拉米夫定与YMDD变异

tonychant

拉米夫定（lamivudine）做为公认的抗病毒药物，对乙型肝炎病毒（HBV）DNA的抑制作用及治疗HBV感染的疗效已得到肯定。作为第一个获FDA批准的口服抗病毒药物，其问世推动了慢性乙型肝炎治疗的进程。在拉米夫定广泛应用的同时也遇到了一些新的问题，如持续应答率不满意、部分患者停药后复发、需长期用药和耐药变异等。尤其是YMDD的变异更为病人和学术界关注。2003年的拉米夫定临床应用专家共识也提到了有关YMDD变异的出现、临床表现和处理等问题。

拉米夫定所致YMDD变异的个体化治疗对策 作者：刘庄　　来源：中华肝脏病杂志　 【关键词】 肝炎病毒，乙型； 拉米夫定； YMDD变异； 治疗，个体化 Individual therapy for the patients with YMDD mutation in HBV by lamivudine. LIU Zhuang. 【Key words】 Hepatitis B virus; Lamivudine; YMDD mutation; Individual therapy 【First author抯 address】 Beijing Ditan Hospital, Beijing 100011, China 　　随着拉米夫定应用时间的延长，病毒变异的问题日渐突出，不同肝病患者出现病毒变异后情况不同，因此应给予不同的治疗对策。 1．资料与方法：3例患者均为在我科住院或门诊治疗的乙型肝炎病例。肝功能使用全自动生化分析仪检测，乙型肝炎病毒（HBV）标志物采用微粒子酶免荧光分析法（MEIA）检测，试剂使用美国雅培公司提供的Abbott试剂盒，HBV DNA采用荧光聚合酶链反应（PCR）定量检测，YMDD变异采用限制性内切酶长度多态性（IFLP）分析法检测。病例1，男，41岁。发现HBV感染12年，肝功能异常2年，HBV复制指标阳性。诊断：慢性乙型肝炎。干扰素治疗效果不理想。于2000年4月开始服用拉米夫定，肝功能恢复，HBV e抗原（HBeAg）降至67.30s/co，HBV DNA降至2.29×103拷贝/ml。服用27个月，于2002年7月出现病情反复，丙氨酸氨基转移酶（ALT）升至488U/L，HBeAg 201.38s/co，HBV DNA 7.28×106拷贝/ml，检测YMDD变异（+）。使用甘草甜素、苦参素等治疗，效果不明显。于2002年10月停用拉米夫定，改用干扰素治疗。治疗1个月时患者ALT一度升至582U/L，2个月时，ALT恢复正常，HBeAg降至19.35s/co，HBV DNA降至1.25×103拷贝/ml。症状消失，病情稳定。2003年3月化学检验示ALT正常，HBeAg 8.05s/co，HBV DNA 2.25×103拷贝/ml。病例2，女，58岁，HBsAg（+）多年，ALT 98U/L，白蛋白（Alb）34g/L，胆碱脂酶（CHE）3700U/L，凝血酶原活动度（PTA）62%，末梢血白细胞（WBC）、血小板（BPC）均减少，胃镜提示食道下段静脉轻度曲张，HBV复制指标阳性，诊断为肝炎肝硬化代偿期。2001年1月开始服用拉米夫定，用药3个月ALT恢复正常，HBV DNA阴转。用药11个月出现HBeAg血清转换，但ALT上升达218U/L，HBV DNA为4.25×107拷贝/ml。先后加用单磷酸阿糖腺苷（Ara-Amp）、胸腺肽、苦参素、甘草甜素等药物，疗效欠佳，乏力、腹胀等症状明显，ALT持续在100～200U/L之间， CHE降至1465U/L，PTA 55%，HBeAg始终(-)，HBV DNA在105～107拷贝/ml，YMDD检测（+），伴有野毒株感染。于2002年9月住院治疗，未停用拉米夫定，加用大剂量的复方甘草甜素（160mg/d）抑制肝细胞炎症，α1－胸腺素调节免疫功能，患者应答较好，肝功能好转。用药3个月时ALT、天门冬氨酸氨基转移酶（AST）均正常，CHE升至4056U/L，PTA 68.8%，HBV DNA降至3.2×103拷贝/ml。复方甘草甜素逐渐减量至停药，病情无反复。出院后2个月复查ALT、AST均正常，CHE 5365U/L ，ALB 39.8g/L，PTA 81.7%，HBeAg（－），HBV DNA 3.19×103拷贝/ml。病例3，男，44岁，发现HBV表原抗原（HBsAg）（+）、肝功能异常7年。诊断为慢性乙型肝炎早期肝硬化。1999年初开始应用拉米夫定，早期疗效较好，HBV DNA阴转，HBeAg处于低水平。用药近2年，出现ALT升高，轻度黄疸，检测YMDD变异（+），停药后1.5个月病情恶化，总胆红素（TBil）128μmol/L，Alb 27.6g/L，CHE 1482U/L，PTA 34.2%，并出现腹水，腹腔感染，HBV DNA转阳（1.56×107拷贝/ml），HBeAg 227.2s/co，于2001年3月和11月先后2次住院，加用磷甲酸钠、苦参素、甘草甜素等治疗，病毒持续高水平复制，肝脏功能失代偿，黄疸不退，反复出现胸、腹水和感染，诊断为慢性重型肝炎。停用拉米夫定7个月时复查YMDD变异（-），由于其他药物无法控制病情，于2002年1月再用拉米夫定，用药2个月HBV DNA阴转，肝脏失代偿情况好转。用药1年后复查肝功能ALT 23U/L，TBil 45.9μmol/L，Alb 45.9g/L，CHE 3030U/L，HBeAg 1.66s/co，抗-HBe（＋），HBV DNA（－）。 2．讨论：3例慢性HBV感染者肝病程度不同，用药11个月～27个月出现YMDD变异，由于肝脏代偿功能及处理方法不同，所导致的结果也不同：（1）对于普通的慢性乙型肝炎，肝脏代偿功能较好者，出现YMDD变异病情反复后，可停用拉米夫定，改用其他抗病毒治疗及有效的护肝治疗，以干扰素和甘草甜素类药物较理想。停用拉米夫定4～6个月后，YMDD变异可能消失，再用拉米夫定治疗仍有效。（2）对于活动性肝硬化患者，如肝脏尚有部分代偿功能，无黄疸及并发症，可停药观察，应用Ara-Amp或磷甲酸钠等抗病毒药物抑制野毒株复制，加大甘草甜素剂量，减轻肝细胞炎症。如有YMDD变异株和野毒株并存，建议不停用拉米夫定，可加大甘草甜素的剂量，如能应用α1－胸腺素可促进病情缓解。（3）对于肝脏代偿功能差的患者，出现YMDD变异后不能轻易停用拉米夫定，以免造成停药后野毒株复制所致的肝脏炎症加重。加用免疫调节剂（胸腺肽和α1－胸腺素）、其他抗病毒药物（磷甲酸钠、Ara-Amp、苦参素等）及甘草甜素类药物，或者用恩替卡韦替代拉米夫定（恩替卡韦可能对拉米夫定耐药者有效）。（4）鉴于拉米夫定停药及YMDD变异后处理困难，因此要严格掌握用药的适应证。

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乙型肝炎病毒P 基因YMDD变异的意义

王平忠, 张 岩, 白雪帆, 张 颖, 李谨革, 陈红梅, 王九平


Significance of the YMDD motif mutation of P gene of hepatitis B virus

Abstract
AIM: To determine significance of the YMDD motif mutation of P gene of hepatitis B virus during lamivudine therapy for chronic hepatitis B and to provide guideline for the clinical treatment.

METHODS: Dynamic change of HBV DNA quantitation was measured with fluorescence quantitative PCR during lamivudine treatment. 40 patients from chronic hepatitis B were treated with lamivudine for 48 weeks. In 17 patients HBV DNA remained to be positive, YMDD mutation were examined by GeneChip and Uniarray techniques.

RESULTS: In patients treated with lamivudine for 48 weeks, HBV DNA turned negative in 23 cases (57.5%). In 17 patients HBV DNA remained to be positive, there was HBV DNA rebound in 8 patients during lamivudine treatment. There were YMDD mutations in 7 cases (5 cases from patients of HBV DNA rebound).The rate of YMDD mutation was 17.5% (7/40).

CONCLUSION: During lamivudine treatment, HBV YMDD in some patients can mutate. The HBV DNA rebound is associated with emergence of YMDD mutants. Detection of the YMDD motif mutation in P gene of hepatitis B virus is important to clinical treatment for chronic hepatitis B.

Wang PZ, Zhang Y, Bai XF, Zhang Y, Li JG, Chen HM, Wang JP. Significance of the YMDD motif mutation of P gene of hepatitis B virus.Shijie Huaren Xiaohua Zazhi 2004;12(3):600-603

摘要
目的: 了解拉米夫定治疗慢性乙型肝炎过程中HBV P基因YMDD变异的意义，为临床治疗提供指导.

方法: 用定量PCR监测40例拉米夫定治疗期间的HBV DNA动态变化，对治疗48 wk时HBV DNA仍为阳性的患者，采用Uniarray技术和基因芯片检测YMDD突变.

结果: 拉米夫定治疗48 wk时，HBV DNA转阴者23例(57.5%). HBV DNA仍为阳性者17例，其中8例在治疗过程中出现HBV DNA定量反跳. 用基因芯片法与Uniarray技术共检测出7例YMDD变异(5例出现于8例HBV DNA定量反跳者)，变异率为17.5%(7/40).

结论: 拉米夫定治疗过程中，可导致部分患者的HBV YMDD发生变异. 该变异使多数患者HBV DNA定量反跳 . 检测HBV YMDD变异对慢性乙型肝炎的治疗具有重要的指导意义.

0 引言
拉米夫定(lamivudine)是核苷类的抗乙型肝炎病毒(HBV)的新药，是HBV复制强有力的抑制剂，其作用靶为HBV DNA多聚酶，通过抑制前基因组RNA逆转录为负链DNA及DNA链延伸过程中起到链终止作用来抑制HBV复制. 拉米夫定用于治疗慢性乙型肝炎已有较明确的疗效，但由于其难以完全清除体内病毒，尤其是对cccDNA无直接作用，故需要长期用药以期耗竭cccDNA库来达到清除HBV的目的. 但长期用药可引起HBV DNA多聚酶活性区核苷酸序列的变异，称为YMDD变异. 国内学者报道YMDD变异发生率第1 a和第2 a分别为14%和49%[1]，变异后的HBV对拉米夫定的敏感性下降，从而导致治疗失败[2-4]. 因此，检测YMDD基序变异对及时调整治疗方案、合理用药及提高疗效具有重要的指导意义[5]. 为更好地监测慢性乙型肝炎患者应用拉米夫定治疗过程中耐药性的产生，我们用定量PCR监测了40例拉米夫定治疗期间的HBV DNA动态变化，对治疗48 wk时HBV DNA仍为阳性的患者，用基因芯片和Uniarray技术检测YMDD突变.

1 材料和方法
1.1 材料 本院1999-12/2000-11住院和门诊患者血清标本40例，男28例，女12例. 年龄15-68(平均36.7岁). 临床诊断符合2000-09西安会议《病毒性肝炎防治方案》标准. 入选患者HBsAg，HBeAg阳性; 抗HIV，抗-HDV，抗-HCV阴性(华美公司试剂). HBV DNA斑点杂交阳性(上海医科大学预防医学研究所生产的试剂盒测定)，且HBV DNA定量均大于109拷贝/L(荧光定量PCR法). 所有患者口服拉米夫定100 mg/d，疗程48 wk. 于治疗前及治疗24 wk、36 wk和48 wk时采集外周血，分离血清，-20 °C保存，统一检测. HBV DNA定量试剂由中山医科大学达安基因诊断中心提供. Uniarray技术检测试剂为上海基达基因技术有限公司生产的UniArrayTM HBV拉米夫定耐药检测试剂盒. 所用仪器为GeneAmp 5700 Sequence Detection System (applied biosystem 公司)荧光PCR扩增仪. HBV YMDD检测芯片由联合基因集团上海博华基因芯片技术有限公司制备. 图片扫描仪为ScanArray 300 (美国).
1.2 方法 (1)HBV DNA定量 采用荧光定量PCR法. 按说明书进行操作. (2)Uniarray技术 主要步骤如下: 取待测血清、质控品I(内参照阳性、YIDD阳性、YVDD阴性)和质控品V(内参照阳性、YVDD阳性、YIDD阴性)各50 mL，分别加入DNA提取液A50 mL，振荡混匀，12 000 r/min离心10 min，弃上清. 再加入DNA提取液B 50 mL，振荡混匀，100 °C水浴10 min，12 000 r/min离心2 min，取上清5 mL进行PCR扩增. 扩增 PCR反应体系为50 mL，包括PCR缓冲液31 mL，MgCl2 6 mL，Taq酶3 mL，荧光探针5 mL，待检DNA样品5 mL. 将各反应管按一定顺序放入PE Gene Amp 5700荧光PCR扩增仪上，先50 °C保温2 min，再94 °C变性5 min，然后94 °C 20 s，61 °C 40 s，40个循环. 结果以YIDD或YVDD引物孔的Ct值与内参照引物孔的Ct值 (基准值)之差 (∆Ct)的大小作为突变是否发生的依据. 若∆Ct小于或等于3，则为YMDD变异; 若∆Ct 大于3，则为YMDD野生型. (3)基因芯片测定方法 HBV YMDD (拉米夫定耐药基因) 检测芯片选定HBV P基因的保守区序列，并设计了相关的引物，扩增出包含有YMDD变异区的核苷酸片断，针对L528M，A548V，M552I及M552V 4个位点设计探针，将探针固定在经过特殊处理的玻片上，并且与特定的PCR法标记扩增的片断杂交. 经过洗脱后，在微排列扫描仪上扫描，用专门的软件分析确定耐药的类型. 取待检测血清10 mL，采用常规酚、氯仿、异戊醇方法抽提HBV DNA，异丙醇沉淀; 取5 mL用于PCR扩增，共35个循环; 再吸取PCR产物2 mL，加入CY5标记的dUTP，进行PCR标记，共35个循环. 标记的产物沉淀后加入杂交试剂，并与芯片分别于95 °C变性5 min，冷却后将杂交液10 mL滴于芯片的上样区，封闭后在湿盒内42 °C杂交1.5 h，然后用0.1碨SC洗涤10 min，双蒸水冲洗并避光晾干; 将杂交后的芯片插入ScanArray 300扫描仪(美国)中进行扫描，扫描强度55-60 %，获得的图片用GenArray-Check软件分析各点的信号状况，根据信号强度及比值作出判断结果(图1，表1).

2 结果
2.1 HBV DNA定量水平 治疗48 wk时，17例HBV DNA仍为阳性，对这17例患者治疗前及治疗24 wk、36 wk和48 wk的系列血清进行了HBV DNA定量检测. 结果发现，8例患者治疗过程中一度降低的HBV DNA水平又复升高(2例于36 wk升高，6例于48 wk升高)(表2).
2.2 Uniarray技术检测结果 用Uniarray技术测定40例拉米夫定治疗48 wk时HBV DNA仍为阳性的17例血清，3例为YVDD变异，4例为YIDD，其余10例全部为野生株(表3).
表略

2.3 基因芯片法检测结果 用基因芯片法测定治疗48 wk HBV DNA仍为阳性的17例患者血清，发现YMDD变异7例，9例为野生株(无变异)，1例为阴性. 在7例YMDD变异中，YVDD变异 3例，YIDD变异4例. 3例YVDD中，2例合并528突变(核苷酸C669→A，使氨基酸由亮氨酸528→蛋氨酸)，1例变异株和野生株同时存在(表3).

图1(PDF) YMDD变异的基因芯片扫描图.略

3 讨论
拉米夫定是HBV复制强有力的抑制剂，能够与HBV DNA多聚酶YMDD (酪氨酸-蛋氨酸-天冬氨酸-天冬氨酸) 基序特异性结合，从而起到抑制病毒复制的作用. 拉米夫定的临床试验结果表明，拉米夫定可明显抑制HBV的复制，进而达到控制炎症、稳定病情甚至阻止肝纤维化的进展. 但对肝细胞内cccDNA无直接作用，而且他所抑制的HBV DNA多聚酶的活性在停药后又回复到原来的水平. 因此其抑制病毒复制作用短暂，停药后易于复发，需要长期用药. 但随着用药时间的延长，在药物和人体免疫选择压力下，可能产生耐药. 体内外研究均已表明，拉米夫定耐药主要是由HBV P基因C区YMDD变异所引起. YMDD变异分为两种，一种是HBV P基因第550位氨基酸由蛋氨酸(methionine，M)突变为缬氨酸(valine，V)，此乃YVDD变异，同时伴有528位的突变(核苷酸A669→C，使氨基酸由亮氨酸528→蛋氨酸); 另一种是HBV P基因第550位氨基酸由M突变为异亮氨酸(isoleucine，I)，此乃YIDD变异. 这两种变异分别由HBV第739位碱基A→G和741位G→T突变所引起[6-7]. 一旦出现YMDD变异株，对拉米夫定不再敏感. 耐药可能会伴有HBV DNA定量反跳和肝功能变化，甚至导致病情恶化. de Man et al [8]报道了1例肝移植术后HBV感染者，乙型肝炎免疫球蛋白治疗导致HBsAg逃避变异株，用泛昔洛韦治疗(500 mg 3次/d) 6 mo无效，P基因测序发现第513位氨基酸有异亮氨酸→亮氨酸的突变，改用拉米夫定100 mg 1次/d，HBV DNA水平骤降，但拉米夫定治疗12 mo后HBV DNA复升，且发生重症肝炎，最后死亡. 测序发现在YMDD区域附近有突变. 因此在出现YMDD变异株后要密切监视患者病情变化，包括肝脏功能、HBV DNA定量等. 如出现ALT明显升高，临床症状加重，则应停药. 新出现的一些核苷类似药物如阿的福韦，对YMDD变异株仍然有效，将来上市后可以作为治疗这种变异株的有效药物[9-10].
随着拉米夫定耐药株的出现，国内外研究者都在积极寻找检测他的有效方法. 目前对变异株的检测与分析多采用RT-PCR产物测序法、错配PCR-RFLP及PCR-ELISA等[11-13]. 这些方法存在着烦琐、费时、只能检测单个位点突变、不能提供全面的变异株情况等特点. 基因芯片技术是近年来发展起来的高效分子诊断技术，已广泛应用于药物筛选，基因表达谱测定，多态性分析，新基因鉴定，测序，临床检测等领域的研究[14-30]. 但该技术需专用仪器，不便推广使用. Uniarray技术是近年出现的又一检测YMDD变异的新技术，他是以UT-PCR (通用模板信号扩增技术)为基础的多基因/位点同时检测的阵列技术. UT-PCR是在Taqman荧光定量PCR基础上建立起来的新型PCR技术，主要是使用通用模板和通用荧光探针. 通用引物由5’端的通用模板(UT)序列和3’的特异引物序列构成，通用模板序列不与任何天然核酸序列相匹配，只能与通用荧光探针匹配. 通用荧光探针5’端标以荧光发射基团FAM标记，3’端以荧光淬灭基团TAMRA标记，由于距离相近，基团相互作用不产生荧光. 该技术将各个被测基因位点的特异性UT引物置于标明的反应容器中，如微型试管中，利用UT-PCR的通用条件优势，在同一热循环中扩增和检测. 他绕过了目前国际流行基因芯片技术需要大量的PCR预合成和核酸杂交等繁锁步骤，直接在阵列中进行成百上千个特异性的UT-PCR扩增检测反应，检测成本低，并且不需要特殊专用仪器. 能够快速准确地检测出HBV耐药突变中临床最常见YMDD变异，并且能够与现在主流荧光实时PCR仪配合. 因此UT-PCR和Uniarray的高灵敏、高特异、高精确度和高通量特点，在临床病原体检测、药效监测、突变分析以及相关科学研究领域中具有广阔的应用前景.
我们采用基因芯片法和Uniarray技术测定了40例拉米夫定治疗48 wk，HBV DNA仍为阳性的17例患者血清. 共检出7例YMDD变异，其中5例为HBV DNA定量反跳者. 提示YMDD变异与HBV DNA定量反跳密切有关，是HBV耐药的主要原因. 对8例HBV DNA定量反跳者治疗前、治疗24、36、48 wk的系列血清进行了DNA定量检测，发现24 wk时DNA定量均下降，36 wk时有2例反跳，48 wk时有6例反跳，但仍低于治疗前基线水平，可能与变异病毒复制能力降低有关. 基因芯片和Uniarray技术对YMDD变异检测结果基本相符. 但基因芯片能同时检测出多个点位的变异，而且能检测出野生株和变异株共存，即混合感染. 这种情况往往早于临床HBV DNA定量和肝功能的变化，因此可以及早发现患者的病情变化. 同时，如果检测结果由混合感染变为单一变异株或野生株，也有利于指导临床是否再继续使用拉米夫定或停药改用其他药物. 随着拉米夫定的广泛和长期应用，国内慢性乙肝患者中由此而引起HBV YMDD变异导致耐药、肝炎复发、以致发生病情恶化的问题会更引人关注. 因此，临床上迫切需要一种简便、高效、成本较低的方法，对应用拉米夫定治疗的患者进行动态监测，以指导临床合理用药. Uniarray检测技术的开发和应用，期望能够解决这一问题.

jackwen

1楼病例太少