淋巴细胞发育过程中重排活化基因RAG的表达调控

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淋巴细胞发育过程中重排活化基因RAG的表达调控
武春晓 2001博士生 专业：免疫学 导师：马大龙 教授

前言：我们的免疫系统具有惊人的适应能力，这建立在体内由TCR和免疫球蛋白分子组成的巨大的特异性抗原受体谱的基础之上。而抗原受体的高度多样性是在发育B和T淋巴细胞通过V(D)J基因重排过程产生的。V(D)J基因重排异常将严重影响抗原受体谱的产生，阻滞淋巴细胞的发育，导致严重联合免疫缺陷综合症SCID或Omenn 综合症等疾病1。
体内V(D)J基因重排是多种分子参与的复杂过程，其分子机制已基本阐明。大致可将它分为两个阶段：一、 重排活化基因 RAG1和RAG2蛋白及其辅助DNA结合蛋白HMG1或HMG2特异性识别位于编码基因片段侧翼的重排信号序列RSS并在此将DNA切割开2；二、非同源末端连接装置（nonhomologous end-joining machinery，NHEJ)将产生的断裂DNA末端（信号区平末端和发夹结构编码区末端）连接起来形成重排产物。NHEJ主要由广泛表达的DNA ligase Ⅳ、DNA-PK、Ku70/Ku86、Artemis、XRCC4等蛋白组成。它们也参与其它DNA损伤修复过程3。图1


重排活化基因RAGs产物的正确时空特异性表达对获得性免疫系统的正常发育至关重要。它的表达受严格的调控4。值得一提的是近年来建立了绿色荧光蛋白GFP－RAG指示剂转基因和基因打靶小鼠品系。由此可以在体内单细胞水平直接观察RAG的表达，从而有助于确定次级淋巴器官表达RAGS的细胞，及发现参与调控RAG阶段特异性和细胞系特异性表达的顺式作用元件。这是研究RAG调控领域的取得的一大进展5,6,7。

一、RAG的结构及功能20
1. RAG基因结构  
RAG 包括RAG1和RAG2，它们是一对非常独特的基因，最早出现在有齿鱼，在脊椎动物进化过程中高度保守。在人基因组，它们以尾对尾的结构形式定位于11染色体11p13，其编码区位于单独的一个外显子。而且它们共同转录并被协同调控。RAG基因的这些特性提示它们是由一个共同的转座子插入起源而来。RAG1和RAG2在体外的确表现有转座子活性。两个RAG都有一个非编码的外显子，这可能是起源转座子整合的宿主细胞序列，此外显子后来进化为淋巴系统特异性表达调控序列。在人RAG2，有两个变异剪切外显子，(exon 1A and exon 1B)。 Exon 1A构成主要起始位点，exon 1B是次要起始位点。小鼠RAG2只有一个外显子1。

2.RAG蛋白结构及功能
通过大量的RAG蛋白突变体的研究，帮助我们确定了RAG蛋白的多个功能域。（见图2）。人RAG1蛋白全长1008个氨基酸残基，其氨基末端区域（1-386氨基酸残基）有核定位信号，特别是4个碱性区域BI,BIIa，BIIb，BIII是核转运蛋白SRP1的靶点。两个锌指结构域C3HC4,C2H2参与RAG1蛋白的二聚体的形成。RAG1蛋白的中心区域有两个非常保守的功能域，其中392－448氨基酸残基区域识别重组信号序列RSS，将RAG1-RAG2蛋白复合体锚定在RSS区。另一个504-526氨基酸残基区域是重组酶活性区域。与RAG2蛋白相互作用功能域定位于504-1008氨基酸残基区域，包含了活性中心和羧基末端区域。
人RAG2蛋白全长包括517个蛋白氨基酸残基，其活性中心位于氨基末端1-382氨基酸残基区域，其中1-355氨基酸残基区域包含6个由50个氨基酸残基组成的kelch/mipp重复基序，它们介导蛋白－蛋白和蛋白－DNA相互作用。RAG2蛋白羧基末端区域非常保守，可能介导与染色体蛋白之间的相互作用。
图2
  
3. RAG缺陷与疾病
     对基因打靶小鼠动物模型的研究证明了RAG1和RAG2在V（D）J基因重排和淋巴系细胞发育中的关键性作用。rag1-/-和rag2 -/- 小鼠有同样的表现型，严重的T/B细胞早期发育组滞在，T细胞停滞于CD3-CD4-CD8-CD25+阶段，而B细胞停滞于B220-CD43+IgM-祖B细胞阶段。它们的外周血没有成熟的循环T/B淋巴细胞，这与人重症联合免疫缺陷综合征SCID非常相似。而且，都有V（D）J基因重排缺陷。有人在14个SCID病人当中发现6例有不同的RAG基因突变，体外实验证明这些突变导致RAG蛋白功能彻底缺失。而在Omenn 综合症病人，也有RAG基因突变，但体外实验表明OS病人的RAG蛋白仍然保留部分V（D）J基因重排活性。而OS病人的症状也较SCID病人轻，外周血低免疫球蛋白血症，无循环B淋巴细胞，但有数目不同的成熟，活化，寡克隆，功能缺陷的T细胞。

二、 淋巴细胞发育过程中RAG的表达
1、在早期淋巴细胞发育过程中RAG的表达
在淋巴系统生发过程中RAG基因是何时活化的？T和B淋巴细胞共同来源于一个的不表达RAG1和RAG2祖细胞。在发育胸腺细胞中，RAG表达和V(D)J重排最早出现于CD4-CD8(DN )-CD44+CD25+定向祖T细胞。而第一个表达RAG1和RAG2的B细胞是AA4.1+HAS-CD4+CD43+祖B细胞。此B细胞也是定向发育的，但其RAG表达水平低且无V(D)J重排5,8。
RAG的表达水平随B细胞成熟而增高，在AA4.1HSA-B220+CD4-CD43+pro-B细胞最早开始出现V(D)J重排。但此时发生重排的细胞比例很低2/49。到了HSA+B220+CD43+pro-B细胞RAG的水平和V(D)J重排率继续增高。而所有分化成pre-B的细胞全都携带至少在一个等位基因位点的符合阅读框架的V-D-J连接。
在pre-B细胞免疫球蛋白重链的表达或在pre-T细胞β链的表达分别诱导免疫球蛋白重链和TCRβ链的等位基因排斥。表面pre-BCR 和pre-TCR的表达分别启动了pre-B细胞和pre-T细胞的几轮增殖分化。同时，等位基因排斥和增殖扩增在B和T细胞系均伴有RAG的表达下调6,8。

2. 在pre-B和DP-T细胞中RAG的表达
pre-B细胞或pre-T细胞的几轮增殖扩增之后，在CD25+pre-BⅡ和CD4+CD8+ DP T细胞开始了RAG的第二波表达。同时免疫球蛋白轻链和TCR链基因的重排速度加快9。

3. 二次V(D)J重排
TCRα链基因的有效重排结果导致完整的αβTCR的细胞表面表达。但这并不终止V(D)J重排。RAG的表达和TCRα链的基因重排过程一直持续到胸腺阳性选择发生TCR交联时才终止。由于V(D)J重排的随机性，开始大约有2/3重排基因不符合阅读框架，这些DP-T细胞开始产生的受体不被阳性选择。而通过这种持续性的TCRα链基因二次重排，则有可能挽救这些细胞，从而提高T细胞的生成效率10。
在DP-T细胞，TCR的交联终止RAG的表达；而在骨髓，未成熟B细胞表面受体的结合反而会诱导RAG的持续表达和受体编辑，这将防止自身特异性BCR的产生，并阻滞自身反应性B细胞的发育12。

4. RAG表达的终止
成熟的T或B细胞不表达RAG。发育过程中的DP T细胞RAG的表达终止于阳性选择；虽然未成熟B细胞确实表达RAG mRNA和蛋白，但RAG mRNA的水平与细胞表面IgM的水平负相关，而后者随着未成熟B细胞的发育成熟而逐渐增高。等到未成熟B细胞选择性进入长寿命B细胞室时，RAG的表达才完全终止。有实验表明，在未成熟的外周B细胞，其表面受体的交联会终止RAG的表达11。

5. RAG的表达与抗原反应
生发中心（GC）是体内抗原应答时B细胞克隆扩增的区域。这一结构也是体细胞突变和选择发生的区域。有人用免疫组化的方法在此区域发现RAG的表达，并推测B细胞RAG的再次诱导表达是GC反应的一部分，因此GC区的V(D)J重排也构成另一种抗体亲和力成熟的机制13。
但在GFP转基因指示剂小鼠和基因打靶指示剂小鼠发现，在脾内有少量的表达RAG的未成熟B细胞，其数量在免疫后增高。这些未成熟B细胞一般不是GC细胞，但可以参与免疫应答，并进入GC区。而且，一旦未成熟B细胞RAG的表达终止，就不会再次被诱导表达。而纯化的成熟B细胞在体外用丝裂原或过继传输后免疫均不会再表达RAG5,7,13。

三、RAG的表达调控。
对V(D)J基因重排事件的精确调控，及将其限制于一定的微环境中，将有助于确保基因组的整体完整。因此一定有一个对V(D)J基因重排机器，包括RAG表达的严格的组织特异性、细胞系特异性、和发育特异性的调控机制。
RAG1和RAG2表达调节发生在三个水平上：转录，转录体稳定性，和磷酸化介导的蛋白降解。其中主要的是转录起始水平的调节。研究RAG的顺式作用元件和转录因子的研究有助于阐明其调控机制14。

1. RAG的启动子15－20
人RAG1的最小基础启动子定位于其主要转录起始位点－111到＋97个核苷酸区。它在淋巴和非淋巴样细胞均有活性。该启动子没有启动基序和功能性的TATA盒，其中的一个A/T高度富含区可能是转录因子THⅡD的结合位点。RAG1启动子中有潜在的E2A-,IKAROS- 和ETS 家族转录因子等多个识别位点。另外，还可检测到PEPBS/CBF和Y-BOX/CCAAT共有序列基序。核因子Y（NF-Y）结合到RAG1的Y-BOX基序；对此基序的突变可阻断NF-Y转录因子的结合，并显著降低RAG1启动子活性。NF-Y可以与cAMP反应元件结合蛋白相互作用。因为RAG1的表达对cAMP信号反应，因此NF-Y位点可能于一个未知的cAMP反应元件相互作用。人和小鼠RAG1启动子高度同源。
人RAG2启动子没有TATA；但在其主要转录起始位点－34位置有一个GATAA共同基序。人RAG2启动子在淋巴和非淋巴细胞系都有活性。提示人启动子以外的调控元件可能参与了组织特异性的转录调控。而小鼠RAG2启动子只在淋巴系细胞有活性，提示其中含有调控RAG2组织特异性表达的顺式元件。而且，在B细胞和T细胞，B细胞系特异性转录因子PAX5，T细胞系特异性转录因子GATA-3分别结合在转录起始位点-80-17区。对此区域的突变降低了在B和T细胞的启动子活性。提示不同的DNA结合蛋白，PAX5，GATA-3分别在B和T细胞调节小鼠启动子活性。在小鼠T细胞系，转录因子c-Myb结合RAG2启动子近端的一个Myb共有位点，是RAG2启动子在T细胞系的活性的必需正向调节因子。而在小鼠B细胞系，c-Myb和PAX5共同结合并协同活化RAG2启动子，蛋白缺失体实验表明c-Myb C末端结构域介导了两者的相互作用。在RAG2启动子5’端，有一含GA-box的G富含区，可特异性结合转录因子SP1，对RAG2启动子的完全活性起辅助调节作用。
2染色体结构改变和RAG增强子19，21。
在人RAG1基因上游相邻的24KB染色体DNA片段发现了至少4个淋巴细胞系特异性DNase I高度敏感位点（HS1,HS2,HS3，HS4），其中，HS1在多种细胞系中可以检测到；HS2,3,4为淋巴细胞系特异；HS3与启动子区有部分重叠。这些DNase I高度敏感位点在小鼠与人中非常保守。
在表达小鼠RAG2的pre-B细胞系RAG2基因上游相邻的25KB染色体DNA片段发现了3个淋巴细胞系特异性DNase I高度敏感位点（HS1,HS2,HS3）。HS3位于RAG2启动子区，只与表达RAG2细胞系相关。在HS1和HS2相应区域发现了两个增强子元件，其中一个增强子元件D3，只在淋巴细胞系有增强子活性；只在初级淋巴组织有活性，在次级淋巴组织和非淋巴组织无活性；只在CD4(-)CD8(-)胸腺细胞有活性, CD4(+)CD8(+) 或 CD4(+)CD8(-)胸腺细胞无活性；在骨髓in B220(+)IgM(-)细胞有活性, B220(+)IgM(+)细胞无活性。进一步
实验提示C/EBP转录因子可能结合D3增强子而产生活性。  
  
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