骨髓干细胞和肝细胞移植

不死鸟

中华肝脏病杂志网络版2003网络论文·CJH-NET03032

骨髓干细胞和肝细胞移植

吴理茂 李连达

肝细胞移植经过近30年的发展，正由动物实验向临床过渡，初步结果显示，肝细胞移植在急慢性肝衰竭和遗传代谢性肝病方面具有很好的应用前景。最近有数篇文献报道，存在于骨髓中的干细胞，在体内外均能分化为功能完备的肝细胞。用骨髓干细胞替代成熟肝细胞进行移植治疗肝病，有望使细胞移植在肝病治疗方面取得重大突破。本文将就骨髓干细胞用于肝细胞移植的研究现状、应用前景进行综述。

一、肝细胞移植的细胞来源

细胞移植的前提是，充足有效的细胞来源。理论上用于肝细胞移植的细胞应满足如下要求：具有较强的增殖能力又没有肿瘤原性；能分化为功能完备的肝细胞；免疫原性没有或小；细胞体积小足以迅速穿过肝窦；细胞容易获得，符合医学伦理道德。目前完全满足以上条件的细胞尚在寻觅之中。

1.来源于同种异体肝细胞

目前最常用的移植细胞是同种异体成熟肝细胞，大量的基础研究已充分表明肝细胞移植用于多种急慢性肝病的治疗是完全可能的[1,2]。近年，肝细胞分离技术，如原位灌注胶原酶技术等的应用，获得纯度高、活性好的肝细胞已不是很难，这大大加快了肝细胞用于临床的步伐。目前少量临床实验已经获得了可喜的结果。肝细胞移植不仅可作为肝衰竭病人等待肝移植时的一种过渡治疗手段，而且对代谢性遗传疾病也有一定的益处。

获得大量有效的肝细胞是肝细胞移植面临最大的难题。一方面肝移植大夫不屑于和这种尚处于实验阶段的疗法分享极难获得的肝脏，肝细胞来源只可能是肝脏移植用剩的肝碎片。也不能使用异种肝细胞，异种肝细胞植入人体会有强烈的免疫排斥反应。另一方面，成熟肝细胞体外扩增和体内增殖均不理想，较难获得大量肝细胞。再加上免疫排斥反应，随着时间的推移，移植肝细胞逐渐减少。如不能解决移植肝细胞增殖问题，肝细胞移植最多只能提供暂时功能支持。部分学者正探索用联合细胞移植（与胰岛细胞）、外源性细胞因子（如肝细胞生长因子）、转基因等方法，改善肝细胞增殖问题。

2.来源于基因改造的细胞系

为克服异体肝细胞移植面临的问题，最近有几个实验中心正在研究永生肝细胞系，作为移植肝细胞来源的可能性。给大鼠肝细胞转染不耐热猿病毒40大T（SV40 Large T）抗原基因，在33℃永生条件下大量增殖，在37～39℃停止增殖，为避免极少数细胞继续增殖，还可给转染基因加上一个侧翼序列(loxP)或者与疱疹病毒激酶基因，当细胞数量足够时，启动Cre重组酶基因或者用阿昔洛韦终止细胞增殖。既克服了肝细胞体外大量扩增问题，又克服了异体细胞转化为肿瘤的危险。他们将WB-F344细胞系移植入肝脏，观察到WB-F344细胞分化为功能肝细胞，实验已获得初步成功[3]。另外，对于肝细胞代谢缺陷的遗传性疾病，取自体肝细胞，转导正常基因后，再回输肝脏，也是一种非常有前途的治疗方法。但有待于基因转染技术的进一步完善。

3.来源于干细胞

近年研究表明不仅肝脏内存在肝干细胞，而且其它组织也存在肝干细胞如骨髓、胰腺等。如果用这些干细胞替代肝细胞用于移植，无疑可解决移植细胞在肝内增殖的问题。目前有许多研究者正在探索用胎肝细胞、胚胎干细胞、骨髓干细胞和胰腺干细胞等进行肝细胞移植。

肝干细胞相对于肝细胞而言，在移植时有几大优势：其一增殖能力明显好于肝细胞；另外可分化为肝细胞和胆管上皮细胞；还有其体积较小，易于进入肝板，融入肝实质。Grompe[4]和他的同事从肝组织中分离得到17μm左右的小肝细胞，体外有很强增殖能力，与肝细胞相比，移植入体内能更好恢复肝组织，纠正酪氨血症。另外又有人报道，从胰脏中分离得到干细胞移植入肝脏，能横向分化为正常肝细胞，大部分取代原来缺陷肝细胞，改善延胡索酰乙酰水解酶（fumarylaetoacetate hydrolase, FAH）缺陷小鼠的症状[5]。Dabeva[6]等将12～14天的大鼠胚胎肝细胞移植入大鼠肝脏，能增殖分化为肝索和胆管，6个月后移植细胞可达总肝细胞的10%。最近陆续有报道，用悬滴培养的方法，体外成功诱导小鼠胚胎干细胞分化为肝细胞，移植到体内能分化为功能肝细胞，但是有发生畸胎瘤的危险[7,8]。

评价这些干细胞优缺点应包括以下几个方面：先决条件是具备向功能完备肝细胞分化的多能性或专能性；来源是否充足，最好是自体来源，可避免免疫排斥反应；可在体外大量扩增而维持不分化状态；不违背医学伦理。从现有文献来看，骨髓干细胞基本上可满足这些条件。

二、骨髓干细胞横向分化为肝细胞的基础研究

1999年以来许多研究证实，人类和啮齿类动物的骨髓细胞可分化为多种细胞类型，包括骨骼肌细胞、心肌细胞、神经细胞和肝细胞等，这些骨髓干细胞的可塑性研究，为移植肝细胞提供了新的供体来源。Petersen[9]等1999年首先报道，用2-AFF(2-acetylaminofluorene)阻断大鼠肝细胞增殖，CCl4造成肝损伤，进行性别交叉骨髓细胞移植，或者全肝移植，在肝脏中追踪到来源于骨髓的肝细胞。随后Theise[10]等的小鼠全骨髓细胞移植研究表明，在无明显肝损伤的情况下，移植的骨髓细胞可进入肝板，分化为成熟的肝细胞，但骨髓来源的肝细胞较少（小于1%）。接着Alison[11]在接受性别交叉骨髓移植病人的肝脏中也检测到骨髓来源的肝细胞。随后Theise[12]在性别交叉的骨髓移植和原位肝移植研究中证实骨髓细胞进入肝实质分化为肝细胞，进入门静脉区分化为胆管细胞，增殖程度和肝损伤程度密切相关。Lagasse[13]等在FAH缺陷大鼠模型中证实，纯化造血干细胞能在肝脏内分化为功能完备的肝细胞，改善FAH缺陷大鼠的症状，只要50个干细胞就能达到很好的效果。Avital[14]等应用免疫磁珠筛选技术，从大鼠和人的骨髓中获得β2m-(beta-2 microglobulin)/Thy+细胞，在体内外均可分化为功能肝细胞，认为这种细胞可能是骨髓中的肝干细胞。最近Verfaillie[15,16]的实验室也报道，从大鼠、小鼠和人的骨髓中分离得到多能成年祖母细胞(multipotent adult progenitor cells, MAPCs)，该细胞体外经FGF-4和HGF诱导可分化为功能肝细胞，此细胞能合成尿素、白蛋白、糖原，具细胞色素P450活性，能吸附α-低密度脂蛋白。将这一亚群细胞移植至肝脏，用绿色荧光蛋白和白蛋白双标技术，可证实其已经分化为功能完备的肝细胞，实验中没发现有肿瘤原性。总之，以上有力证实：骨髓中确实存在能分化为肝细胞的干细胞，直接将其移植到肝脏，在肝脏微环境调节下可分化为肝细胞；将骨髓干细胞做作为肝细胞移植的细胞来源有重要的临床意义。

三、肝细胞移植面临的问题和骨髓干细胞的优势

1.肝细胞较大，一般在30～50μm，容易形成细胞团块，难进入肝窦，移植时可引起门脉高压、肺栓塞等严重临床症状。

2.肝细胞增殖能力有限，大量扩增有一定难度。

3.肝细胞来源有限，只能从肝移植所剩组织碎片中获得。

4.同种异体肝细胞移植时，容易被血液中的免疫细胞破坏，引起较强的细胞免疫反应和较弱的体液免疫反应。相反骨髓干细胞只有5～15μm，增殖能力强，可从各地的骨髓库获得。如果用自体骨髓细胞移植可以完全克服免疫排斥问题；用导管介入技术将骨髓细胞输入肝脏，无需大手术；骨髓干细胞移植也适合慢性肝病的治疗。

骨髓干细胞用于肝细胞移植具有广阔的前景，但移植后细胞功能如何？是否达到完全意义上的转化尚需进一步研究。骨髓中存在两类干细胞，即造血干细胞和间充质干细胞，是哪一类分化为肝细胞？是否骨髓造血干细胞和间充质干细胞都含有分化为肝细胞的成分？还是分化为肝细胞的干细胞混杂在造血干细胞和间充质干细胞当中呢？Verfaillie认为该细胞亚群可能是骨髓间充质干细胞的一部分，Lagasse、Avital等认为是造血干细胞的一部分，这有待进一步研究。不管其来自哪一部分，总之，用骨髓干细胞治疗肝炎、肝硬化和肝癌等难治性肝病，不仅有利于病人造血和免疫功能的改善，而且能替换坏死和损失的肝细胞，将把肝病治疗引入一个全新的境界。

目前中药介入肝细胞移植的实验和临床研究尚未起步，中药要走向现代化，必须紧随现代科技发展，把握时代脉搏。本实验室正试图从以下几个方面探讨中药对骨髓干细胞和肝细胞移植的影响：⑴从保肝、护肝中药中开发诱导骨髓干细胞定向分化以及促进骨髓干细胞向损伤肝脏迁移的有效成分。⑵从活血祛瘀中探索改善肝脏微循环和优化肝细胞增殖环境的有效成分。⑶寻找影响肝细胞增殖相关细胞因子的中药。⑷中药与自体骨髓干细胞肝内移植配合应用协同增效的研究。

参 考 文 献

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【作者单位】100091 北京，中国中医研究院西苑医院基础室