RNA干扰技术用于肝病治疗的研究

贺普丁1978

近年来，病毒性肝炎的治疗研究有了长足的进展，特别是干扰素和抗病毒核苷类药物不断有新的发现，但其疗效仍有不尽人意之处。随着人类基因组计划的完成，基因治疗的领域不断拓展，抗病毒性肝炎及相关肝病的基因治疗研究又有了相应的发展，其中RNA干扰（RNA interference，RNAi）技术的出现为病毒性肝炎抗病毒治疗研究提供了新的选择。
　　所谓RNAi技术，是指利用21～23bp长双链RNA（double strand RNA，dsRNA）诱导与其有同源序列的mRNA降解的过程。此过程首先利用特定长度的寡核苷酸与酶蛋白形成复合体，然后利用互补识别过程与靶序列结合，再由酶蛋白对靶序列离3′端约12bp处发生酶切作用从而破坏mRNA，达到阻止相应基因表达的目的。整个RNAi过程主要有以下两步骤：(1)dsRNA被切割酶剪切为小干扰RNA（small interfering RNA，siRNA）；(2)siRNA与酶蛋白结合形成RNA诱导的沉默复合体（RNA-induced silencing complex，RISC），RISC再与靶mRNA结合，利用酶切作用破坏mRNA。由于RNAi作用具有序列特异性，最终破坏的是mRNA，因此它主要被用于两个方面：反向功能基因组学研究和抗病毒研究。与同源基因重组、反义寡核苷酸和核酶等技术相比，RNAi技术更方便、经济和快速。因此，自其问世以来就迅速和大量地被用于研究从线虫到人类的基因，并取得了不菲的成绩。RNAi最初就被证明是植物抗病毒的基本手段。而当其在哺乳动物细胞中也被证实存在以后，就迅速地被用于抗病毒治疗研究[1]。要利用RNAi进行研究，首先必须获取siRNA。目前为止较为常用的5种制备siRNAs的方法包括：化学合成 、体外转录 、长片断dsRNAs经RNA酶Ⅲ类降解、siRNA表达载体或者病毒载体在细胞中表达siRNAs、聚合酶链反应（PCR）制备的siRNA表达框在细胞中表达。前3种方法包括体外制备siRNAs然后经过转染或者电转导入哺乳动物细胞，后2种方法则依赖能够表达siRNAs的DNA载体或者表达框转染到细胞中[2, 3]。
　　对于乙型肝炎病毒（HBV），Hamasaki等[4]以体外人工合成siRNA，Shlomai等[5]所用的siRNA则由载体pSuper携带相应序列在胞内表达，McCaffrey等[6]所用的siRNA来源于含人U6启动子的表达载体，分别于体外细胞模型和小鼠体内，在mRNA水平、蛋白质水平可检测到siRNA对靶基因的抑制作用。对于丙型肝炎病毒（HCV），McCaffrey等[6]首先证实了RNAi技术在小鼠体内是可行的；Seo等[7]以具有HCV亚基因复制子的Huh-7为细胞模型，发现靶蛋白表达呈剂量依赖型的下降；Wilson等[8]通过HCV感染细胞模型AB12-A2，检测了6个siRNA分子的作用，结果发现不同分子有迥异的表现，同时也证明通过载体表达的siRNA分子可以比直接转染体外化学合成的siRNA分子有更长的作用时间。
　　包括HBV和HCV在内，因RNAi现象发现以来，RNAi用于抗病毒研究国内外已有较多报道，使人们不难认可其用于抗病毒治疗的有效性及应用前景。模拟病毒对siRNA的良好反应说明在进化过程中，要么RNAi未能对病毒施加足够的抗病毒压力，要么病毒以某种手段逃避了RNAi的抗病毒压力。目前为止，尚无通过人体细胞内切割酶形成siRNA分子，达到抗病毒效应的报道。体外合成和胞内转录的siRNA能够发挥抗病毒作用，说明病毒可能是通过干扰siRNA的形成而逃避机体的免疫压力（例如破坏切割酶），而siRNA的体外合成和胞内转录则绕过了这一步骤。在确认RNAi的作用后，其第二步当然是找到具有最佳效果的siRNA作用靶序列。RNAi用于抗HBV治疗有如下优点：第一，它的作用具有序列特异性，且siRNA本身由于片段短，不会引起非特异性的细胞免疫反应。第二，HBV本身长约3200bp,有3.5kb、2.4kb、2.1kb、0.8kb 4种mRNA,可提供数百个RNAi的作用位点；但同时由于HBV的DNA聚合酶缺乏纠错能力，从而具有高度变异性。在选择siRNA的作用位点时首先应考虑保守区域，其次可同时使用多个位点，则可有效防止病毒变异株的出现。早先有研究者认为，siRNA的作用与靶序列的二级结构无关[9]。新近有研究结果表明，RNAi的作用是与其二级结构有关的。第三，RNAi的作用不依赖于病毒的复制，使得该技术可与现有抑制HBV复制的药物（如拉米夫定）联合应用。当然，与拉米夫定一样，RNAi技术也不能从体内清除共价闭合环状DNA。但利用此技术，或许可能建立起用于抗HBV的“鸡尾酒治疗法”。对HCV而言，其高度保守的5′端非翻译区和核心抗原区及NS5B是查找的重点。同样，同时应用针对多外靶序列的siRNA则可有效防止抗性变异株的出现。从理论上讲，任何siRNA分子，只要其对应靶序列不在调节蛋白结合区，都应是有效的。但也可以看到，多个研究小组设计了多个siRNA分子，这些分子对病毒的抑制效应却有明显的差别。究其原因，一方面RNAi的具体作用机制尚未完全清楚，另一方面考虑到机体与细胞内的复杂环境，RNAi的过程似乎也不应像理论上那么简单。RNAi要用于人体治疗，其药代动力学也是研究的重点。目前关于siRNA分子在胞内的有效时间长短不一，短则72h，长则21d。这种差别可能来自所选实验模型的差异，亦或是具体实验方法的不同。关于RNAi用于抗HBV、HCV的研究，目前多限于体外进行。要进一步有所突破，一方面，有必要在更接近人体，同时亦是病毒宿主的大动物模型（如黑猩猩）体内进行实验；另一方面，还需要解决如何安全有效地将siRNA或其表达载体导入人体，定位于肝脏细胞内的问题。
　　RNAi应用于抗病毒，特别是抗HBV、HCV的大量研究成果，让人们看到其重要的应用前景。本期所选用的几篇国内RNAi技术在肝病治疗中的研究报道，涉及病毒性肝炎、肝纤维化及肝癌等领域，已初步显示国内肝病研究对于RNAi这一新技术的重视。尽管目前仍有大量的问题尚未解决，如RNAi作用机制，进入体内的安全性等，但加强RNAi这一新技术的研究，为肝病治疗研究开拓了一全新的方向。