了稳定的传代。3H胸腺啼咤脱氧核昔掺入实验表明，加入TGF- 0 1后亲代MVILU细胞和PRc/CMV细胞的掺入抑制率分别为34%和26%，而x基因转染的MVILU的抑制率仅为3%-8%o X基因转染的细胞表面TGF-13 111型受体的量仅是亲代MVl1.U细胞或PRc/CMV细胞的一半。这一结果提示x基因的表达可能通过减少受感染细胞表面的TGF- 0 111受体而减低了对TGF- 0 1生长抑制的反应[321
4.影响细胞凋亡
HBV能异常调控凋亡，引起肿瘤凋亡(apoptosis)，即细胞程序性死亡(PCD)，是一种自身保护，自身稳定的机制。目前所知的同凋亡有关的物质，即所谓死亡区域信号蛋白，有Fas, FasL, FADD( Fas-associated death domain protein), RIP(receptornteracting protein),FLICE(FADD-like leukin-lbeta-converting enzyme), FAP (Fasassociatedphosphatase), TRADD(TNF receptor-associated death domain protein),TRAAL(tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand),FAF(Fas associatedprotein factor)核糖体蛋白L32, PR3(孕激素受体)等等。凋亡主要通过癌基因和抑癌基因调控Fas和FasL的表达，使它们结合，把凋亡信号传递给衔接子FADD和RIP,从而刺激FLICE的死亡蛋白酶和其它凋亡的蛋白酶，引起细胞凋亡。而FAP能抑制Fas的信号;TRADD能通过过度表达诱导细胞死亡和NF-kappaB的活化[331,TRAIL仅在被改变的细胞系中，能选择性诱导凋亡[341。目前认为凋亡受抑是引起肿瘤的一个重要机制，有时甚至更胜于细胞增殖的失控。肝细胞的加速增殖通过凋亡达到相互的平衡。凋亡可维持肝脏的稳态。凋亡程度的下降在转基因鼠肝脏中，被发现是先于肿瘤出现[35]。Shin等[36」在对10个HBV相关的HCC细胞和6个HBV相关的HCC组织检测Fas相关的基因的mRNA转录时，发现在大部分HBV相关的HCC的细胞和所有的HCC的组织中，有显著的Fas[3'7]表达的下降，FAP表达上调和FADD[3S]或FLICE的表达下调。凋亡是受癌基因和抑癌基因调控的。一些研究显示:cyclin表达与细胞凋亡有关。同时还发现:野生型P53基因导入对细胞凋亡有诱导和促进作用。它通过调控Fas表达，启动凋亡程序;还通过它的过量表达导致CDKI过早激活，使核膜破坏，引起细胞凋亡，而失活或突变
的P53的凋亡功能丧失，会使细胞增殖成肿瘤细胞[39 ]a IB 蛋白有体内抗凋亡的作用。现发现[40 ]:RB 蛋白的高磷酸化可能启动突然的细胞周期进程，导致不可逆的细胞死亡。可见细胞周期蛋白与Fas系统存在着密切的联系。病毒也可直接或通过原癌和抑癌基因间接的影响凋亡。现己发现f[4) ]]HBx可通过上调MRP(cellularmultidrugresistantproteins)的过度表达，来部分阻止细胞的Fas所介导的凋亡，引起HCC。还发现[42 ]HBx在肝肿瘤细胞中诱导FasL表达，通过对表达Fas的T细胞诱导凋亡来逃避免疫监督。Huo认为[43]HBx能结合并阻止P53介导的凋亡。因为整合了HBx的突变的P53不能介导凋亡，却给肿瘤前期或肝肿瘤细胞提供可选择的克隆，造成肝细胞性的致癌作用。有研究表明，乙肝病毒X区编码的乙肝病毒X蛋白可抑制Fas介导的细胞
凋亡，促进细胞存活，实验证明抗Fas抗体导致的人肝细胞和小鼠胚胎纤维母系细胞死亡可被乙肝病毒X蛋白所阻断[44]，这种现象同样可在缺乏P53的小鼠红白细胞观察到，说明X蛋白能够抑制Fas介导的细胞凋亡，最终导致瘤细胞增殖失控。X蛋白亦可影响细胞线粒体膜上诱使细胞凋亡的配基，使其抗原水平减低，其减低或缺乏可使肝细胞对Fas诱导的细胞凋亡发生抵抗，进而可能导致肿瘤细胞增殖失控[4$1。有报道称乙肝病毒X蛋白与肝细胞癌的发生相关，部分是通过刺激肝细胞增殖和使感染肝细胞逃避宿主不断增强的免疫应答来实现，主要是X蛋白激活核因子Kappa B使肝细胞对抗Fas杀伤作用的能力增强、影响细胞凋亡而发挥作用「46][47]
5，与宿主基因整合导致宿主基因不稳
乙型肝炎病毒(HBV)，属嗜肝DNA病毒科，其3.2kb的部分双链环状DNA,分别编码病毒核心蛋白(C),3个表面抗原多肤(S包括:前S1，前S2和S)，多聚酶(P)和病毒转录活化因子(X)。它在肝细胞内以游离和整合两种形式存在。研究己发现，在PHC中有91.5%的HBV以整合形式存在。可见整合形式与细胞癌变密切相关。在整合的部位上，病毒主要在X's，前S和C基因区，整合率分别
为87.5%,62.5%,62.5%和25.0%[4s L宿主主要在抗癌基因(如P53)上游100个by左右。外，,Buen-dia等[491发现病毒基因产物也可使细胞癌变庄要有X蛋白和Mst蛋白(中间s转录活化因子)。故病毒基因整合和基因产物均可引起宿主基因突变或重排，使表达失常[50 1，即原癌基因活化和抑癌基因失活，从而影响细胞增殖和凋亡的平衡，引起肿瘤的发生。研究表明，乙肝病毒X基因与宿主基因整合比较常见[51]，其转染肝细胞有染色体的改变和核微粒体形成[5z]，这一现象说明在表达乙肝病毒X基因的细胞中其染色体的完整性受到影响，在X基因转染肝细胞中发生的新的细胞基因的改变说明乙肝病毒X基因千扰维护正常肝细胞基因完整性的细胞内机制，如其与编码的X蛋白可与受损的DNA结合，影响其修复[s;增加了在感染细胞发生获得性基因突变，诱发肝细胞癌的发生。
总而言之，乙肝病毒感染与肝癌的发生高度相关，是肝细胞癌发生的重要危险因素，其具体机制到目前尚不清楚，近年来研究热点主要集中在其病毒基因组X区编码的蛋白质即X蛋白上，己对其做了大量的研究，如对癌基因、抑癌基因、细胞凋亡、宿主基因的影响，表明乙肝病毒X基因区编码的X蛋白可能是一种多功能调节蛋白，通过影响肝细胞增殖、细胞凋亡、细胞增殖节点调控、细胞分化以及受感染细胞对致癌物致突变因素的敏感性而发挥其诱导细胞恶变的作用。但是任何肿瘤的发生，除了与致瘤因素有关外，还与机体的抑瘤因素有关，二者力量对比的失衡最终导致了肿瘤的发生。也就是说当机体免疫功能正常时，那么就可以发挥正常的免疫监视作用，而在乙肝病毒感染病人，特别是慢性感染时，常存在免疫功能的紊乱，特别是细胞免疫功能低下，是否与乙肝病毒基因组X基因表达产物X蛋白有关报道较少，还有待进一步研究。
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发表于 2005-6-27 23:47
