肝星状细胞的增殖、活化及凋亡与肝纤维化

tonychant

前 言

肝纤维化（liver fibrosis）是肝脏内细胞外基质（extracelluar matrix, ECM）过度沉积性疾病，是各种慢性肝病共有的病理改变。肝纤维化的发生机制主要是肝内ECM合成与降解失衡，表现为ECM大量沉积，肝星状细胞（hepatic stellate cell, HSC）在此过程中起着关键性作用[1-2]。众多的研究表明，在肝纤维化恢复期，HSC的减少不是由于其表型从活化状态向静息状态转变，而是由于HSC凋亡的结果[3-5]。因此，许多学者在此方面深入研究，并取得了令人鼓舞的成就。
一、HSC的增殖、活化
（一）HSC的一般特性
HSC，又称为储脂细胞（fat-sroring cell, FSCs）、Ito细胞、窦周脂肪细胞（persinusoidal lipocyte）、储存维生素A细胞（Vitamin A-storing cells）及肝脏特异性周皮细胞（liver-specific pericytes）等，是肝脏的一种非实质细胞。该细胞位于肝血窦内皮细胞与肝细胞之间，较长的细胞突触包绕肝窦，呈星状，大小介于肝细胞与Kupffer细胞之间，胞质内富含类维生素A脂滴。在正常情况下，HSC约占肝细胞总数的13%，非实质细胞的三分之一。HSC是肝间质细胞中兼有肌细胞、成纤维细胞及脂肪细胞性质的一种细胞，其主要生理功能为摄取并储存维生素A。
（二）HSC的活化特征
肝纤维化过程中，HSC获得了改变的表现型被称为活化。HSC活化以维生素A脂滴减少或消失，粗面内质网增加、高尔基体发达、细胞增大、突触伸长、向肌成纤维样细胞转化、表达α-平滑肌肌动蛋白（α-smooth muscle actin, α-SMA）、增殖明显、合成大量ECM等为特征[6]。
目前已发现HSC活化的标志有许多：结蛋白（desmin），α-SMA，神经胶质原纤维的酸蛋白（glid fibrillary acidic protein, GFAP），神经细胞黏附分子（N-CAM），突触素（synaptophysin），Neurdrophin（NGF，BDNF，NF-3，NF-4）及其受体（TrK-B，TrK-C，P75）和α-B-crystallin（ABCRYS）等。Trim等[7]研究发现，活化的HSC表达P75，而静止的HSC不表达P75；并认为P75，肿瘤坏死因子（tumor necrosis factor，TNF）受体超家族的一个成员，可作为标志活化HSC的一个良好指标。因这些蛋白中有些是神经标志，故推测HSC可能来源于神经嵴[7]。血小板衍化生长因子受体β（platelet-derived growth factor receptor β，PDGFR-β）也可作为活化HSC的指标[8]。但是活化HSC的功能依培养条件的不同及活化诱因的不同而表现多样化，活化只是一个总称，有时还难以充分表达出细胞的功能[9]。
（三）HSC活化的影响因素
1、HSC活化的细胞学基础
旁分泌和自分泌刺激对HSC的活化起着重要作用。其中Kupffer细胞的旁分泌作用尤为显著，可能与其产生的细胞因子（如TNF-α、TGF-β1、PDGF、TGF-α、IL-1等）及氧自由基或增加HSC的细胞因子受体有关。肝实质细胞也可产生各种HSC刺激因子（如成纤维细胞因子、TGF-α、IGF-1、TNF-α、IL-1、IL-6、过氧化脂质等）。肝细胞产生的这些细胞因子可能与Kupffer细胞产生的因子一起发挥作用[10]。肝窦内皮细胞产生的一系列纤维连接素（fibronectin, FN）可活化HSC，还具有活化潜在TGF-β的能力[11]。与此同时，活化HSC的自分泌细胞因子及介质而自身活化。此外，肝损伤时聚集的血小板、淋巴细胞、肥大细胞等释放细胞因子，活化HSC。肝癌细胞可以诱导离体HSC活化[12]。
2、ECM成分的改变活化HSC
当ECM构成发生改变（富含Ⅰ、Ⅲ型胶原）时，HSC也开始活化；另一方面，当ECM合成量增加时，一些无活性的细胞因子与某些ECM结合后，可具有生物学活性（如TGF-β与FN结合，TNF-α、PDGF与Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ型胶原结合），进一步活化HSC。当Disse腔内基底膜样基质成分破坏，导致HSC活化增殖条件的产生。Ⅳ型胶原酶破坏正常ECM（如肝血窦的基底膜）而激活窦周细胞（主要是HSC），启动和进一步促进肝纤维化的发生[13]。HSC可表达以胶原、FN等物质为配体的多配体（蛋白）聚糖，这是一种含有硫酸软骨素和硫酸乙酰肝素侧链，有跨膜结构的蛋白多糖，因而当ECM增多时，就可活化HSC。肝窦内皮细胞就可通过产生多量FN改变基质环境而活化HSC。因此，ECM不仅在结构上把各种细胞连成一个整体，而且还参与细胞功能的调节。
3、细胞因子调节活化HSC
细胞因子如PDGF、TGF-β1、TGF-α、胰岛素样生长因子（insulin-like growth factor, IGF）、TNF-α、表皮生长因子（epidermal growth factor，EGF）、纤维生长因子（fibrogrowth factor, FGF）、内皮素（endothelin-1，ET-1）、IL-6、IL-1等与相应的特异性受体结合后，激活HSC。PDGF是首先从血小板中分离到的，Mr（相对分子量）为3×104，由A、B两条链通过二硫键相连形成三种形式的二聚体。PDGF已被证明是HSC增殖和移动的主要刺激物，是HSC最强的有丝分裂原。在PDGF的3种二聚体亚型（-AA、-AB和-BB）中，PDGF-BB在刺激HSC和相关细胞间信号传递方面更为重要，因为PDGF受体的β亚单位只在激活的HSC中表达，而静止期的HSC不表达[14]。PDGF受体含有内在的酪氨酸激酶活性和二聚体活性，并在酪氨酸残端向上粘接配体（PDGF）时，自动磷酸化，激活下游信号系统。TGF-β1是强有力的致纤维化细胞因子。HSC可自分泌生成TGFβ1，且HSC活化后，这一功能可被上调；同时，HSC也开始表达活化的TGFβ1Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型受体。TGFβ受体Ⅰ被激活后导致胶原合成增加，TGFβ受体Ⅱ被激活后则抑制HSC的增殖[15]，而Ⅲ型受体即系膜蛋白聚糖无信号传导功能。TGFβ具有“双面刀刃”作用，正常表达时能够抑制炎症反应，抑制细胞增殖；过度表达时却可导致一些病理改变，如组织器官纤维化。结缔组织生长因子（connect tissue growth factor, CTGF）只介导了TGF-β的负面效应，其正面效应由非CTGF途径介导[16]。胰岛素和IGF-1可以促进HSC的有丝分裂和胶原合成，也可促进成纤维细胞和平滑肌细胞的增殖，且在刺激HSC增殖中呈剂量依赖效应[17]。内皮素受体在HSC激活早期以A型占优势，促进HSC的激活；B型则在激活后期占优势，抑制HSC的增殖[15]。
4、HSC活化的细胞内信号转导及变化
各种细胞因子、ECM成分及过氧化产物等与相应HSC膜受体结合后，激活一系列细胞内信号传递结构和分子，最终导致基因表达的变化。近年在促分裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase, MAPK），磷酯酰肌醇-3-激酶（phosphatidylinositol 3-kinase, P-3-K），Smad家族，灶性黏附激酶及蛋白激酶C等方面都有可喜的进展。PDGF受体有SH-2结构域（Src-homology-2 domain）和/或磷酸酪氨酸（phosphotyrosine-binding, PTB）结合域，与效应蛋白的Grb2（growth factor receptor bound）结合后，导致交换因子mSOS聚集，激活Ras继而使Raf-1、MAPK的激酶MEK（MAPK kinase）和细胞外信号调节的激酶（extracellular signal regulated kinase, ERK）依次激活，在转录因子Elk-1和SAP磷酸化作用下，ERK转位至胞核，使C-fos表达增加，启动HSC的增殖[18]。胞内PDGF信号转导的另一通路，PDGF与受体结合后使PI3-K聚集，其酪氨酸磷酸化，从而促进HSC增殖及趋化。PDGF受体与非受体酪氨酸激酶，特别与灶性黏附激酶起作用。多种受体系统与整合素协同调节细胞增殖、细胞的活动和信号蛋白的活化。细胞外Ca2+经T型通道内流，Na+/H+交换泵对细胞内PH的调节亦是PDGF作用通道的必要环节[19]。
TGF-β与其受体粘接，导致受体激酶的活化和随后Smad2和Smad3的磷酸化，磷酸化的Smad蛋白质再与公共介导物Smad4结合，转入细胞核，调节TGF-β应答基因的转录。Smad蛋白是能促进细胞增殖的TGFβ受体唯一的底物[20]。其他途径包括TGFβ活化激酶1（TGFβ-activated kinase 1, TAK-1）和MAPK家族的ERK，C-Jun氨基末端蛋白激酶（c-Jun N-terminal kinase, JNK）和P38，它们依次磷酸化并活化转录因子[20]。
体内研究表明，HSC激活时可伴有κ基因结合核因子（nuclear factor-κ-gene-binding, NF-κB）等转录因子的激活及C-myb基因表达的增强，而C-myb蛋白可结合于α-SMA基因调控区，故NF-κB及C-myb在HSC激活过程中有重要作用[18]。在肝病患者，可见HSC内有调节细胞增殖分化的C-myc的表达，提示C-myc与HSC的活化增殖有关。
HSC激活时，细胞内视黄醇类如视黄酸（retinoic acid, RA）的含量下降，同时细胞液视黄醇结合蛋白（cellular retinol binding protein ,CRBP）、视黄醇类核内受体RAR（retinoic acid recephr）及RXR（retinoid X receptor）mRNA水平也降低。研究表明，RXRα（RA的一个重要受体，其配体是9-cis-RA）与9-cis-RA的相互作用在HSC的增殖中起重要调节的作用，可维持HSC于静止状态[21]。
在肝损伤过程中，脂质过氧化具有重要意义。脂质过氧化反应产物可以激活Kupffer细胞，也可引起肝细胞坏死释放氧自由基进而激活HSC，还可直接激活HSC的C-myb、NF-κB通路使之活化。
综上所述，肝损伤过程中，细胞与细胞间（激活的Kupffer细胞、损伤的肝细胞、内皮细胞、血小板等与HSC之间），基质与HSC间存在多种细胞因子及非肽类介质如活性氧、二十烷、乙醛等构成复杂的调节网络激活HSC[22]。
（四）HSC活化的意义
1、生成ECM
活化的HSC可分泌Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ型胶原，层粘蛋白（laminin, LN）、纤维连接素（fibronectin, FN）、透明质酸（hyaluronic acid, HA）等多种ECM成分，是ECM生成的主要来源。肝纤维化是一种对坏死脱落的肝组织进行修复的代偿反应。HSC活化产生ECM，用以修补缺损空间，并最后导致肝纤维化。
2、生成MMPs及TIMPs，调节基质的降解
活化HSC是MMPs及TIMPs的主要来源细胞。在肝纤维化过程中，MMPs的量及活性并不降低，而是由于TIMPs的抑制使MMPs不能发挥降解基质作用，导致ECM沉积过度。HSC分泌基质降解素及明胶酶，降解基底膜，破坏肝血窦；与此同时，肝血窦内皮细胞的形态也发生变化，窗孔消失，导致肝窦毛细血管化。
3、参与炎症趋化作用
活化的HSC生成细胞间黏附分子1（intercellular adhesion molecule 1, ICAM-1），吸引淋巴细胞到达HSC增生区域，加剧损伤处的炎症反应，并介导HSC与基质的黏附[23]。活化HSC还可生成单核细胞趋化蛋白（MCP-1）、IL-10等炎症调节因子。
4、肝窦微循环调节
HSC收缩与ET和P物质等收缩因子有关，其舒张则与NO、PGE2等舒张因子有关。ET1通过活化HSC收缩调节肝脏血流。肝窦内及纤维间隔内HSC的收缩引起门脉压力的升高是导致门静脉高压形成的主要原因。
二、HSC的凋亡
（一）HSC凋亡的发生
HSC在肝纤维化的逆转中起着重要作用。以往认为纤维化的逆转是由于HSC从活化状态转为静止状态，但随着研究的深入，现已基本明确，肝纤维化的恢复期，活化HSC的减少是由于活化HSC凋亡的结果。Saile等[24]首先发现，在大鼠肝损伤的修复期，活化的HSC发生自发性凋亡。Iredale等[3]在大鼠CCl4肝纤维化模型中也证实，在肝纤维化恢复期纤维间隔及其邻近区域（HSC分布区域），TUNEL阳性细胞（即凋亡细胞）只发生于α-SMA阳性的细胞中，说明只有激活的HSC才发生凋亡。他们首次提出，活化HSC通过凋亡减少，而不是细胞表型的转化。随后的许多实验，从体外细胞培养到体内动物模型及临床实验，均支持上述结论[5,7,25,26]。
（二）HSC凋亡机制的研究
1、Fas/FasL系统（CD95/CD95L系统）
凋亡主要是经Fas/FasL通路启动，在激活后Fas/FasL表达增加，bcl-2和bcl-xl的表达下降及P53基因的上调共同促进HSC凋亡。HSC可表达Fas和FasL，且自分泌FasL导致活化HSC凋亡。Saile等[24]报道，HSC活化过程中Fas/FasL表达增多，用拮抗性抗Fas抗体可完全阻断该凋亡过程；但活化的HCS对Fas诱导的凋亡敏感性降低，且抗凋亡蛋白bcl-2上调。而Gong等[4]实验表明，在HSC活化过程中Fas表达无差异，HSC与活化而成的肌成纤维样细胞（myofibroblast-like cell, MFB）对sFasL诱导的凋亡的不同表达是由于两者bcl基因家族的表达不同。静止的HSC中抗凋亡的原癌基因bcl-2及bcl-xl明显高于活化后，因而对sFasL的诱导无应答；而MFB中的bcl-2和bcl-xl下降，虽然其促凋亡的bax基因在mRNA水平与静止期相近，但在蛋白质水平却增高，使bcl-2、bcl-xl/bax比值下降，促进凋亡的发生。Saile等[27]在随后的实验中发现，在HSC培养活化过程中，bcl-2、bax（促凋亡因子）、NF-κB、P53基因表达自发上调，bcl-xl和P21WAF1（抗凋亡因子）基因表达下调，而IκB保持不变。说明HSC的自发凋亡是众多凋亡调节因子相互作用的结果。
Caspase-3（胱门蛋白酶，也叫半胱氨酸蛋白酶P32）是凋亡途径的一个关键性的蛋白酶，Fas结合FasL活化caspase后可促进细胞凋亡[28]。
2、转录因子
在各种转录因子中，对NF-κB的研究最为深入。细胞核因子κB（NF-κB）最初被认为是一种具有B细胞特异性，可与免疫球蛋白的κ轻链基因增强子上序列（GGGACTTTCC）结合的真核细胞转录因子[29]。NF-κB几乎存在于机体所有的细胞中，但与其他的转录激活因子不同，NF-κB存在于胞质中，且活化后必须移位至细胞核方能发挥其转录激活作用。无活性的NF-κB在胞质中与其抑制蛋白的IκB形成复合物，当被来源于胞外的信号所激活时，两者分离，NF-κB转位至细胞核，与目的基因的κB结合序列结合后发挥转录激活作用。众多研究表明，核因子NF-κB能抑制多种类型的细胞凋亡，这种作用被认为可能通过一系列与凋亡蛋白酶相作用的抗凋亡蛋白（IEX-1L、TRAF1，TRAF2）及凋亡抑制蛋白（c-IAP1，c-IAP2）来实现[29]。静止的HSC核内无NF-κB，而活化的HSC核内则出现NF-κB的核转录活性。
TIMP-1通过抑制MMPs活性而使ECM沉积多于降解，促进肝纤维化发展。最近对TIMP-1有了新认识，TIMP-1被认为是多功能的蛋白质，除了抑制ECM的降解，TIMP-1可刺激类固醇生成、抑制血管形成及改变细胞的形态[30]。TIMP-1在调控某些细胞的凋亡之中起着重要作用。TIMP-1被证实可抑制B淋巴细胞和乳腺上皮细胞的凋亡，而此作用同TIMP-1与细胞基质的相互作用无关[31]。Yoshiji等[30]指出，在肝脏的微环境中，高TIMP-1活性可能会抑制活化HSC的凋亡。随后的研究都证实TIMP-1能抑制活化HSC的凋亡[27,30]。TIMP-1（而不是TIMP-2）能进入许多类型细胞的核内，TIMP-1易位于细胞核内说明TIMP-1起着转录因子的作用，且TIMP-1高水平长期存在于核内可能会改变HSC的表型，维持HSC于活化状态[27]。
3、细胞因子的作用
由于被研究的细胞种类的不同，TGF-β和TNF-α对细胞凋亡的调节也不同：可促进或抑制凋亡，也可表现为对细胞凋亡无影响[33]。Lang等[34]实验表明，TNF-α通过抑制NFκB对HSC产生凋亡诱导作用，并与其活化状态有关。Issa等[5]证实，1ng/ml及10ng/ml TGF-β1均可使全肝HSC的DNA总量减少30%，提示TGFβ1可提高HSC的凋亡率。而Sail等[28]研究发现，TNF-α、TGF-β通过降低CD95L基因表达并上调抗凋亡因子NFκB、bcl-xl和P21WAF1以及下调P53而抑制凋亡，维持HSC于活化状态。Saile等[33]在另外的实验中亦发现，TGF-β和TNF-α对培养的活化HSC的增殖和凋亡均有抑制作用，两者的调控相互联系，此现象可为慢性肝损伤体内活化HSC的长期存活提供合理的解释。总之，在肝纤维化形成机制中，TNF-α和TGF-β对HSC的影响是多方面的，也是非常复杂的，有促进肝纤维化形成的一面如抑制HSC凋亡、延长HSC活化和促进HSC释放细胞黏附分子，也有抑制肝纤维化形成的一面如抑制HSC增殖、抑制胶原合成和促进HSC释放MMPs等。
在肝纤维化患者和大鼠体内，活化HSC均可表达低亲和力神经生长因子受体（low affinity nerve growth factor receptor, NGFR）P75，而静止的HSC不表达P75，且伴随HSC活化，P75水平升高[7]。新近的研究表明，P75能调节细胞生存或死亡，其作用依赖于是否和酪氨酸激酶A（Trk-A）共同表达：当P75单独表达时，它与配体结合可致细胞凋亡；而与Trk-A共同表达时，凋亡抑制细胞存活。当活化的HSC与100ng/ml NGF共育24小时后，凋亡率明显高于对照组（P<0.05），提示NGF可促进活化HSC的凋亡[7]。
其他一些细胞因子如ET、PDGF、TGF、IL-6、IL-15等，对HSC的凋亡也有调节作用[4]。Issa等[5]研究发表，IGF-1可抑制HSC凋亡，TGF-β1促进HSC凋亡，而PDGF对HSC凋亡无影响，但可促进HSC增殖。
此外，尤红等[35]研究发现，正常大鼠原代肝细胞与HSC共同培养时，正常增殖的肝细胞具有促进活化HSC凋亡的作用。
（三）HSC凋亡后的改变
活化HSC的减少并非由坏死引起，在肝纤维化的恢复期，纤维间隔及其邻近区域并没有坏死及炎症的证据[5]，亦非由于HSC表型的转化，而是由于活化HSC凋亡的结果。在肝纤维化的恢复阶段，TIMP-1、TIMP-2的下降是由于活化HSC的数目减少所致[3,30]，从而使MMPs的活性恢复，ECM降解多于沉积。因HSC的活化是肝纤维化的中心环节，随着活化HSC的凋亡，与活化HSC相关的系列事件也将改善，肝纤维化由此而渐趋向恢复。深入研究其机制，为肝纤维化的治疗提供新的方向。
三、与HSC增殖活化、凋亡有关的治疗
Benedetti等[19]研究发现，氨氯吡咪（amiloride）可抑制HSC增殖活化，减少胶原的合成、沉积，且由于其毒副作用小，在慢性肝病肝纤维化和肝硬化的治疗中有可喜的前景。Wang等[8]实验表明，夫马菌素（烟曲霉素，fumagillin）的半合成类似物TNP-470通过阻断细胞周期由G1期向S期的转变而抑制HSC的增殖活化，并可能协同其抗血管生成效应，从而阻止肝纤维化的进展。已酮可可碱能抑制C-myb和NF-κB的活化，从而抑制HSC的激活，抑制HSC对多种致纤维生成因子、生长因子的反应以及过氧化级联反应[36]。维生素E及丁羟甲苯通过抑制C-myb和NF-κB而抑制HSC活化增殖及TIMP表达，治疗肝纤维化[37]。γ-干扰素（interferon γ，IFN-γ）可抑制HSC激活及ECM生成，但其作用是可逆性的。雌二醇可能通过诱导产生IFNγ及抑制脂质过氧化而阻止肝纤维化进展，其抗肝纤维化作用可能为慢性肝病中男性占优势的现象提供合理的依据[38]。HEO 077是一种脯氨酸4羟化酶抑制剂，可减少胶原合成并阻止HSC的活化[39]。视黄酸、视黄醇、多烯磷脂酰胆碱及血管紧张素转换酶抑制剂（ACEI）等都可抑制HSC的增殖活化。
Wright等[40]研究发现，曲霉菌素（胶原霉素，gliotoxin）通过促进活化HSC凋亡而使HSC减少，并减轻平均纤维间隔厚度，而对肝细胞无影响。Zhang等[28]实验表明，IH764-3可增强caspase-3蛋白表达，从而抑制HSC增殖，促进活化HSC凋亡。江涛等[41]研究证明，活血化瘀方剂可抑制大鼠肝纤维化模型中HSC的活化。Yao等[42]体外实验发现，乙肝冲剂（Yigan Decoction）显著抑制HSC增殖及促进HSC凋亡，并呈时间和剂量依赖性。丹参制剂可使活化HSC发生凋亡。尤红等[25,35,43]多次实验表明，复方861可降低NFκB表达，显著抑制HSC增殖，促进活化HSC凋亡，并呈时间和剂量依赖性；慢性乙型肝炎患者接受治疗6个月，其HSC数量明显减少。
四、HSC凋亡的意义及前景
随着对HSC凋亡研究的不断深入，现已基本明确HSC的活化是肝纤维化的决定因素，在肝纤维化的恢复中，活化HSC的减少是通过凋亡机制，而不是表型的转化。如何抑制HSC增殖活化，促进活化HSC凋亡，将对抗肝纤维化治疗带来美好的前景。但其活化和凋亡的许多方面有待进一步证实，如HSC活化的信号传导、HSC凋亡的启动因素、凋亡信号的传递途径、凋亡因子之间的相互作用及细胞因子网络在HSC活化和凋亡中的调控等。中药复方制剂以其多环节、多靶位作用的特点，在抗肝纤维化方面有着广阔的前景，但需要研究者规范操作，使中医药在这方面达到更高的水平。
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