乙型肝炎病毒感染模型研究新进展

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乙型肝炎病毒感染模型研究新进展 陶鹏 黄爱龙 【关键词】 肝炎病毒，乙型； 细胞模型； 动物模型 The latest progresses of HBV infection models. TAO Peng, HUANG Ai-long. 【Key words】 Hepatitis B virus ; Cell model; Animal model 【First author抯 address】 Institute for Viral Hepatitis, Chongqing University of Medical Sciences, Chongqing 400010, China 　　病毒性肝炎抗病毒药物的开发和评价中的重要环节之一就是建立一种方便有效的体内外模型。现就乙型肝炎的感染模型新进展作一简要综述。 一、体外模型 　　乙型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBV）感染有高度的种属和组织特异性，它只感染人和类人猿。其原因是病毒黏附以及病毒DNA转录及复制对细胞有严格的要求[1]。体外培养的人和类人猿原代肝细胞可以支持HBV的复制，但细胞维持时间不长。能在体外长期培养的肝源性肿瘤细胞株2.2.15是应用最广泛的乙型肝炎细胞模型。将含有HBV基因组（２个HBV头对尾二聚体，以尾对尾方向串联）的重组载体质粒转染HepG2细胞，经G418筛选，得到的克隆能稳定分泌HBsAg、HBeAg及Dane颗粒，可检测到细胞内DNA和RNA，但无cccDNA。2.2.15细胞模型存在的问题是：HBV是整合在宿主细胞染色体上，复制方式与自然感染不同，且不能被清除；病毒复制的水平不能人为改变；病毒复制水平低。为克服HBV的细胞膜屏障，人们借用其他病毒的感染能力，把HBV导入到靶细胞。Delaney等[2]报道了一种抗HBV药物体外筛选系统，即HBV-杆状病毒-HepG2系统。利用杆状病毒Autographa California将具有复制能力的HBV基因组导入到HepG2细胞，检测到高水平的HBV表达，包括细胞内和细胞外HBV DNA和RNA，以及cccDNA和各种HBV抗原。病毒表达的水平和病毒的感染量（MOI）有量效关系。该系统可以控制感染的时间，在病毒复制期间或之前对细胞进行处理。用该系统对拉米夫定的药效进行评价，发现拉米夫定可以减少细胞内复制中间体和细胞外HBV DNA,而且可以抑制cccDNA的表达，这在以前的系统中是不能观察到的。拉米夫定的作用有剂量和时间依赖性[3]。他们还用此模型检测了药物对HBV变异株的作用[4]。但是，杆状病毒系统也有缺陷：(1) 杆状病毒进入哺乳动物细胞是通过非特异的内涵体摄取而不是受体介导方式；(2)杆状病毒感染的每个细胞内有多个HBV拷贝；(3)杆状病毒介导的基因转移限制在一定的种属，更重要的是不能作为动物体内实验的方法。He等[5]采用Ad-HBV1.3-HepG2系统以腺病毒为载体，将1.3倍的HBV转入包装细胞，再将包装好的病毒感染HepG2细胞，可以产生高水平的HBV表达。该系统利用细菌内同源重组法[5]，将具有同源性的两个质粒pAdEasy和pAdTrack-CMV共转化E.coliBJ5183细胞，使腺病毒载体和目的基因HBV1.3连为一体。HBV1.3除含完整HBV基因组外，在5′端还多余一段HBV序列，即ENHI和ENHII,X ORF.Poly A[1]。转基因小鼠实验证实HBV1.3比HBV1.1和HBV1.2更高地表达HBV[6]。质粒pAdEasy含有不完整的腺病毒Ad5基因，缺失E1区(1-3533)和E3区(28130-30820)，E1区对于病毒复制是必需的，293细胞可以补充E1区。质粒pAdTrack-CMV含有目的基因HBV1.3,CMV 启动子，绿色荧光蛋白基因（GFP），卡那霉素Kan,Pacl位点，pmel位点，在pmel两侧分别为两臂，左臂含Ad5第34931-35935核苷酸，右臂含Ad5第3534-5790核苷酸，两臂介导和pAdEasy的同源重组。将pAdTrack-CMV用pmel酶线性化后，和环状的pAdEasy共转化E.coliBJ5183细胞，利用卡那霉素抗性筛选重组体，再用限制酶 pacI.speI.BamH1消化证实；重组成功的质粒用pac1线性化，然后用脂质体法转染包装细胞293(人胚肾细胞)。观察绿色荧光蛋白的表达，可以计算转染的效率。用获得的病毒颗粒重复感染293细胞，进一步扩增病毒。 当病毒的滴度达到108～109时，用合适的MOI感染HepG2细胞。用Southern blot和nothern blot检测细胞内外的HBV复制中间体。该载体具有以下优点：(１)含有大部分腺病毒基因组序列的腺病毒骨架质粒，于超螺旋形式应用而不需要进行酶切处理；(２)重组是在具有高效同源重组机制的细菌内进行而不是哺乳动物细胞内，省掉了连接的步骤；(３)可以插入达10kb的目的基因，而且可以在同一病毒内插入多个基因；(４)腺病毒骨架质粒上整合了绿色荧光蛋白基因，可以直接观察转染和感染效率，使得腺病毒监测问题变得更容易[5]。Sprinzl等[7]利用AdHBV1.3，将293细胞包装好的病毒感染数种原代肝细胞和HepG2细胞，获得成功。分别用Ad-HBV1.3感染人原代肝细胞，小鼠肝细胞，大鼠肝细胞，树鼠句肝细胞，以及鸭肝细胞和HepG2细胞，应用Southern杂交检测出细胞内HBV DNA，cccDNA,用northern杂交检测到3.5kb、2.4kb和2.1kb的HBV RNA。用western blot 检测到HBV各种抗原。应用斑点杂交方法检测到培养基或血清中的HBV颗粒。该系统使HBV可以感染跨种的多种细胞，包括小鼠，大鼠，树鼠句肝细胞，甚至包括禽类的鸭肝细胞。以DHBV代替HBV也能得到相似的结果。和2.2.15系统相比，它具有高效转移、表达HBV，可对HBV突变和表达进行人为控制等优点；和杆状病毒系统相比，它不存在种属障碍，可以用做体内实验，而且表达水平更高。 二、体内模型 　　类人猿和黑猩猩作为HBV感染模型已得到公认，但价格昂贵，难以推广。土拨鼠肝炎病毒（WHV）慢性感染的土拨鼠可以发展为严重的肝炎和肝肿瘤，和人感染HBV后的发病过程非常相似。给新生的土拨鼠接种WHV, 可获得慢性WHV感染土拨鼠模型。慢性WHV携带的土拨鼠平均寿命为29个月，最后几乎全部都发展为肝肿瘤。土拨鼠还可作为抗病毒药物临床前评价的工具，研究药物的药效、药物动力学以及毒理，也可用作评价免疫治疗的疗效[8]。用土拨鼠的局限是：它们感染的肝炎病毒为WHV，和HBV有一定差异，使对乙型肝炎的发病机理和机体应答的研究受到限制。研究发现树鼠句可以感染HBV，严瑞琪等[9]发现HBV感染树鼠句HBsAg血症者47%，平均持续7周，HBV DNA阳性率51%，持续41周以上；肝细胞HBV DNA阳性率67%，并存在复制型HBV DNA。用感染HBV树鼠句的血清可连续传代感染。但国外报道有所不同，将新生树鼠句和成年树鼠句腹腔接种HBV阳性患者的血清，都在血清中检测到HBsAg,2～4周后血清中检测到抗HBs,抗HBc，抗HBe，而HBsAg消失，类似急性肝炎的病程。说明在树鼠句感染HBV是一过性的，HBV的复制和表达水平不高。 　　Sprinzl等[7]利用Ad-DHBV1.3系统，将293细胞包装好的病毒颗粒以尾静脉接种小鼠，5d后处死小鼠，8只小鼠中有7只肝脏中用Southern blot检测出复制型DHBV,用PCR检测出所有小鼠的血清中有DHBV,都没有腺病毒DNA。用这些鼠的血清可以感染原代鸭肝细胞，并且和DHBV阳性鸭的血清感染效率相当。说明DHBV也可以通过腺病毒转移到小鼠肝脏并支持DHBV体内复制。近年来HBV转基因小鼠受到重视。将HBV目的基因显微注射到小鼠的受精卵，产生稳定整合HBV的小鼠。在目的基因的选取上，可以是HBV全长或超过其基因组的1.3倍HBV，也可以是HBV片段，如前s、s、c和x基因，用于研究各基因及其表达产物在HBV生活史中的作用。HBV转基因小鼠不仅可以研究HBV感染过程和感染后的免疫病理改变[10]，还有助于发展新的抗病毒治疗方法。HBV转基因小鼠实验发现在慢性HBV携带者由于一种抗原提呈细胞（树突状细胞）的功能缺陷和缺乏一些必要的细胞因子，不能有效提呈HBsAg,不能清除病毒，导致持续感染[11]。但是在所有的HBV转基因小鼠都不能检测到细胞内cccDNA, 而cccDNA是前基因组及各种长度RNA的转录模板，在HBV的复制过程中起着非常重要的作用，而目前抗病毒治疗主要是在反转录和复制水平抑制病毒DNA，而且HBV是整合在宿主染色体上的，没有经过和靶细胞受体结合穿透的过程，与自然感染不同，应用也受到限制。 　　为克服转基因鼠的缺陷，人们寻求一种模拟HBV自然感染的动物模型。Dandri等[12]将UPA转基因小鼠和RAG-2基因剔除小鼠杂交，得到的后代被移植入人肝细胞。由于UPA是一种纤维蛋白酶原激活剂，它选择性地在肝细胞表达，使肝细胞中的蛋白质水解，造成UPA小鼠体内肝细胞持续损伤，产生肝再生刺激信号，有利于外源肝细胞的存活。而RAG-2基因剔除小鼠由于缺失重组活化基因RAG-2,T细胞和B细胞不能成熟，不具备完整的体液和细胞免疫功能，对外源肝细胞不排斥。二者杂交的后代兼有以上两种特征，可以支持HBV感染和表达。实验中采用脾内注射人肝细胞悬液，在小鼠血清和肝脏中均检测到HBV各种抗原和复制中间体。该模型可以用于HBV感染过程和治疗的研究，以及肝癌的发生机理，但因采用的是免疫缺陷鼠，不能作为机体和病毒相互作用特别是免疫清除机理的研究。另外，人肝细胞移植的效率很低，只占小鼠肝脏的15%，而采用同样的方法移植土拨鼠肝细胞，则可占小鼠肝脏的90%以上，可能和移植肝细胞的活力高低有关。 　　从已有的HBV体内外模型看来，Ad-HBV1.3-HepG2系统是较为理想的，可以用做体内体外实验，研究HBV的生物学，判断抗乙型肝炎药物及其他治疗手段的疗效，但是不能用作研究病毒黏附，致癌机制等。HBV体内体外模型还需要进一步探索。 参 考 文 献 1Tang H, McLachlan A. Transcriptional regulation of hepatitis B virus by nuclear hormone receptors is a critical determinant of viral tropism. Proc Natl Acad Sci USA, 2001, 98: 1841-1846. 2Delaney WE, Isom HC. Hepatitis B virus replication in human HepG2 cells mediated by hepatitis B virus recombinant baculovirus. Hepatology, 1998, 28: 1134-1146. 3William E, Delaney IV,Thomas GM, et al. Use of the hepatitis B virus recombinant baculovirus-HepG2 system to study the effects of (-)-β-2',3'-dideoxy-3'-thiacytidine on replication of hepatitis B virus and accumulation of covalently closed circular DNA. Antimicrob Agents Chemother, 1999, 43: 2017-2026. 4Delaney WE, Edwards R, Colledge D, et al. Cross-resistance testing of antihepadnaviral compounds using novel recombinant baculoviruses which encode drug-resistant strains of hepatitis B virus. Antimicrob Agents Chemother, 2001, 45: 1705-1713. 5He TC, Zhou S, Da-Costa LT, et al. A simplified system for generating recombinant adenoviruses. Proc Natl Acad Sci USA, 1998, 95:2509-2514. 6Guidotti LG, Matzke B, Schaller H, et al. High-level hepatitis B virus replication in transgenic mice. J Virol, 1995, 69: 6158-6169. 7Sprinzl MF, Oberwinkler H, Schaller H, et al. Transfer of hepatitis B virus genome by adenovirus vectors into cultured cells and mice: crossing the species barrier. J Virol, 2001, 75: 5108-5118. 8Tennant BC, Gerin JL. The woodchuck model of hepatitis B virus infection. ILAR J, 2001, 42: 89-102. 9严瑞琪，苏建家，黄定瑞，等. 人乙型肝炎病毒在树鼠句的实验感染及其与肝癌发生的关系. 中山医科大学学报，1995，16：1-5. 10Walter E, Keist R, Niederost B, et al. Hepatitis B virus infection of tupaia hepatocytes in vitro and in vivo. Hepatology, 1996, 24: 1-5. 11Guidotti LG, Borrow P, Hobbs MV, et al. Viral cross talk: intracellular inactivation of the hepatitis B virus during an unrelated viral infection of the liver. Proc Natl Acad Sci USA, 1996, 93: 4589-4594. 12Dandri M, Burda MR, Torok E, et al. Repopulation of mouse liver with human hepatocytes and in vivo infection wth hepatitis B virus. Hepatology, 2001, 22: 981-988.

(收稿日期：2002-09-18) (本文编辑：金生) 作者单位：400010 重庆医科大学病毒性肝炎研究所 陶鹏 29岁，住院医师，在读博士研究生，从事病毒性肝炎发病机理及治疗研究。

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