人类基因组计划研究现状

zasxz

人类基因组计划研究现状
赵寿元
  构建人基因组的高分辨遗传图和更精细的互补物理图，收集按次序排列的DNA克隆，测定一个参考基因组核苷酸全序列，确定所有基因的位置，以此应用于生物和医学，平行地研究模式生物以充分而全面地了解人类基因组，这就是人类基因组研究计划的目标。

   16世纪比利时医生维萨里（Visalius）奠定了近代人体解剖学，20世纪50年代，分子遗传学的发展使人们认识到人体各个器官、组织和细胞的结构和功能，都是源出于细胞内基因组所包含的遗传信息。这样，解剖学即进入第二个新纪元——人体基因组的解剖。


   人体单倍体基因组包括22条常染色体和1条性染色体——X染色体或Y染色体，由30亿（3×l09）个核苷酸对组成。解剖人体基因组，就是分析测定这30亿个核苷酸排列的顺序。美国率先提出了一个为期15年、耗资30亿美元的人类基因组作图和测序的计划；日、英、法、意和苏联已组织机构拨款开展这顶研究；印度、澳大利亚和加拿大也表示要参加这一行列。

缘 起

   1984年12月，在美国犹他州举行了由能源部资助召开的环境诱变物和致癌物防护国际会议。到会的科学家提出了一个问题：有什么新方法可以直接检出人类的突变？或者更具体地说，有无方法在日本广岛、长畸原子弹爆炸幸存者及其子女的群体中直接测出突变率的增加？因为根据人类突变的流行病学研究，理论上应能检出突变增加了3倍，可是实际数据却与对照群体相仿。于是提出了测定人基因组序列以查明突变的可能性。讨论得出的结论是除非争取巨额资助，把建立十分灵敏的测出突变的方法列为重大课题, 否则难以达到目的。


   随后几年，研究的目标与技术路线更加明确具体，也在学术界引起了争议。1985年加州大学圣克鲁斯分校校长辛夏默（Sinshimer）提出应着手开始人基因组的测序工作。翌年，诺贝尔奖获得者、著名分子生物学家杜贝科(Dulbecco）指出弄清人基因组序列有助于解决癌症。同年3月，美国能源部正式提出承担此项研究工作，并于1987年春撰写了一份报告，即“人类基因组开创性计划”。能源部对人基因组测序计划持积极态度，并意欲独揽其事，其原因在于要精确计算辐射的人类遗传学效应；同时，它所属的国家实验室已取得二顶重大进展，为基因组测序提供有利条件，一是分离出人的单条染色体，并建立了它的基因文库，另一则是建立了美国的DNA序列数据库。


   国际学术界所持反对意见中，除了害怕法西斯种族主义会死灰复燃这一政治因素外，以1986年在美国冷泉港召开的“人类分子生物学学术讨论会”上反映出的意见具有代表性。当时参加会议的包括华生、吉尔伯特〔Gilbert）和伯格（Berg）等一批国际知名的科学家都支持该计划，但许多比较年轻的科学家则反应冷淡、心存疑虑。他们认为国家花这么多的经费资助人类基因组一个课题，势必会删减对生物学、医学其他研究课题的资助，这会影响生物学和医学的全面发展。另一个重要因素是对于由能源部（DOE）来主持这顶计划的实施表示担忧，认为能源部缺少全面了解遗传学发展动态的资深科学家；提出生物科学研究的主要资助机构美国国家卫生署（NIH）应该参予。


   争论引起美国科学院生命科学学部基础生物学委员会的重视，指定15人组成“全国研究委员会”（NRC），负责收集不同意见，提出了一份大家都同意的报告，即《人基因组的作图和测序》。报告强调首先需花5年时间从事基因组作图并改进测序技术；与此同时，平行地开展模式生物如大肠杆菌、酵母、线虫、果蝇和小鼠等基因组的研究；这消除了唯恐只集中研究人基因组而忽视其他生物材料、以致偏离生物学研究主流的疑虑。


   经过反复调查论证，美国国会于1988财政年度终于批准资助能源部和国家卫生署同时实施人类基因组计划，这两个部门的侧重点不同。国家卫生署主要反映生物学家的旨趣，从研究人类疾病出发，主要资助基因定位、模式生物基因组以及基因或DNA序列的功能等课题。能源部则亟需改进DNA测序方法，用于监测低水平辐射及其他环境因子的遗传学效应，所以首先集中注意人基因组的物理图构建，以及作图、测序和数据处理等技术系统的完善与创新。从1988年起至1990财政年度止，NIH得到经费1亿零400万美元，DOE得5700万美元（不包括从事该项研究的所有人员的工资）。1991至1995财政年度预算拨款为每年2亿美元。


   鉴于人类基因组研究是一个全球性的课题，需要国际间的合作，因此成立了一个机构——人类基因组组织（HUGO）。美国原则上不提供资助外国的研究项目，除非是在美国无法重复进行的课题，例如一些十分罕见的遗传病的基因等：但美国打算资助合作研究项目，前提是本国政府也必须拨款资助。


   


   

人类基因组的作图和测序



   1. 遗传图


   遗传图或遗传连锁图是以基因连锁、重组交换值构建的图谱，图距为cM（厘摩），1%交换值为lcM，约相当于100Okb。人基因组全长约3300cM，如两个标记之间相距1cM，则需3300个标记，如相距2～5cM，则需660～l650个标记。标记可以是体质性状，世可以是可检出的DNA序列，例如基因、限制片段长度多态性（RFLP）和特定的单一序列等。每一个标记都要用专一序列位点（STS）作鉴定。STS是指其位置及核苷酸序列均已知的、人基因组中只有一份拷贝的DNA短片段（一般长200～500碱基对），它很容易用多聚酶链反应（PCR）加以验证。当各个实验室报道定位和测序的数据时，可用STS来确定这些DNA片段的定位与取向。


   人类基因组计划的研究目标是，完成一个完全连接的人类遗传图，标记之间平均相距2～5cM。


   2. 物理图


   物理图是指标明一些界标（例如限制酶的切点、基因等）在DNA上的位置，图距以物理长度为单位，例如染色体的带区、核苷酸对数目等。人类基因组计划的研究目标是，构建人的每条染色体的STS图，标记之间相距约10Okb。获得一组组DNA片段的克隆，组内两两片段之间有共同的重叠序列；或是获得标记按正确次序排列、相互毗邻的片段，其连续长度超过2000kb，以便把染色体分段进行研究。


   物理图主要有以下几种：


   (1) 细胞遗传学图：这是在显微镜下观察确定基因或DNA标记与染色体上可见界标间的相对位置与距离。这种物理图的分辨率很低，例如染色体显带技术一般可分出几百条带，每条带实际上相当于106至107个碱基对。不过，这还是很有用的，1989年报道的定位标记已有4362个，而二年前还只有2057个。


   （2）限制图：这是确定限制酶的切点在染色体上的排列次序与距离。如果测定的是稀有切点的限制酶的位点（如NotI，MluI等），切点之间距离很长，则称之为大尺度限制图。当一些酶切位点出现多态现象时，按照多态位点构建的限制图，则称为RFLP图。


   （3）STS图：这是将每一条染色体上的、或一条染色体的某一区段内的STS，按照其原有次序和间距构建成的图谱。这样，当不同实验室各自提出某一DNA片段的物理图、某一测序的DNA序列等资料时，可根据STS这一共同“语言”来拼凑组合成一个统一的限制图。


   最通常的物理图的构建方法是把限制酶切的DNA片段，按其次序排列连接起来。作图的技术路线基本上分两类：一类是由长到短作图，另一类则是由短到长作图。前者是将基因组DNA用切点很少的限制酶如NotI等完全酶切，得到长约100～l000kb的DNA长（大）片段，每条染色体平均切成130个片段，按照片段上的标记把片段按次序排列，然后再把每一长片段酶切成短片段，再把短片段排列成序。这是由长到短的作图，图比较完整但分辨率低。后一类方法则是先将基因组DNA用限制酶作部分酶切，得到的短片段分别用酵母人工染色体（YAC）或粘粒等作载体加以克隆，然后根据克隆片段两端共有的序列即重叠序列，两两连接，逐渐延伸成长片段。这样作图分辨率较高，但图不完整往往留有空缺。这是因为有些酶切产生的DNA片段太短，不易被克隆，以致在通过重叠序列把片段连接时出现中断。一组相互邻接的DNA片段的克隆称为邻接DNA片段组（contig）。目前一个contig通常只有2～6个粘粒克隆，即所含的DNA片段相加只有100～300kb，如除去两两片段的重叠序列，则一个contig作图覆盖的DNA长度是有限的。现在要求在5年内做到一个contig能覆盖2000kb DNA，并带有几个标记。


   


   在制作物理图时，重点发展的几种实验技术是：（1）脉冲电场凝胶电泳，这是分离高分子量DNA的一种电泳技术，使DNA分子处在两个相互垂直、交替更换的电场中移动，把分子量不同的DNA片段分开，可分辨50kb至200kb的DNA分子。（2）YAC克隆：YAC是由质粒pBR322、酵母的着丝粒、四膜虫rDNA的端粒、酵母的自主复制序列（ARS）以及一些选择标记基因构成。呈环状结构时，可以质粒方式在原核细胞中增殖复制。切成线状结构后，可连同插入的外源DNA，如染色体一样地在酵母细胞中复制、分配给子细胞。YAC作为载体，克隆的外源DNA平均300kb，最长的可达100Okb，稳定地传递给子细胞。设计构建YAC时，在原核生物的复制起点〔Ori）上游安排一个限制酶切位点（如XhoI），当YAC载 有外源DNA后，只需用Xhol酶切，则靠近克隆位点的外源DNA上的XhoI切点，可与YAC的XhoI切点互补结合呈环状，按质粒进行复制和被回收。这种技术称为质粒获救。用这种方法可把外源DNA的末端分离出来，作为钓取与其邻接的、具有共同末端序列亦即重叠序列的另一DNA片段的探针。实际上这也就是染色体步移的操作。（3）PCR（多聚酶链反应）：体外扩增DNA的技术，在生物学、医学等基础研究和临床诊断上有极其广泛的用途。在构建基因组物理图时，主要用于验证STS。（4）荧光原位杂交：传统的以同位素标记探针作原位杂交，曝光后的颗粒较粗，定位不易精确。正在研究以荧光染料代替同位素，提高定位的精确度。（5）辐射杂种细胞分析，这是利用体细胞遗传学的方法构建高分辨的染色体图的技术。人-鼠杂种细胞接受射线辐照后，染色体断裂，筛选出保留缺失程度不同的人染色体的杂种细胞，可用于构建大尺度染色体物理图。

zasxz

   3．DNA测序


   目前已测序的最大的DNA分子是巨细胞病毒DNA，长约250kb，其次则是EB病毒DNA，长约17Okb。采用当今最新的测序仪器，每位熟练的科技人员操纵一台仪器，每天可测序2kb，即每人每年每台仪器可测序700kb，但这样的速度，需有300台仪器昼夜不停地运转，连续15年才能完成人基因组8×l06 kb的测序。因此，进一步实现测序自动化，快速而有效地工作，才能做到提高效率和降低费用。人类基因组计划的研究目标是，改进目前的测序技术，发展创建新方法，做到大规模测序时的费用为目前的百分之一。在发展技术并验证其有效性的过程中，测定一个长约10000kb的连续的DNA片段的序列。


   DNA测序技术的研究可归入改进与创新两类。改进是以桑格（Sanger）和马克索姆-吉尔伯特（Maxam-Gilbert）的测序系统为基础，在试剂和方法等方面不断完善。如：（1）提高分辨和检测的灵敏度，研究采用毛细管凝胶电泳或超薄平板凝胶电泳，提高核苷酸测序的分辨率，一次可“读”上千个核苷酸；同时因凝胶薄易散热，可用高电压，大大缩短操作时间。由于毛细管凝胶和超薄平板凝胶电泳时，所用DNA的量很少，还需提高检测凝胶中标记DNA的同位素或荧光的灵敏度。当DNA用可以彼此区分的不同的稳定同位素标记时，A、T、G、C四种DNA片段可混合加在电泳胶的一个样品孔中走电泳，DNA电泳带的位置可用共振电离光谱仪结合一种质谱仪扫描测定，其分析速度可望达到每分钟3×l06到1×107碱基对。（2）延长测序片段的连续长度。不论是用YAC或粘粒为载体，其插入片段作测序时都要用“鸟枪法”随机切断后亚克隆在测序载体中测定其核苷酸序列，然后再把短片段连接。此时，如能找到合适的调序起点或标记，使两个片段很容易连接，则可提高测序和作图的效率，获得连续长度很长的序列数据。有人设计用转座因子随机插入待测序列的DNA中，把插入的转座因子作为标记，测定该两个转座因子之间的DNA的序列。例如转座子Tn5有supF（supressor tRNA）基因作为选择标记，转入λ噬菌体的外源DNA中后，可用是否形成噬菌斑来选择；转入质粒的外源DNA，则可从抑制染色体的琥珀突变来筛选。这样，多个转座因子整合位点间的DNA序列可通过重叠序列而连续衔接成很长的片段。


   创新的测序方法的操作原理和使用仪器是各异的，目前在研究发展的有以下几种：（1）流式细胞仪测序：其原理是以DNA单链为模板，合成互补链时的核苷酸分别用不同的荧光染料标记，然后连同核酸外切酶置于石英毛细管内。被酶切而分解下来的核苷酸一个一个地通过流式细胞仪的检测系统，借助于不同的荧光而直接读出核苷酸的序列。（2）扫描隧道显微术（STM）：这项技术的基本原理是利用量子隧道效应，将原子线度的极细针尖在接近样品的表面（1纳米）处扫描，通过监测样品与针尖间隧道电源随距离的变化，得到样品表面的形象。对DNA样品则可区分出DNA糖-磷酸骨架上4种碱基的差别。现在最新的一种称为分子激发显微术，扫描针尖与样品之间的能量交换与调制的灵敏度，足以探究样品的用于轨道的性质，在分析DNA时，如标记上可以区别的金属，则可进一步提高不同碱基的分辨率。（3）X射线成象术：积极发展强烈的激光X射线源和高质量的X射线光学仪器，使X射线的成象能力足以在空间上分辨不同的碱基。原则上，单链的数据就足以重建DNA分子的全息象。在发展该项技术时，要考虑消除与防止射线对DNA的损伤效应。另一项技术称为准晶体成象术。它是在用PCR技术扩增一段DNA分子时，以重金属离子标记一种碱基。只要1000万个标记的、完全伸展的DNA分子就可作为分析样品。当用激光x射线作分析时，金属标记物在DNA片段中的位置可从散射数据加以确定。每一DNA片段只需测定A、T、G、C四种标记物的位置后加以汇总，便可获得核苷酸的排列次序。


   

模式生物



   生物学研究早已表明，从模式生物获得的数据资料对于研究和阐明人类生物学是必不可少的，在分析人的基因调控、遗传病发病机理及诊断以及进化等方面已取得重大成果。所以在研究人类基因组的同时还要研究微生物、植物和动物等一些模式生物的基因组的作图和测序。这项研究对于发展新技术也是必要的，因为这类生物的基因组比较小而简单，更易于操作。人类基因组计划的研究目标是，根据DNA标记绘制小鼠基因组的遗传图，着手构建一条或两条染色体的物理图。在改进及创新测序技术并验证其有效性的过程中，测定多种模式生物的DNA序列，并集中力量测定长1000kb DNA片段的序列，累计长度达20000kb。


   目前已提出的模式生物有：（1）细菌：由美、日合作对大肠杆菌〔Escherichia coli，4.8×105kb）测序；欧洲一些实验室则研究枯草杆菌〔Bacillus subtilis）。（2）酵母：美、日和欧洲合作研究酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）。（3）线虫：美、英研究秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis elegans，1×105kb）。（4）果蝇：美国研究黑腹果蝇〔Drosophila melanogaster，1.5×l05kb）。（5）小鼠：美国研究实验室小鼠（Mus muscalus）。（6）植物：美国研究重复序列很少的拟南芥菜（Aralidopsis thalia，7×104 kb）的基因组，如有可能则进一步研究玉米。


   

信息学：数据收集和分析



   人类基因组研究的直接结果是基因组的一些图谱和核苷酸序列，为了最大限度地利用这些资料必须建立计算机信息系统，用以收集、贮存和分配数据。当前要考虑的是建立一个大的数据库还是几个较小的连网的数据库；现有的数据库能否满足未来的长期而全面的要求，还是应建立新的系统。但有一点是明确的，即基因组数据库必须是全面而最新的，如果有几个数据库则必须是连网的。在发展数据库的同时，还必须发展分析和解释基因组图及DNA序列的新方法。人类基因组计划的研究目标是，发展有效的软件和数据库，以满足大规模作图和测序的要求。创建数据库工具以便很容易地获得最新的物理图、遗传图、染色体图及测序数据，并对这些数据资料作比较研究。


   由此而形成了一门新学科——基因组信息学，它包括基因组信息的获取、处理、贮存、分配、分析和解释等方面。基因组信息学结合数学、计算机科学和生物学，将基因组图、DNA序列和蛋白质序列一并研究以阐明这些数据资料的生物学意义。为了推动这项工作，NIH和DOE成立了一个“信息学联合工作部”（JITF）协调全国的基因组数据结构、管理和服务，发展分析资料用的算法、软件和硬件，规定数据交换的标准，收集和分配信息资料的电子网络，培养专业人员，以及国际间基因组信息的交流。最近美国国立医学图书馆成立一个“全国生物技术信息中心”（NCBI），负责有关分子生物学、生物化学、遗传学（特别是人类分子生物学）的研究信息的自动处理系统。


   

伦理、社会和法律诸方面的考虑



   尽管基因组计划将通过医学、生物学研究和生物技术等途径大大造福于人类，但如同任何一项新技术一样，总会因担心其被错误应用从而引起一场争论，实施人类基因组计划预期会涉及一系列伦理学的、商业的、法律的等社会问题。例如，分析某人的遗传组成时是否涉及个人的隐私而需保密？将某人的基因数据应用于别人时，是否需征得该人同意，这里有没有类似版权或所有权的问题？如何保证不因为基因组分析资料在就业、保险等方面产生歧视？如果已知某人是某种疾病基因的携带者，而这种病又一时还无法治疗，那么在婚姻、征兵、犯罪判决、领养，教育等方面会出现什么情况？如此等等，不一而足。人类基因组计划的研究目标是，立题研究人类基因组计划的伦理、法律和社会诸方面的内涵，论证和确定其主要论点，并提出相应的政策措施。


   针对上述问题，制订了研究的具体内容：事先要充分估计人类基困组作图和测序对于个人和社会的关系；审议该计划的伦理学的、法律的和社会的后果：促使公众对一些论点开展讨论；提出政策措施以保证研究成果有利于个人和社会。总的要求是未雨绸缪，防患于未然；预见争议和问题，提出相应对策，防止消极效应。采取的方法有资助立题研究，通过报刊讲演等多做宣传教育工作，鼓励和促进国际合作等。


   

专业训练



   美国人类基因组计划的研究目标是，从1990财政年度开始资助博士生和博士后的研究训练。每年增加接受专业训练的人员，到1995年时稳定在每年训练600人。


   着眼于培养跨学科的专业人员，特别是那些既了解手头亟待解决的生物学问题，又懂得从其他学科寻找解决办法的科学家。美国的专业训练对象分三个层次：（1）博士生：着重于交叉学科的训练，使学生对于如何将一门或几门非生物科学的原理和方法，应用于与基因组有关的生物学问题有一个深入的了解。（2）博士后：除了哲学博士或医学博士通常要接受的分子生物学及与染色体组研究有关领域的训练外，着重于交叉学科的训练。鼓励数学、计算机科学、物理学、化学或工程学的专业人员接受生物科学的专业训练，以便从事基因组研究。同样地，也鼓励生物学家学习计算机科学、仪器设计、物理学等。有志于基因组计划的伦理学、法学和社会学研究的人士，也在资助之列。（3）高级研究人员：凡生物学和非生物学的有经验的研究人员可获资助去学习其他学科的知识，旨在拓宽研究兴趣、扩大知识面，有助于分析和解决与墓因组计划有关的问题。


   

技术发展和技术转让



   尽管近几年基因组研究技术已有了长足进步，仍需在适应大规模开展研究及降低费用两方面努力，重点在克隆技术、机器人操作、DNA测序、凝胶技术、软件工具和仪器设计等方面实现高度自动化、最优化和减少费用等。一些全新的研究方法，如质谱仪、扫描隧道显微术测序，以及甚至还在构思的仪器、技术等都应予足够重视。人类基困组研究计划的目标是，资助全新的和风险很大的技术发展项目，改进现有技术。


   迅速把技术转让给工厂，能实现广泛而经济地应用于医学等领域。平行地对植物和动物基因组的研究，也将具有直接的商业价值。人类基因组研究计划的目标是，进一步增强与工业的紧密联系，鼓励并促成向医学界转让技术和重要的医学信息。


   关于人类基因组计划的得失利弊之争，在学术界仍未平息，但争论并不影响计划的实施。人的各条染色体的作图和测序的初步分工已有了归属。在1991～1995年第一个五年计划期间，NIH负责3、4、18三条染色体的物理图。DOE的洛斯阿拉莫斯（Los Alamos）、利弗莫尔（Livermore）两个国家实验室负责构建16、19两条染色体完整的重叠克隆图和克隆文库，NIH和DOE共同资助构建5、11、17、21、22、X六条染色体的物理图。1990年NIH还新设了4个基因组中心：华盛顿大学圣路易斯分校，负责用YAC制作7、X两条染色体的完整的遗传图和物理图，第一年资助234万美元；加利福尼亚大学旧金山分校，负责用原位杂交构建4号染色体的物理图，第一年资助224万美元；麻省理工学院主持，怀海德生物医学研究所、哈佛大学、普林斯顿大学和杰克逊实验室参加，负责小鼠的1、11和X三条染色体的YAC文库的构建，第一年资助218万美元；密歇根大学负责研究遗传病基因的“从临床症状到碱基对”，第一年资助156万美元。美国农业部和国家科学基金会则出资开展了拟南芥菜基因组的研究。


   世界上除美、日等工业发达国家已积极开展人类基因组的解剖研究外，一些发展中国家也立题着手进行了。我国的情况又是如何？关于人类基因组的研究计划概况，在1989年已有专文介绍；1990年来朱景德等又全文翻译出版了《人类基因组的作图和测序》，旨在吁请有关领导和国内同行的重视，推动我国的研究。笔者现又撰文补述近二年内国际学术界的动态和计划实施的状况，目的也在于投石激浪，对“我们是否介人？”“怎样介入？”等问题开展学术讨论和作出回答。