乙型肝炎病毒YMDD变异与乙型肝炎的治疗

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复旦大学附属华山医院 张继明

我国是乙型肝炎高流行区，现有乙型肝炎患者约为2800万人，慢性无症状乙型肝炎病毒 (HBV) 携带者约有1.2亿人。长期以来，慢性乙型肝炎的治疗一直是一个难题，主要原因为缺乏有效的抗HBV药物。拉米夫定 (lamivudine) 是目前公认的治疗乙型肝炎的三种有效药物之一，可在短期内使HBV DNA水平下降，肝功能恢复正常，肝纤维化程度得到改善。自1999年拉米夫定在中国上市以来，已有50万以上的慢性乙型肝炎患者接受了拉米夫定治疗，取得了较好的疗效。拉米夫定治疗慢性乙型肝炎的主要缺陷之一是耐药性的产生，而HBV对拉米夫定的耐药主要是由HBV的YMDD基序及附近的氨基酸变异引起的。近年来，许多学者对HBV YMDD变异株的复制特性、耐药性等进行了研究，本文就有关HBV YMDD变异的研究进展作一概述。 1 拉米夫定相关性HBV变异位点的命名

拉米夫定相关性HBV变异多位于HBV聚合酶的RT区。过去，HBV聚合酶氨基酸序列的位置命名是从P基因的起始密码子开始计数的。由于不同基因型HBV P基因编码的聚合酶氨基酸链长度不一致，导致聚合酶氨基酸位置的命名一直较为混乱，如A基因型HBV P基因编码的聚合酶由845个氨基酸组成，而B和C基因型含843个氨基酸，D基因型含842个氨基酸。这样就导致了同一个氨基酸在不同基因型中的命名位置不一致，不利于相互交流，如YMDD基序中的M，在A基因型中位于552位，而在B和C基因型中为550位，在D基因型为539位，在E和G基因型为549位。为了消除这种基因型之间的差异，有学者重新对HBV RT区氨基酸的位置进行了命名。由于不同HBV毒株P基因的TP (末端蛋白) 和间隔区在不同基因型中长度不一致，而所有HBV毒株的RT区长度均为344个氨基酸，并起始于一个保守序列EDWGPCDEHG。基于这一特点，对HBV聚合酶 RT区进行单独命名已成为可能 (表1)。

2 HBV对拉米夫定的耐药率及其机制

拉米夫定治疗慢性乙型肝炎的主要缺陷之一是HBV对其易产生耐药性，且随着治疗时间的延长，耐药率明显增加。亚洲的临床研究数据显示，拉米夫定治疗1～4年的耐药率分别为14%、38%、49%和66%。在临床上，YMDD变异常伴有HBV DNA和谷丙转氨酶(ALT) 水平的反跳，40.6%的患者出现病情急性加重，少数患者因并发重症肝炎而死亡，拉米夫定相关变异株引起病情急性加重的机制尚不清楚。 目前认为，HBV对核苷类似物耐药性的产生与HBV P基因变异有关，并且HBV P基因变异是多位点的，以C区YMDD基序的变异最为重要。HBV对拉米夫定耐药性的产生也是HBV RT区YMDD基序变异所致。使用新的命名法，拉米夫定相关的HBV耐药株的变异位置和类型为rtM204V/I (C区)± rtL180M(B区)。最近，还发现一种新的变异类型，即YSDD变异或rtM204S变异 (以往报道的基本是YVDD或YIDD变异)，这种变异株是从1例接受拉米夫定治疗18个月的患者的血清中发现的，体外转染研究也证实了这种YSDD变异株对拉米夫定耐药。拉米夫定相关性HBV耐药的基因型分类见表2。 HBV YMDD基序变异引起对拉米夫定耐药的机制如下：YMDD变异可引起HBV聚合酶空间结构的改变，进而引起与核苷类似物之间的作用发生改变，与三磷酸脱氧核苷(dNTP) 或核苷类似物的结合力下降。根据HBV野生毒株和YMDD变异株聚合酶的酶学分析和模拟的HBV聚合酶晶体结构特点，发现YMDD是HBV聚合酶的催化位点，当M变为I或V时可导致氨基酸侧链的柔性减低，并在HBV聚合酶和拉米夫定三磷酸盐之间形成空间位阻，导致与拉米夫定三磷酸盐的结合力下降。

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3 YMDD变异株生物学特性的研究

以往的研究表明，和野生株相比，YMDD变异株的复制能力显著降低。据报道，在体外YMDD变异株对拉米夫定的敏感性比野生株降低10000倍。研究提示，体外YMDD变异株不能像野生型HBV那样有效复制，复制能力明显下降。临床上也发现，发生YMDD变异者在停用拉米夫定之后，患者体内的变异株常常很快被野生株所取代，提示YMDD变异株存在复制缺陷。

近年来，随着对YMDD变异株研究的进一步深入，发现并不是所有YMDD变异株都存在复制缺陷，HBV YMDD变异株的复制能力并不都是减弱的。Bock等最近发现，YMDD变异伴“a”决定簇内变异时，患者可出现病情恶化。体外研究显示，这种联合变异可使病毒的复制能力明显增强。Ono等的研究也提示，HBV聚合酶rtL180M(B区)变异可补偿HBV YMDD变异株的复制缺陷，使HBV的复制增强。其他学者的研究也证实，YMDD基序之外的变异可补偿YMDD变异株的复制缺陷(表3)，研究显示，如果YMDD变异株合并YMDD基序之外的一些位点变异，可使YMDD变异株的复制能力显著增强。

来自临床研究的证据也支持这一观点，即某些YMDD变异株可能具有较强的复制能力。例如，Thibault等报道，临床上已发现YMDD变异株引起的急性HBV感染。Lok等对YMDD变异株的消长状态进行了监测，结果发现，在停用拉米夫定之后，患者体内的YMDD变异株可存在数月之久。因此，YMDD变异株借助YMDD基序之外变异，补偿HBV的复制缺陷，可以解释临床上有些患者出现变异后HBV DNA水平并未明显降低，甚至高于治疗前水平的原因。这也可能是某些YMDD变异者病情加重的原因之一。

以往对YMDD变异的研究在方法上可能存在以下不足：⑴在检测变异时多数仅检测一段序列，对于拉米夫定治疗后对整个HBV序列的影响了解不多；⑵即使研究了HBV全基因序列的变异情况，但得到的HBV全基因序列多数是通过拼接而成的，并不能完全代表人体内HBV序列；⑶在研究YMDD基序和YMDD基序之外变异对病毒复制能力的影响时，主要采用人工体外诱变的方法，所用的HBV毒株多数来自同一个人工构建的含1.2 拷贝或以上的HBV全基因质粒，并不能完全反映在拉米夫定的选择性压力下，人体内自然出现的变异株的生物学特性。今后有必要直接从患者体内扩增、克隆HBV全基因，在HBV基因组水平上研究拉米夫定治疗前和变异后HBV的复制特性。

由于HBV 聚合酶基因的阅读框架和S基因完全重叠，尤其是HBV RT区的7个具有催化功能的基序 (G,F,A,B,C,D和E)完全与HBV表面抗原 (HBsAg) 的主要中和功能域(neutralization domain)，即“a”决定簇重叠，故HBV聚合酶RT区变异可同时引起S基因变异，例如约有20%的拉米夫定耐药株 (rtV173L/ rtL180M/ rtM204V) 的包膜蛋白可同时发生sE164D/ sI195M变异 (表4)。最近，国外已有研究发现，拉米夫定相关HBV变异株HBsAg与抗HBs的结合力明显降低，尤其是伴“a”决定簇内变异时，HBsAg与抗HBs的结合力的降低更明显，如sE164D/ sI195M变异株的抗原-抗体结合的半数有效浓度(IC50) 与HBsAg经典的免疫逃避株sG145R(rtW153Q)相似。当HBsAg与抗HBs的结合力明显降低时，可成为免疫逃避变异株，导致乙肝疫苗接种失败。由于我国每年有大量乙型肝炎患者服用拉米夫定，是否会产生HBsAg“a”决定簇内变异，以及这种变异株是否会发生免疫逃避，是一个急需阐明的问题。

4 YMDD变异株对其他核苷类抗病毒药物的敏感性

阿德福韦酯 (adefovir dipivoxil) 是一种新的核苷类抗HBV药物，已被FDA批准用于慢性乙型肝炎的治疗。除此之外，还有多种核苷类药物处在II～ III期临床研究阶段，如恩替卡韦 (entecavir)、汰比呋定 (telbivudine)、克来夫定(clevudine)、恩曲他滨 (emtricitabine)、替诺福韦酯 (tenofovir DE)和amdoxovir等。阿德福韦酯、恩替卡韦、amdoxovir和替诺福韦酯对拉米夫定耐药株有较强的抑制作用，阿德福韦酯已在临床上用于治疗拉米夫定耐药株引起的感染。克来夫定和恩曲他滨对拉米夫定耐药株的作用较差。汰比呋定和拉米夫定也有交叉耐药性，可能不适合用于拉米夫定耐药株引起的感染。

5 结论

总之，在使用拉米夫定治疗慢性乙型肝炎的过程中，YMDD变异是较为常见的。笔者认为，任何核苷类抗病毒药物在应用过程中都可能出现变异和耐药，如Angus等已从1例接受阿德福韦酯治疗96周、具有临床和病毒学耐药证据的患者血清中分离到1株HBV耐药株，序列分析发现HBV RT的D区出现rtN236T变异。经体外转染试验证实，含rtN236T变异的HBV毒株对阿德福韦酯的敏感性显著下降。因此，目前迫切需要开发新的抗病毒药物，来解决拉米夫定耐药阻碍乙型肝炎治疗的问题。就目前来看，由于拉米夫定无明显的毒副反应，且价格相对便宜，在相当长的一段时间内，仍将是抗乙型肝炎病毒治疗的一线药物。

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乙肝杀手

谢谢楼主，多多参加学术版建设。