乙型肝炎病毒相关慢性肝病前C区/BCP区基因突变的临床意义

贺普丁1978

实验采用PCR技术及芯片杂交原理，对65例乙型肝炎病毒（HBV）相关性慢性肝病患者进行前-C区及BCP区A1896、 A1899及nt1762/nt1764联合突变检测，探讨HBV相关性慢性肝病前C区/BCP区基因突变的临床意义。
　　一、资料与方法
　　1．研究对象：我院2002年3月至2003年3月住院患者65例,其中慢性乙型肝炎23例，肝炎后肝硬变22例,原发性肝癌20例。男46例，女19例，年龄16～72岁，平均（40.9±14.7）岁。HBsAg及HBV DNA均为阳性，诊断符合2000年《病毒性肝炎防治方案》。正常人血清30份作对照。
　　2. 方法：(1)基因芯片制备: 据HBV耐药基因研究资料针对nt1896、nt1899、nt1762、nt1764 4个位点设计长度为18～25nt探针，全自动DNA合成仪进行Oligo DNA的合成，用GMS417点样仪将探针固定在经过醛基修饰处理的玻片上。(2)HBV DNA的制备：取-70℃保存的患者血清65份，分别用Qiagen DNA抽提试剂盒提取DNA。(3)PCR扩增及荧光标记: 取PCR-MIX 18μl、在暗室加入荧光引物2μl、Taq酶和UNG酶各0.3μl于PCR管中，再加入5μl抽提标本，离心后即可置PCR仪上循环扩增30个循环。(4)杂交: 在暗室内取8μl的PCR产物和8μl的杂交液加于离心管中，95℃变性5min，放置冰上2～3min，滴于芯片的点样区，放入杂交舱，55℃水浴锅杂交30min。
(5)洗脱: 在暗室内用双蒸水冲掉盖玻片后，把芯片置于稀释的洗脱液内室温洗脱2min，取出置于双蒸水的另一缸内静洗1min，取出芯片，自然晾干。(6)扫描：将芯片置Scanarray4000激光共聚焦扫描仪上扫描。(7)扫描结果分析: 用ImaGene3.0分析CY5荧光信号的强度和比值，判定基因阳性表达的标准为：CY5阳性点的荧光信号平均值超过阴性点信号的3倍，比值范围大于2.7；阴性荧光信号值小于800，CY5阳性荧光信号值减去阴性荧光信号值后大于400；PCR结果良好。(8)30份芯片检测阳性的血清标本提取HBVDNA后，在前述PCR条件下进行扩增，经乙醇沉淀纯化后，送上海联合基因研究院进行测序。(9) 统计学处理: 用χ2和t检验。
　　二、结果
　　1. 芯片检测的阳性率及特异性：同时检测HBV前C区/BCP区基因nt1896、nt1899、nt1762、nt1764四个位点，芯片阳性点CY5荧光信号值在1216～79152，阳性参照值在1036～57660之间，比值在2.8～6.8；芯片阴性点CY5荧光信号值在56～536，阴性参照值在3110～38620，比值均小于1。65份血清标本63份HBV前C区/BCP区可检测到野生或突变基因，阳性率为96.9%，2例阴性。正常对照组标本30份均阴性。芯片检测阳性的血清标本中取30份进行测序，两者比较符合率达100%，提示应用基因芯片法测定HBV特定变异位点特异性强。
　　2. 前C区/BCP区突变率：63份芯片检测阳性的血清标本中，A1896突变毒株25例（39.7%）；A1899突变毒株12例（19.1%），A1899变异12例中10例伴随A1896变异出现，2例单独出现；nt1762/nt1764联合突变43例（68.3%）；三位点以上的多位点变异毒株19例（30.2%）; 63例中有13例四位点均未发生变异。
　　3. 不同HBV血清标志物前C区/BCP区变异情况：将芯片检测阳性的63例患者分为HBeAg阳性组、抗-HBe阳性组和HBeAg、抗-HBe阴性组。A1896突变、nt1762 nt1764联合变异组及多位点变异与慢性肝病的HBeAg分泌障碍有关。
　　4. 前C区/BCP区变异与肝功损害相关性：前C区/BCP区各变异组ALT、 ALT分别与未变异组比较。提示前C区、BCP区及其多位点变异可加重肝功能损害。
　　三、讨论
　　基因芯片技术是通过分子杂交的方式，直接对已知核苷酸序列的病原体基因片段进行检测。研究所用的芯片是采用点样法制作的低密度芯片，可以较好地解决HBV多位点基因突变的检测问题。65份血清标本中63 份HBV前C区/BCP区可检测到野生或突变基因，阳性率为96.9%。取30份芯片检测阳性的血清标本进行测序，二者比较符合率达100%，而正常对照组标本30份均阴性,表明应用基因芯片法测定HBV特定变异位点特异性强,假阳性率低。侯金林等认为前C区和BCP变异可加重肝功损害。前C区/BCP区多位点变异与未变异组比较差异有显著性，说明多位点突变与肝损害显著相关。前C区/BCP区变异与慢性HBV感染HBeAg分泌障碍有关，是HBV相关性慢性肝病HBeAg阴性的主要机制之一，本研究结果与其相符。