乙型肝炎病毒基因型研究进展
本文系转贴,版权为原作者所有 乙型肝炎病毒基因型研究进展 研究发现HBV基因型的类别与HBV传播方式、临床疾病谱、预后判断及抗病毒治疗的选择都有一定的相关性,因此近年来乙肝病毒(HBV)基因型的研究已逐渐成为国内外HBV研究的热点。本文就乙肝病毒基因型研究的历史和现状作一简要综述。
一、HBV基因型的发现与发展
1988年Okamoto[l)等通过对18株不同亚型的HBV DNA全序列比较后发现,亚型的区分并不能真正反映HBV基因组的差异。从基因型角度看,不同血清型间仅是S基因区2个位点上的差异。他们认为,若核昔酸序列异质性>8%,则为不同的基因型,而同一基因型的HBV核昔酸序列的差异<5.6%。因此,将18株HBV分为4种基因型:A^-D型。1992年Norder<Z)发现ayw4和adw4q两种
亚型的S基因彼此之间的差异为6.69/6-7.7%,与A-D 4种基因型的差异在4.0%-8.0%范围内,应归为两种新的基因型,即E型和F型。1994年Norder等[3)对2株ayw4和2株adw4q亚型进行了全序列测定,证明这确实是两种新的基因型,E型和F型与其余4种基因型的差异分别为8.1%-13.6%和12.8%一15.5%。由此将HBV分为A^-F 6种基因型。
2000年Yuasa[4)等研究越南暴发性乙肝的基因突变,发现5位患者的HBVDNA整体分型为C,但其X区却为B型的现象.同年Hannoun等[5]分析了5例越南的HBV全基因序列(亚型均为adw),发现其中3株在系统树图中呈现位干A, B, C三型之间单独的一枝,可能是一种新的基因型。与此同时Stuyvar等[6J在研究法国和美国患者的血清时,发现了HBV第7种基因型G,基因型G与AF六型最小差异为11.7% (与E型),最大差异为15.3% (与F型),基因型G归为adw2亚型。
2002年瑞典的Arauz-Ruizi7l发现3例来自尼加拉瓜和美国洛杉矶的HBV株其小S基因与F基因型HBV有3.1-4.1%的差异。通过全基因序列分析,这3例HBV株之间差异为0.8^2.5%,与F基因型HBV差异为7.2-10.2%,与其它基因型的HBV差异为13.2^'15.7%。经过对82例HBV全基因序列进行两两比较,发现基因型内外的差异分别为0.1-7.4%和6.8^'17.1%,因此这3例HBV株应该属于一种新的基因型,即H基因型。 二、HBV基因型的分型方法
随着基因型概念的提出,测序成为主要鉴定基因型的方法。全序列测定,基因型间的界限是核昔酸序列的差异}8 %。由于S基因序列的变化和全序列的变化一致,因此根据S基因序列即可进行分型,其界限是核昔酸序列的差异)4.2%。但不论是利用全基因序列,还是利用S基因序列进行基因分型,均不可避免面临大量序列测定的实际困难。研究发现,不同亚型有不同的限制性片段长度多态性(RFLP),故RFLP技术可用于基因分型的研究。现RFLP方法己被广泛应用于HBV的基因分型。
1997年Lindh等181基于扩增S基因的RFLP分析,创立了新的分型方法。但用此方法,仍有一部分血情标本出现非典型限制型和不能分型。由于S基因中前S区异质性高,而S区相对保守,因此前S区能代表S基因的变化,提示前S基因宜于基因分型。1998年Lindh等191又建立了一种以RFLP为基础的HBV基因分型方法,由PCR方法扩增HBV的前S基因,扩增产物分别用两种限制性内切酶平行酶切,根据不同基因型的酶切多态性可分辨6种基因型。其在51例基因库序列及99例HBeAg(+)患者血清中只有两例不能分型,因而此方法是一种有效、简便的分型方法,适用于流行病学调查研究。1999年Masashi等1101对68个
HBV基因库序列进行了全序列及S区的系统树图和RFLP分析,通过5种不同的内切酶分别酶切扩增的S基因,可区分A-F6种基因型。1999年Usudalul设计了以ELISA进行基因分型的方法,采用针对前S2区基因型特异性表位的单克隆抗体。并对514份来自11个不同国家的HBsAg(+)血清进行了分型(缺乏E型),其中27例未能分型的被证明是不同基因型的混合感染或本方法所涉及的特异性表位发生了点突变。2001〕年Usuda等[121又研究了基因型E,证明该方法能成功区分A- F基因型.2001年Swenson[13]发明了一种线性探针杂交分型方法,他先将血清样品进行PCR扩增,然后用型特异性探针与PCR产物杂交,可区分AF
基因型。2001年Naito[14[研制出了一种简便快速的毕式PCR分型方法,他采用型特异性引物,对样品分两次进行PCR扩增,然后通过琼脂糖电泳根据片段大小直接观察分型结果,可很好地区分A-F基因型。国内也有不少学者在HBV基因分型方法上进行了创新和探索,如朱冰等[15]运用4种限制性内切酶对扩增的S基因片段进行RFLP分析,建立了新的基因分型方法,能很好地鉴别B, C两型。2001年南方医院阎丽[161等建立了一种新的乙型肝炎病毒S基因PCR-RFLP基因型分型方法。结果两种PCR-RFLP及s基因测序鉴定HBV基因型结果一致,表明该S基因PCR-RFLP方法不仅灵敏性高,特异性强,酶切图谱简明单一易于识别,而且准确性也高,适宜于HBV基因型的流行病学调查。
三、HBV基因型的地理分布情况
HBV的基因型有明确的地域性分布特征:A型主要在西、北欧及北美洲和非洲中部流行;B型则主要发现干中国、印度尼西亚及越南,它是变异最多的一种基因型;C型则主要流行于东亚,如中国、韩国、日本、玻里尼西亚和越南、泰国;D型在全世界都有发现,但主要在地中海地区和中东地区流行,并延伸到印度;E型至今则只在非洲有报道;F型发现在美国及玻里尼西亚、委内瑞拉等地。G型见于美国、法国等地;H型发现于尼加拉瓜和美国洛衫矶等地。此外中美洲也有A, C, D型的发现。而在南非主要流行株为A和D型。
在我国,北方以C型为主,南方以B型为主,D型仅见于少数民族地区,如西藏、新疆。A型偶见报道,而E和F型暂未发现.王永忠1171采用巢式聚合酶链反应扩增产物直接测序法对常州地区地区146份不同HBV感染者血清HBV DNA进行了基因分型,结果B型51份(34.90 , C型95份(65.1%),未发现B, C以外其他基因型。苏冬娜1181等采用ELISA法对深圳114例HBV DNA阳性患者进行基因分型,结果发现B型21例(18.4%), C型72例(63.1%), D型6例(5.3%), BC型9例(7.9%), CD型4例(3.5 ),无法分型者2例(1.8%)。王虹1191采用PCR微板核酸杂交ELISA技术对广州、惠州、珠江等地152例不同临床表现乙肝患者的HBV进行基因分型,结果发现HBV基因型大多集中在B,C,D这3型,其所占比例分别为B型28.29%, C型37.50 %, D型18.42%;A型、E型、F型所占比例很少,各只有3.29%。还存在一定比例的混合基因型,B, C, D三型不同组合的混合型共占10.53%。杨洁1201采用多重PCR法对114例广州周边地区HBV携带者的分型,结果显示主要为B型和C型,分别占45.00%和38.75%,另外还有16.25%的D型。姚刚[211采用PCR- RFLP法对52例HBeAg阳性的新疆维吾尔族HBV慢性无症状携带者的HBV进行基因型测定,结果发现D基因型57.7%, C基因型30.8%, B基因型11.5%,无A. E基因型。 四、HBV基因型与临床关系
2003年,日本长崎国立医学中心的Lin[22]通过分析19例急性乙肝患者的基因型,发现其中18例为C型,仅1例为B型,故认为日本长崎地区急性乙肝患者的HBV基因型主要为C型。2002年,王永忠[p8]等人用巢式PCR加测序法检测了常州地区146例不同乙肝患者的HBV基因型,结果只发现B型(34.9%)和C型(65.1%), B, C两型的ALT, HBV DNA和HBeAg阳性率均无显著性差异,肝硬化和肝癌患者的C型比例(24/28)明显高于慢性乙肝患者(61/104)(P<0.01),接受拉米吠咤治疗48周后,C型的反跳率(14/45)显著低于B型(18/23) (P<0.001),因此认为C基因型与肝硬化和肝癌关系密切,拉米吠吮对C基因型患者的疗效强于B型.2003年,香港中文大学的Chan[23]追踪146例HBeAg阳性的慢性乙肝病人32士12个月,结果发现转化为肝细胞癌的6例病人全为C型,慢性病人中C型的病情要重于B型,但HBeAg转阴后则没有差别。
2003年,台湾的Lee[24]用PCR-RFLP法检测了台南地区265例慢性乙肝患者的HBV基因型,结果A型1%, B型60%, C型34%, D型2.5%,无法分型者2.5%,C型的HBeAg阳性率和肝纤维化程度均高于B型,肝细胞癌患者中B, C两型的平均年龄无显著性差异,但50岁以下肝癌患者的C型比例(40%)显著高于同年龄段的无症状携带者(10%) (P<0.001)。经多因素分析发现,由慢性乙肝发展成肝硬化或肝癌的高危因素为老年、男性和C基因型,故认为和B基因型相比,C型与更严重的肝病有关。2003年,香港圣玛丽医院的Yuen[25l用线形探针杂交法检测了288例携带者和55例肝硬化患者的HBV基因型,结果主要为B型(28%)和C型(60%), B型的HBeAg转阴时间比C型早9年(P=0.011), B,C两型的ALT, TBIL, HBV DNA等水平和急性恶化累积风险指标(ALT>- 1.5倍正常值)均无显著性差异,感染后6年内的HBeAg转阴率B型高于C型(P=0.053),但之后则没有差别。B, C两型在肝硬化、肝癌患者和非肝硬化、肝癌患者中的比例基本相同。作者认为,虽然B型患者的HBeAg转阴时间早,但这并不意味着其病情恶化的风险就明显减小。2002年,刘映霞[26l等人用PCR-RFLP法检测了185例湖南省慢性乙肝患者的HBV基因型,包括携带者42例,慢性轻、中度肝炎38例,重型肝炎80例(伴有肝硬化者49例),肝细胞癌25例,结果只发现B型(73.5%)和C型(26.5%), B型在重型肝炎和肝细胞癌中的比例(83.7%和76%)明显高于携带者巧7.1%) (P<0.01); C型在垂直传播感染者中的比例(38.8%)远高于B型(13.2%) (P<0.001), C型的HBeAg阳性
率(57.1%)明显高于B型(30.9%) (P<0.001),抗HBeAg阳性率(36.9%)明显低于B型(66.2%) (P<0.001), B型的ALT水平(264.51256.5)明显高于C型(100.0士120.6) (P<0.001)。因此作者认为,B型为湖南省HBV优势基因型并与肝脏疾病活动性相关,C型与母婴垂直传播感染有关。2003年,北大肝病研究所的许军1271等人检测了284例乙肝病人的HBV基因型,包括携带者87例,慢性肝炎157例,肝硬化22例,肝细胞癌18例,结果主要为B型(26.1%)和C型(63.2%),两种基因型在四种类型病人中的比例都有显著性差异(P<0.001). C型在慢性肝炎和肝癌患者中的比例(59.6%, 7.7%)明显高于B型(43.2%,1.4%)(均P <0.001),但在肝硬化患者中两种基因型的比例(7.7%和&1%)无显著性差异,于是作者认为,C基因型与B型相比,可导致更严重的肝脏炎症。2003年,印度的Gandhel'8}检测了印度西部不同临床表现乙肝病人的HBV基因型,包括携带者19例,慢性肝炎30例,急性肝炎8例,暴发性肝炎5例,结果绝大多数为D型(91.93%),所有携带者、急性和暴发性肝炎患者以及25例慢性患者均为D型和ayw3/ayw2亚型,剩下的5例慢性患者全为A型(8.07%)和adw2亚型,由于不同临床表现的病人大多数均感染D型HBV,所以他认为基因型并不影响HBV感染的结果。 2003年,日本千叶大学的Sumi[29j检测了258例慢性乙肝患者和74例肝细胞癌患者的HBV基因型,两种病人中B型的平均年龄都显著高于C型(P均<0.05),慢性患者中B型的HBeAg阴性率和HBeAg转阴率均高于C型(P <0.01, P =0.022);多因素分析显示,B基因型、前C区突变、高水平ALT和严重肝组织病变都是促进HBeAg转阴的独立因素;慢性病人中B型肝纤维化的比例(4/30)显著低于C型(74/224) (P=0.034),这种差异在45岁以下的患者中更趋明显(1/25和47/180) (P=0.020),而45岁以上则无差异。两种病人中的B, C型比例都大致相同,分别为11.2%a, 87.0%和10.8%, 89.2%。作者认为,虽然B型的HBeAg转阴时间早,发展成肝纤维化和肝癌的进程慢,但是从长远角度来说,两种基因型对病情的影响没有差别。
2002年,西班牙巴塞罗那大学的Sanchez-Tapias[301检测了258例西班牙慢性乙肝患者的HBV基因型,结果A型52%, D型35%, F型7%; A型的ALT, TBIL,HBV DNA等清除率高于D型(P二0.002)和F型(P二0.03); A型的HBsAg清除率高于D型(P=0.03), Cox回归分析显示,HBsAg的持久消退与A基因型有关; 基因型并不直接影响HBeAg向HBeAb的转化,但HBeAg转阴后A型的反跳率低于D型(P
0.03); F型的死亡率高于A型少= 0.02)和D型伊二0.002).2002年,美国密歇根大学的WaiP1]等人用回顾性分析法研究了HBV基因型和前C/C区变异在。一干扰素治疗HBeAg阳性病人中所起的作用。他们检测了107例病人的HBV基因型,其中73例已接受a一干扰素治疗(实验组),34例未接受任何治疗(对照组),结果主要为B型(38%)和C型(60%)。实验组中B型和C型的HBeAg转阴率分别为39%和17% (P=0.03),而对照组中分别为10%和8%(P=0.88);多因素分析显示,B基因型、治疗前ALT升高、治疗前HBV DNA低水平都是抗病毒治疗有效的独立因素,而。一干扰素治疗并不是独立因素。在66例治疗前ALT升高的患者中,实验组B型和C型的HBeAg转阴率分别为57%和21% (P=0.019),而对照组分别为25%和8 % (P=0.045)。多因素分析显示,B基因型和治疗前低HBVDNA水平可作为抗病毒治疗有效的预测指标。所以Wai认为,B型对a一干扰素治疗的疗效好于C型。2002年,日本九州大学的Furusyo1321采用ELISA法检测了日本福冈和冲绳岛158例慢性乙肝患者的HBV基因型,结果B型和C型的比例分别为36.7%和63.3%,其中冲绳岛以B型为主(86.9%),而福冈以C型为主(94.8%)。通过跟踪调查这些病人HBeAg和AD,水平的变化,发现观察初期C型的HBeAg阳性率(66.0%)和ALT异常率(84.0%)均显著高于B型(34.5%和22.4%)(P均<0.05), B型每年HBeAg自发转阴率(8.38%)远高于C型(2.34%)。在持续HBeAg阴性的病人中,C型的ALT异常率(58.8%)显著高于B型(19.2%) (P<0.05)。有趣的是,经干扰素治疗后HBeAg转阴的C型病例仍具有较高的ALT异常率(58.8%)。所有ALT异常的病人血清均HBV DNA阳性。这些结果提示,C型的HBeAg转阴所需时间较长,HBeAg转阴后病毒仍持续复制,所以C型可导致比B型更严重的肝脏损害。2002年,香港的Can [33]等人研究了HBV基因型与慢性乙肝感染黄疽性发作(IF)之间的关系。他用RFLP法检测了21例IF病人的HBV基因型,这些病人均ALT升高5倍以上,且总胆红素>501U/L或胆红素升高+PT时间延长3秒。同时将三种临床类型的病人设为对照组,包括31例无症状携带者(ALT
持续正常>2年)、49例活动性早期肝硬化(Child方案A期,HBV DNA>106Eq/ml), 31例失代偿期肝硬化(Child方案B或C期,伴有并发症)。实验组中91%为B基因型,与对照组三种类型皆有显著性差异(P<0.001),对照组则以C型为主,三种类型之间无显著性差异。
因此Chan认为,B基因型与香港慢性乙肝患者的黄疽性发作有关,而慢性肝病的不同阶段皆以C型为主,这可能与不同基因型HBV的致病机理不同有关。2002年,Kobayashi[301等人检测了日本东京Toranomon医院57例急性乙肝患者和1077例慢性乙肝患者的HBV基
因型,结果发现A, B, C, D, F五种基因型,有少量样品不能分型,急性、慢性的A型比例分别为22.8%和1.9% (P<0.00001), B型比例为14.0%和9.4%,C型比例为43.9%和87.7% (P=0.004), D型比例为1.8%和0.2%, F型比例为1.8%和0.2%a,无法分型的比例为15.8%和0.6%(P=0.001)。急性患者中有7例(12%)呈持续性感染,包括7例急性期接受泼尼松龙和甘草甜素治疗者中的6例(86%)和41名未接受泼尼松龙和甘草甜素治疗患者中的1例(2%) (P=0.01)。对这7例急性感染期延长的患者给予干扰素治疗后,有4例的HBeAg和HBsAg
转阴.在这4例治疗有效的患者中,1例是B基因型,其余3例是C基因型。治疗无效的3例患者中全为A基因型,它们均为HBsAg阳性,且其中1例为HBeAg阳性。因此作者认为,在日本急性乙肝患者中有较多A基因型,干扰素对急性期乙肝治疗效果显著,只有A基因型患者疗效差。
Bahn等1351在研究乙肝患儿从HBsAg到抗.HBS血清转换后HBV持续存在体内的情况时,意外发现在血清转换过程中有3例HBV基因型由A型(亚型为adw)转为D型(亚型为ayw) e Gemer等[361也在研究22例儿童自然或经干扰素治疗而发生HBeAg到抗-HBe的血情转换时,发现7例自然转换的患者HBV基因型由A型(亚型为adw)转为D型(亚型为ayw ),而干扰素治疗组无基因型的改变。Friedt等[371还发现9例暴发性肝炎的婴儿(3-4个月)中有8例的基因型为D型,而唯一幸存的婴儿发生了D^-A的基因型转换,提示基因型D与更严重的疾病过程有关。基因型改变将引起B细胞、T细胞表位的改变,可能会造成病毒免疫逃逸。基因型的改变提示在HBV感染中,还有许多未知的过程有待进一步研究。西欧的主要流行株为A. D型,Mayerat['1对西欧的急慢性乙肝病毒的基因型进行了分析。在35例慢性活动性乙肝患者中28例为A型,而D型只有4例;在30例例急性乙肝患者中24例为D型,仅3例为A型。泰国也有报道在东南亚的慢性乙肝中基因型C占主要地位。说明不同基因型有致病性差异。
Lindh等[391的研究显示,基因C型与B型相比,前者与高A18%突变率及第1762-1764位TGA高突变有关。另外,C型的携带者多为HBeAg阳性且前C区仍为野生型:HAI分值测定显示:C型者炎症分值高于B型者。此外,Lindh等[401还研究了瑞士1995.19%年24例急性乙肝患者,发现急性乙肝的基因型主要为D型。
这些发现也提示不同基因型HBV间存在致病性差异.KaO等[41}报道B,C型为台湾的主要流行株,其中50岁以上的肝硬化(Cir)和肝细胞癌(HCC)患者与同年龄组的无症状携带者(AsC)比较基因型C在前者中占主要地位;而50岁以下的HCC与AsC比较,B型在前者中占主要地位,而在35岁以下的HCC患者中差异更加显著(90%为B型)。结果提示基因型C与更严重的肝病有关,而B型似乎与台湾年轻人的肝癌有联系。1998年范金水等对我国8个城市HBSAg阳性和阴性乙肝患者的病毒亚型和基因型用测序法进行了分析。HBSAg阳性和阴性乙肝的HBV基因型均以C型为主,其次为D型、B型,未发现基因型E,F或新的基因型。总体上看,两类乙肝的HBV主要型别构成基本一致。朱冰等[i5]对广州地区肝硬化患者的调查结果显示,肝硬化患者的HBV DNA主要是B,C混合型,与AsC有差异。近年乙肝基因型与抗病毒药物疗效的研究,提示不同基因型间的药物敏感性也有差异。张欣欣等[421在对35例HBeAg(-)的乙肝患者进行干扰素治疗中发现,A型患者比其他基因型的患者对于扰素有更高的应答率,且不依赖先前ALT的水平和干扰素的剂量。2000年Ka。等[43]比较了B, C
型乙肝患者对干扰素a的应答反应,结论为年龄轻、B基因型感染者可能预示着对干扰素a有较好的应答。
五、HBV基因型与临床关系机理的研究
关于HBV基因型引起不同临床表现机理的研究目前较少,有少数报道认为可能与C区启动子nt1762的A-T和nt1764的G一双重突变以及前C区nt1896的G-A突变有关。前者突变可阻碍前C区mRNA的转运,减少HbeAg 3-4倍的产量,但是只与炎症和肝纤维化有关,而与HbeAg量无太大关系;后者突变可导致终止密码子的提前产生,使HbeAg合成完全受阻,与更轻微的炎症、HbeAg的转阴和病毒的低复制有关;同时还发现C型以前种突变为主,而B型以后种突变多见1- 1基因型A, F病毒株的nt 1858为C 能与nt1896的G形成稳定的茎拌结构,能阻止nt 1896 G^-A的终码突变(又称A1896突变)。B, C, D, E型的nt 1858位为T,不能和nt 1896位的G形成稳定的茎拌结构,易发生A1896突变。前C区nt 1858位点碱基C或T呈现HBV基因型依赖性,提示HBV A18%突变出现受不同基因型筛选。尤其是基因型D的患者在A1896突变的选择下,更易发生持续性肝炎。此外,2000年法国学者还发现A18%突变在D型中的发现率比A型高。
由于欧美主要基因型为A和F,团此抗HBe(+)的慢性乙肝较少,而我国、东南亚、地中海地区主要基因型为B, C, D型,因此抗HBe(+)的慢性乙肝较多。这就解释了A18%突变流行的地区性变化。但有研究发现,在17株F型的乙肝病毒株中有11株有A18%突变,而且都是T1858。从另外5株来自不同美洲国家的F型野生株也发现了T1858。因此C1858阻止A18%突变的能力则只限于基因型A的病毒株。Orito[471等通过对50例日本B. C型慢性乙肝患者的研究显示:B型患者比C型患者HBeAg阳性率低,而抗一HBe则阳性率高。启动子nt1762的止A-T和nt 1764的G-A联合点突变则明显与C型年龄)35岁、重症的肝病有关。此外近年来的研究还发现,疫苗的逃避变异的发生与E型关系密切。2002年6月,日本学者Sugauchit4ej测定了70例B型HBV的基因组全序列,根据前C区和C区与C型有无重组序列将B型HBV分为Ba和刊两种亚型。2003年6月他发现在1838位点处所有Ba亚型均为A碱基,而所有Bj亚型为G碱基,便利用这一点研制出了一种能快速简便区分两种亚型的PCR- RFLP法,并用此法检测了274例B型患者,结果在93例日本慢性乙肝患者中97%为Bj亚型,而在177例中国、泰国、越南患者中几乎100%都是Ba。研究发现,Ba亚型的HBeAg阳性率和核心区启动子双位点(T1762/A1764)突变率均显著高于巧亚型(P<0.05),在一定程度上解释了相同HBV基因型患者出现不同轻重程度临床表现的现象【491
2003年,日本的Akuta[501通过观察213例A. B. C三种基因型HBV慢性乙肝患者接受拉米吠吮治疗1年后的YMDD突变率,发现三种基因型对拉米吠咤的耐药无显著性差别。相反,B基因型中Ba亚型的耐药率显著高于Bj亚型(P<0.05)。在C基因型患者中,HBeAg阳性的耐药率明显高于HBeAg阴性(P<0.05),而B基因型的HBeAg阳性和HBeAg阴性患者之间的耐药率基本相同。所有病人中只有4例C基因型患者发展成伴有YMDD变异的急性重症肝炎,
其它基因型则没有1例,故认为乙肝病毒对拉米吠陡的耐药与基因型无关,而与基因亚型有关。从HBeAg阳性率的角度来说,B. C两种基因型患者对拉米吠吮的耐药性有差异。 |