复方牛胎肝提取物片抗肝纤维化的实验研究

贺普丁1978

目前市场已获国家食物与药品监督管理局批准的抗肝纤维化药物，如复方鳖甲软肝片（简称软肝片）和复方牛胎肝提取物片（商品名安珐特）等，两药的抗肝纤维化疗效缺乏比较研究，现用四氯化碳(CCl4)诱导的大鼠肝纤维化模型，对两药进行研究。 　　1. 材料与方法: (1)药物: 安珐特: 国药准字H23023289，黑龙江江世药业有限公司制造。软肝片：国药证字1999 z-71，内蒙古集宁制药厂制造。(2)造模:将CCl4与橄榄油配成40%油剂，按0.3ml/100g体重皮下注射，2次/周，第4周末，将SD大鼠随机分成安珐特大、中和小剂量治疗组、软肝片治疗组，每组45只，模型组70只，另设正常组10只。安珐特大、中、小剂量治疗组按每公斤体重相当临床剂量的20、10、5倍灌胃，1次/d，治疗8周。软肝片治疗组按0.625g/kg体重灌胃，模型组和正常组以等渗盐水代替。治疗8周。剩余大鼠均作停药处理，另取10只模型组大鼠停止模型处理，观察4周。(3)常规病理学与免疫组织化学染色：切片标本作苏木精-伊红(HE)、天狼红染色，按肝纤维化诊断与疗效评估共识进行肝纤维化组织学半定量计分系统（SSS）标准计分。作平滑肌肌动蛋白-α(α-SMA)、Ⅳ型胶原（C-Ⅳ）、层黏连蛋白（LN）、血小板衍生生长因子- BB (PDGF-BB)、基质金属蛋白酶13（MMP-13）、基质金属蛋白酶抑制剂1(TIMP-1)和转化生长因子β（TGF-β）免疫组织化学，α-SMA和C-Ⅳ一抗为鼠抗，其余为兔抗。α-SMA, LN和PDGF-BB的工作滴度为1:80，C-Ⅳ、MMP-13和TIMP-1的工作滴度为1:50，TGF-β的工作滴度均1:200。结果用LEICA图像分析系统进行定量分析。（4）透射电镜检查：新鲜肝组织切成1mm×1mm×1mm小块，经固定、脱水、包埋后在Ultracut E型切片机下切成超薄切片，经醋酸铀和硝酸铅染色，在JOEL 100CX Ⅱ型透射电镜下观察结果。（5）统计学处理：用SPSS10.0软件进行t检验。 　　2. 结果: (1)大鼠死亡情况: 安珐特大剂量治疗组死亡6只（13.3%），中剂量治疗组死亡14只（31.1%），小剂量治疗组死亡18只（40.0%），软肝片治疗组死亡21只（46.7%），模型组死亡34只（48.6%）。(2) 病理检查结果: 安珐特各剂量治疗组大鼠肝细胞脂肪变性程度较模型组弱，SSS计分较模型组明显减少（t值分别为2.56～2.87，P值均<0.05），软肝片组SSS计分也明显减少（t＝3.86，P<0.01），各停药组大鼠肝细胞脂肪变性程度和SSS计分有不同程度升高，停止造模组偶见大鼠肝细胞变性，肝组织结构基本恢复正常，SSS计分明显降低（t＝4.48，P<0.01）。(3) 免疫组织化学结果：α-SMA、 C-Ⅳ、LN和TGF-β在正常大鼠肝脏表达局限于汇管区和中央静脉，而PDGF-BB、MMP-13和TIMP-1未见表达。在模型组大鼠肝组织中α-SMA、C-Ⅳ、LN和TGF-β在纤维间隔、肝窦、肝细胞、汇管区、中央静脉等均可见表达，α-SMA、C-Ⅳ和LN表达以纤维间隔和肝窦为主，肝细胞表达较少。TGF-β表达以肝细胞浆和肝窦为主，肝细胞浆的表达呈弥漫性。PDGF-BB、MMP-13和TIMP-1表达阳性细胞均为肌成纤维细胞。模型组上述各蛋白的表达明显增强（t值分别为6.54～12.51, P值均<0.01），治疗组和停止造模组各蛋白的表达有不同程度的减弱，停药后又有所增强，安珐特各剂量治疗组与软肝片治疗组间差异无显著性。(4)电镜结果：模型组肝细胞线粒体肿胀，部分外膜破裂和嵴断裂，粗面内质网脱颗粒，严重时各细胞器均溶解消失，肌成纤维细胞增生，胶原生成；Disse间隙消失，肝窦内皮细胞下基底膜形成。三种剂量安珐特治疗组和停止造模组肝细胞病变较轻；鳖甲软肝片组与之相似，但肝细胞浆内溶酶体则少见；各停药组肝超微结构的情况与模型组相似。 　　3. 讨论: 软肝片是抗肝纤维化纯中药合剂。安珐特是从牛胎肝脏中提取出来的，含多肽、维生素等多种物质，临床上用于急、慢性肝炎，肝纤维化等症的辅助治疗。从病死率看，软肝片组最高，安珐特组大鼠死亡呈剂量依赖性，剂量越大，死亡就越少，提示安珐特的中、大剂量对肝组织损伤具有一定的保护作用，其作用机制之一可能与溶酶体有关。SSS计分显示安珐特和软肝片均具有抗肝纤维化作用，软肝片的作用要略强于安珐特的三种不同剂量，安珐特的中等剂量要略强于其它两种剂量，但差异均不显著。两药停药后反跳提示抗肝纤维化治疗的疗程要长。停止造模大鼠肝组织肝纤维化程度明显降低，接近正常水平，提示在肝纤维化早期消除病因的重要性。安珐特与软肝片降低α-SMA、TGF-β等的表达则提示其对胶原的抑制作用的机制是基本相同的。以上两药比较研究表明在临床上选择抗肝纤维化药物时要考虑患者的病情，一般情况下，两种药物都可使用，联合使用的效果可能更佳，肝损伤严重时，选择使用安珐特可能较为理想。