肝相关干细胞研究的现状与展望

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肝相关干细胞研究的现状与展望 魏来 2004-12-30 9:22:13　中华肝脏病杂志，2004年，第12卷，第12期，705-707 [摘要]

Stem cell research and its prospects for liver disease treatment. WEI Lai. 【Key words】Stem cell; Differentiation; Therapeutics; Liver diseases 【First author''s address】Peking University People''s Hospital, and Peking University Hepatology Institute, Beijing 100044, China

　　《Science》将干细胞研究列为1999年十大科学进展的首位，2004年3月11日出版的《Nature》中，“胚胎国家”（an embryonic nation）一文介绍和评价了中国的干细胞研究情况，认为在西方国家对该方面研究还很敏感的情况下，中国“对胚胎技术相对宽松的观点使其有可能成为该领域的世界领头人”[1]。显示了我国的干细胞研究成为不多的与国际上起点相接近的科学研究。在国家第十个五年计划启动时，高技术发展（863）计划也对干细胞研究予以大力支持，为今后的发展奠定了必要的基础。 　　国外对肝相关干细胞的研究经历了肝内干细胞的辨认、肝内干细胞来源特别是骨髓源性干细胞的作用、干细胞向肝细胞的体内外定向诱导分化等阶段。因为骨髓源性干细胞定向分化为肝细胞的研究既涉及到干细胞分化的重要机制（成体干细胞的横向分化），又与今后可能的临床应用密切相关，近年对此方面的研究成为热点。自1999年首次发现大鼠的骨髓细胞可以分化为肝卵圆细胞，并进而分化为肝细胞和胆管上皮细胞以来，不断有一些研究支持这一观点，也不断有一些研究提出了骨髓源性干细胞在肝内与肝细胞融合的证据，认为肝内出现的新标志细胞是植入细胞与原肝细胞的融合而不是由干细胞横向分化而来。2004年发表的几篇报道在对初始细胞状态、分化环境等严格控制的条件下，证明造血干细胞可以横向分化为肝细胞而没有细胞融合的证据，当造血干细胞与损伤的肝组织在分隔的体系中共培养时，损伤肝组织分泌的因子刺激了干细胞的横向分化，但由于干细胞不与肝组织直接接触而排出了融合的可能性，并且在移植给肝损伤鼠后，随着肝组织损伤的增加而转化为有活性的肝细胞，肝功能在细胞移植后2~7 d得以恢复[2]。Harris等[3]在干细胞性别交叉移植前先以绿色荧光蛋白报告基因转染干细胞，移植后发现分化的细胞没有表达绿色荧光蛋白，但其Y染色体是双倍体，这一严格的试验再次证明横向分化可以发生在无细胞融合的情况下。但是，迄今为止的人体和动物观察研究都没有足够的证据说明横向分化所占的比重，以及多大比重的横向分化可以恢复受损的肝功能，而且，干细胞移植恢复肝功能的研究多在化学诱导剂诱导动物肝损伤的条件下进行，有些还利用化学制剂抑制了动物自体肝细胞的增殖，2004年10月底召开的美国第55届肝病年会上有学者还报告外源干细胞还可分化为肝星状细胞。所以，外源干细胞横向分化在人肝脏损伤时的治疗意义并不明确。 　　肝内干细胞研究主要集中在肝再生过程中肝细胞的来源及干细胞在肝脏生理和病理情况下的作用。以往认为成熟肝细胞的增殖能力非常有限，但这一观念在近年已被重新认识[4]，成熟的肝细胞可以自我复制70次以上且具有归巢能力，归巢能力并不依赖于干细胞。因此，肝细胞有着巨大的增殖潜力。不断的进展还认识到，位于Hering管和终末小胆管的卵圆细胞是肝脏增殖、再生的始祖细胞，能补充肝实质细胞和胆管上皮细胞，但是这种肝干细胞向成熟肝细胞的分化还有许多不明确的问题，因为肝干细胞并没有一致的、特异性的标志物，只有一些高度表达的标志物，使得对其分化的观察研究受到一定的影响。肝坏死是研究肝干细胞在肝再生中最好的模型，免疫病理也发现肝组织中胆管细胞呈现非典型增生，表现卵圆细胞的特征，一些肝细胞的表型也界于卵圆细胞与肝细胞之间，这些细胞都可进一步分化为肝细胞，但并不能彻底完成肝再生，所以，有人认为肝的再生依赖于成熟肝细胞的增殖，卵圆细胞或肝始祖细胞参与修补作用[5]。此外，外源干细胞移植于坏死肝内不易存活，所以，对于外源干细胞参与肝损伤修复的研究多将干细胞移植于脾内，但遗憾的是，移植于脾内的干细胞多呈结节状生长，而且，对肝功能恢复的确切效果有限。这可能与干细胞所处的环境有关，给进一步的临床应用带来了困难。在原发性胆汁性肝硬化、脂肪肝等慢性肝病患者肝组织中都可发现肝干细胞，但仍然发生肝纤维化，提示干细胞未能正确分化，这与干细胞在体外经星状细胞刺激而分化为肝细胞的结果不相同。这些结果都提示现在还不能明确肝干细胞可以成为真正的完全意义上的肝细胞。肝细胞自身强大的增殖能力以及肝内干细胞在不同状态下分化能力的良莠不齐使我们面临一个最重要的问题，即肝脏疾病是否需要干细胞治疗，如何将干细胞运用于肝脏疾病的治疗。由于干细胞体外分化研究较为成熟并由于致瘤性的问题，干细胞在肝脏疾病中可能首先用作生物人工肝的肝细胞来源；通过体外基因修饰干细胞，用于治疗代谢性疾病也可能有一定的前景。而对于其它急慢性肝病的治疗还需要更多的基础研究。 　　还有一个与干细胞分化机制研究以及临床应用密切相关的问题是肝内干细胞移植是否会引起肝脏肿瘤。干细胞具有低分化、无限增殖的潜能，有研究将一些形态和功能上均具有卵圆细胞特征的细胞注射于裸鼠皮下，2周到7周后即长出低分化的肝细胞癌肿块。目前，关于干细胞向肝细胞分化的机制并不清楚，干细胞转化为肝细胞无论是因为干细胞的横向分化，抑或是由于干细胞和肝细胞的融合，都存在基因重排的问题。此外，干细胞输入体内后，在体内的分化过程难以控制，当其大量增生而不再向成熟肝细胞和胆管细胞定向分化时,就可能形成肝细胞性或胆管细胞性肝癌。但在其它相关方面的研究进展也提供了一些有意义的启示，如癌基因MYC的失活可以使肝癌细胞逆转，分化为肝细胞和胆管细胞，甲胎蛋白表达消失，细胞角蛋白8和癌胚抗原表达增加，有些细胞还表达肝干细胞的标志物细胞角蛋白19[6]。提示，肝干细胞、肝细胞和肝癌细胞间本身就没有截然的界限，只是如何控制其调控。 　　在国外研究进展的同时，我国的干细胞研究在干细胞的分离富集、细胞因子调控、体内外定向诱导分化、细胞移植等方面均取得了一定进展。完成了小鼠胎肝中干细胞样细胞的分离及在移植脾内的集落样生长研究。第三军医大学在优化大鼠肝卵圆细胞的增殖模型的基础上进行了肝卵圆细胞脾移植的研究[7]。解放军肝病研究所探讨了不同因子对干细胞增殖、分化的影响[8]。北京大学肝病研究所发现骨髓干细胞在肝纤维化的环境中仍能分化为肝细胞，而未向肌成纤维细胞分化[9]，且发现大鼠骨髓间充质干细胞更易分化为成熟的肝细胞，而造血干细胞可能经过一些早期阶段[10]。这些研究都是临床应用研究的重要基础。 　　本期，我们组织了肝干细胞研究的重点，赵运转等从胎肝中分离培养得到具有多向分化潜能的间充质干细胞，且该细胞在体外至少可传8代并保持增殖能力、形态、大小与颗粒度不变，是建系和今后稳定利用的基础。孟瑛等以酸性成纤维细胞生长因子、肝细胞生长因子和制瘤素M诱导胚胎干细胞的肝系定向分化，是胚胎干细胞源性肝细胞治疗的另一个必要的基础研究。周一鸣等发现在肝细胞生长因子（HGF）单独作用下，即能将成年小鼠骨髓干细胞在体外诱导分化为肝细胞样细胞，该研究可能为获得生物人工肝的细胞建立最简单的方法。王萍等发现分化刺激剂丁酸钠能诱导肝卵圆细胞向成熟肝细胞方向分化，并且所分化的细胞占总细胞数的50%左右，显示了较高的诱导分化效率，不失为一个重要的诱导分化方法。周播江等分别应用鼠肝再生血清和HGF对大鼠骨髓细胞进行定向诱导分化培养，并经尾静脉输入，发现移植分化的细胞能定向迁移至肝和脾。该研究不仅是体外研究的基础之一，更为重要的是其采用的尾静脉输入法为今后外周静脉输入干细胞提供了实验依据。方天翎等发现淤胆血清及HGF诱导下胚胎干细胞能分化为较为均一的多角形细胞，并具有肝细胞功能。该结果与北京大学肝病研究所在肝纤维化环境下的诱导和国外星状细胞促进干细胞向肝细胞的定向分化具有相似的结果，为干细胞在不同病理状态下的应用奠定了一定的基础。 　　从上述国际国内的研究不难看出，我们关于干细胞的研究实际上还刚刚起步。在今后一个阶段的研究中，我们应该关注以下一些方面：首先，干细胞在增殖分化过程中是否易受乙型肝炎病毒（HBV）感染，并增加HBV整合。其次，需要建立稳定的干细胞体外诱导平台，包括不影响干细胞活性的富集方法、诱导过程中的监测、诱导分化后的致瘤性等其他生物安全方面的监测以及对功能的影响。这样的平台对于基础和应用研究都是必要的，以保证结果的可比性和质量控制。第三，探讨更具有可行性的干细胞来源。我国的造血干细胞移植在世界上占有重要地位，而外周血造血干细胞容易获得，体外操作技术相对成熟，我们应该对造血干细胞和脐带血干细胞的肝系诱导分化作更多的研究。第四，加强干细胞诱导分化机制的研究，特别是应该明确干细胞分化为成熟肝细胞和肝癌细胞的分水岭。该方面研究时间的长短在一定程度上决定了干细胞真正应用于临床的时间。第五，开展基因修饰干细胞的应用基础研究，有可能成为代谢缺陷性肝脏疾病和肝癌治疗的一种替代疗法而应用于临床。最后但非常重要的是应强调干细胞临床应用的法规和行业准入制度，以保证临床研究能完全遵循药物临床实验准则。因为在临床应用中对干细胞的进一步处理可能还会遇到未知的问题，美国食品药物管理局已经将干细胞的处理分为简单操作的“初处理”，扩增、活化、修饰的“进一步处理”。上述提到的造血干细胞先行和干细胞应用于生物人工肝先行也是源于这方面的考虑，如果我们在现有的对肝纤维化、淤胆等病理情况下诱导干细胞定向分化进一步明确的前提下，方可谨慎地进行自体造血干细胞的直接治疗应用研究。 　　与国际的总体研究进展比较，我国的肝干细胞研究比较散，深入和系统性不够，对干细胞各种标志物和分化中的各种指标检测不足，从而缺少说服力，是很少被国外引用的主要原因。关于干细胞体内分化或分化细胞体内应用对肝功能影响以及致瘤性等多方面的研究也很少，还不够深入。这可能与我们的实验研究经费有限有关，也与我们基础与临床相结合的研究少有关。这些都有待大家共同努力，加以提高。 　　2005年我们还将组织一期肝干细胞研究的重点，我们希望并相信能够看到肝干细胞研究的深入和发展。使我国肝干细胞的研究发展更快，更理性，更规范。 参 考 文 献 [1]Yang X. 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[10]Shu SN, Wei L, Wang JH, et al. Hepatic differentiation capability of rat bone marrow-derived mesenchymal stem cells and hematopoietic stem cells. World J Gastroenterol, 2004, 10: 2818-2822. （收稿日期：2004-10-18） （本文编辑：朱红梅）

作者单位：100044 北京大学人民医院、北京大学肝病研究所 魏来 男，教授，主任医师，博士生导师。