慢性乙肝与HBV阳性肝癌患者树突状细胞表型和功能检测

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ISSN 1009-3079 CN 14-1260/R 世界华人消化杂志 2004年 8月15日;12(8):2008-2010 慢性乙肝与HBV阳性肝癌患者树突状细胞表型和功能检测 王 健, 苏安英, 柴锡庆, 门金娥, 田 珂, 张向阳, 郑海萍 -------------------------------------------------------------------------------- 王健, 苏安英, 柴锡庆, 门金娥, 田珂, 张向阳, 郑海萍, 河北工程学院教务处 河北省邯郸市 056038 河北省科技研究与发展计划项目资助, No. 00276168D 项目负责人: 王健, 056038, 河北省邯郸市, 河北工程学院教务处. 收稿日期: 2004-08-23 接受日期: 2004-09-24 摘要 目的: 探讨慢性HBV感染者与HBV阳性肝癌患者DC的表型和功能及其与免疫耐受的关系. 方法: 选择慢性HBV感染者25例、HBV阳性肝癌患者11例及正常人15名，从外周血中分离单个核细胞，用细胞贴壁法富集DC，流式细胞术测定DC HLAⅡ和共刺激分子的表达，同位素掺入法测定DC的抗原提呈能力，ELISA方法测定抗原提呈过程中Th1和Th2类细胞因子的水平. 结果: 慢性HBV感染者与HBV阳性肝癌患者HLAⅡ和共刺激分子的表达水平、抗原提呈能力和Th1类细胞因子的水平均低于正常(P <0.05)其中肝癌患者尤为明显，而Th2类细胞因子的水平与正常相似(P >0.05). 结论: 慢性HBV感染与HBV阳性肝癌患者免疫耐受与DC的缺陷有关. 王健, 苏安英, 柴锡庆, 门金娥, 田珂, 张向阳, 郑海萍. 慢性乙肝与HBV阳性肝癌患者树突状细胞表型和功能检测. 世界华人消化杂志 2004;12(8):2008-2010 http://www.wjgnet.com/1009-3079/12/2008.asp 0 引言 乙肝病毒(hepatitis B virus，HBV)是一种非细胞病变病毒，但可诱发慢性肝炎、肝硬化和肝癌. 病毒和宿主的免疫反应在慢性HBV感染和肝癌发生的过程中起关键作用. 树突状细胞(dendritic cells，DC)是最有效的专职性抗原提呈细胞，能激活静止T淋巴细胞，诱导一系列免疫反应，清除病原体[1]. 用HBV转基因小鼠研究发现，虽然淋巴细胞的功能相似，但DC的功能却明显低于正常[2]. 提示慢性HBV感染及肝癌的发生可能与DC有关，我们探讨慢性HBV感染者和HBV阳性肝癌患者DC的表型和抗原提呈能力，以阐明慢性HBV感染及肝癌发生的机制. 1 材料和方法 1.1 材料 按照中华医学会修订的“病毒性肝炎防治方案”，选择慢性HBV感染者25例，男18例，女7例，年龄20-47(平均29.3±6.0岁); HBV阳性肝癌患者11例，男8例，女3例，年龄29-57(平均39.3±9.5岁); 另选健康志愿者15名，男9名，女6名，年龄19-39(平均29.2±6.7岁). 1 mo内未接受免疫调节剂及核苷类抗病毒药治疗. 淋巴细胞分离液由中国医学科学院天津血液所生产，RPMI1640和AIM-V培养基购自Gibco Co，GM-CSF,IL-4，TNFa，IL-2，FITC标记的HLA-DR和CD1a，PE标记的CD80和CD86单抗及其对照，IFNg，IL-10和IL-12检测试剂盒均购自深圳晶美生物工程公司，PHA、丝裂霉素C购自Sigma Co，基因工程HBsAg由华北制药集团有限公司提供，尼龙毛购自上海化纤九厂，3H-TdR购自法国NEN DuPont公司. FACS Calibar流式细胞仪由美国Beckton Dickson公司生产，液闪仪由美国Backman公司生产，IMx全自动定量免疫分析系统由美国雅培制药有限公司生产，其余均为国产仪器. 1.2 方法 各指标检测严格按说明书要求操作. 统计学处理 计量资料以(mean±SD)表示，组间比较用t检验，P <0.05，则可认为组间的差别具有统计学意义. 2 结果 2.1 DC表型 慢性乙肝患者和HBV阳性肝癌患者DC表面HLA-DR，CD83和CD86的表达水平较正常低，且后者尤甚(P <0.05，表1)而CD1a的表达与正常无明显不同(P >0.05)，提示其HLAⅡ和共刺激分子的表达水平较低，处于不成熟状态，可能影响其抗原提呈能力. 表1 慢性乙肝患者和HBV阳性肝癌患者DC表面共刺激分子和MHCⅡ分子的表达(%) 分组 n HLA-DR CD1a CD83 CD86 正常人组 15 53.29±3.65 12.75±3.19 33.61±3.32 39.12±3.54 慢乙肝组 25 33.69±3.26 11.43±3.42 19.74±2.79 19.87±3.13 患肝癌组 13 15.98±2.87 10.88±2.99 9.89±1.88 10.02±2.01 2.2 DC抗原提呈能力 用3H-TdR掺入法测定DC的提呈抗原的能力，发现慢性乙肝患者和HBV阳性肝癌患者DC的刺激指数低于正常，而后者更低(P <0.05，表2)提示其抗原提呈能力较正常低，诱导特异性免疫反应的能力低下. 表2 DC抗原提呈能力和抗原提呈过程中细胞因子的分泌水平 组别 n 刺激指数(cpm) IL-12(pg/mL) IL-10(pg/mL) IFNg(pg/mL) 正常人组 15 15.2±3.8 811.9±306.5 412.7±163.9 739.1±154.5 慢乙肝组 25 9.3±2.6 499.3±238.6 376.1±123.2 419.87±113.1 患肝癌组 13 4.8±2.8 214.9±131.8 359.8±132.9 108.2±52.1 2.3 细胞因子水平 慢性乙肝患者DC提呈抗原的过程中，IFNg和IL-12的水平低于正常，即Th1类细胞因子的水平较低，HBV阳性肝癌患者水平最低(P <0.05，表2)，而IL-10的水平与正常相似(P >0.05)，即Th2类细胞因子的水平无明显改变. 提示慢性乙肝患者和HBV阳性肝癌患者的DC诱导细胞免疫反应的能力较低，而对体液免疫可能无明显影响. 3 讨论 乙肝病毒(hepatitis B virus，HBV)只能在活细胞内以复制的方式进行繁殖，感染HBV后容易慢性化，甚至导致肝硬化和原发性肝癌. 而清除HBV主要依赖细胞免疫，特别是细胞毒性T淋巴细胞(cytotoxic T lymphocytes，CTL)通过清除HBV感染的细胞和Th1细胞分泌细胞因子而清除HBV[3]. 树突状细胞(dendritic cells，DC)是体内功能最强的专职性抗原提呈细胞，也是惟一能激活初始型T细胞，诱发原发性免疫反应的细胞. Kurose et al [2]发现HBV转基因小鼠MHCⅡ和CD86的表达水平明显低于正常，导致DC功能缺陷，使T淋巴细胞处于无能状态，造成慢性HBV感染和免疫耐受，用同系DC进行过继免疫，则能打破免疫耐受，诱发特异性CTL反应，清除HBV. 另有报道发现慢性HBV和HCV感染者及其阳性肝癌患者DC的HLA-DR，CD83和CD86的表达水平低于正常[4]，因此DC的功能与慢性HBV感染甚至原发性肝癌的发生密切相关. 我们所获DC纯度与文献[3]报道的相似. 结果显示慢性HBV感染者与HBV阳性的肝癌患者DC的HLA-DR和共刺激分子的表达水平及提呈抗原的能力较正常细胞低下，而后者尤为显著. 由此推断HBV感染可导致体内DC提呈抗原的能力降低，不能充分激活T淋巴细胞，诱发CTL反应，使感染容易慢性化. 若进一步降低还可能使机体免疫监视功能严重缺陷，导致肝癌的发生. 实验发现HBV转基因小鼠DC提呈抗原的能力低下，而且与Ia表达低下呈正相关，用IFNg可以提高DC提呈抗原的能力[2]. 另有报道慢性HBV和HCV感染者DC诱导混合性淋巴细胞反应的能力低下[4]，与本研究所观察的结果相似. 我们还观察了DC提呈抗原的过程中Th1和Th2类细胞因子的水平，结果表明慢性HBV感染者与HBV阳性肝癌患者DC提呈抗原过程中，Th1类细胞因子IFNg，IL-12的水平较正常低，其中肝癌患者更为明显，而Th2类细胞因子IL-10无明显差别. Ninomiya et al [3]也发现肝细胞癌患者DC诱导同种混合性淋巴细胞反应过程中IL-10和IL-12的水平较正常低. 同时有研究发现慢性HBV和HCV感染者DC在抗原提呈过程中，Th1类细胞因子IFNg和IL-12的水平低于正常，而Th2类细胞因子IL-10与正常无明显差别[5]，均与本研究的结果相似. 提示HBV感染者DC诱导特异性免疫反应的能力低下，造成对HBV感染的免疫耐受，使感染慢性化甚至导致原发型肝细胞癌的发生. 4 参考文献 1 Thery C, Amigorena S. The cell biology of antigen presentation in dendritic cells. Curr Opin Immunol 2001;13:45-51 2 Kurose K, Akbar SM, Yamamoto K, Onji M. Production of antibody to hepatitis B surface antigen(anti-HBs) by murine hepatitis B virus carriers:neonatal tolerance versus antigen presentation by dendritic cells. Immunology 1997;92:494-500 3 Ninomiya T, Akbar SM, Masumoto T, Horiike N, Onji M. Dendritic cells with immature phenotype and defective function in the peripheral blood from patients with hepatocellular carcinoma. J Hepatol 1999;31:323-331 4 Kakumu S, Ito S, Ishikawa T, Mita Y, Tagaya T, Fukuzawa Y, Yoshioka K. Decreased function of peripheral blood dendritic cells in patients with hepatocellular carcinoma with hepatitis B and C virus infection. J Gastroenterol Hepatol 2000;15:431-436 5 Bender A, Sapp M, Schuler G, Steinman RM, Bhardwaj N. Improved methods for the generation of dendritic cells from nonproliferating progenitors in human blood. J Immunol Methods 1996;196:121-135