基因多态性研究及其在肝病中的应用

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基因多态性研究及其在肝病中的应用

程元桥

一、基因多态性：

多态性（polymorphism）是指处于随机婚配的群体中，同一基因位点可存在2种以上的基因型。在人群中，个体间基因的核苷酸序列存在着差异性称为基因（DNA）的多态性(gene polymorphism)。这种多态性可以分为两类，即DNA位点多态性(site polymorphism)和长度多态性 (longth polymorphism)。

1.位点多态性：是由于等位基因之间在特定的位点上DNA序列存在差异，也就是基因组中散在的碱基的不同，包括点突变（转换和颠换），单个碱基的置换、缺失和插入。突变是基因多态性的一种特殊形式，单个碱基的置换又称为单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism, SNP), SNP通常是一种二等位基因（biallelic）或二态的变异。据估计，单碱基变异的频率在1/1000-2/1000。SNP在基因组中数量巨大，分布频密，检测易于自动化和批量化，被认为是新一代的遗传标记。

2. 长度多态性：一类为可变数目串联重复序列（variable number of tandem repeats, VNTRS），它是由于相同的重复顺序重复次数不同所致，它决定了小卫星DNA（minisatellite）长度的多态性。小卫星是由15-65 bp的基本单位串联而成，总长通常不超过20bp，重复次数在人群中是高度变异的。另一类长度多态性是由于基因的某一片段的缺失或插入所致，如微卫星DNA（microsatellite），它们是由重复序列串联构成，基本序列只有1-8bp,如(TA)n及(CGG)n等，通常重复10-60次。长度多态性是按照孟德尔方式遗传的，它们在基因定位、DNA指纹分析，遗传病的分析和诊断中广泛地应用。

造成基因多态性的原因：1复等位基因（multiple allele）位于一对同源染色体上对应位置的一对基因称为等位基因（allele）。由于群体中的突变，同一座位的基因系列称为复等位基因。某些复合体基因的每一座位都存在为数众多的复等位基因，这是某些复合体（HLA）高度多态性的最主要原因。2共显性（condominance）一对等位基因同为显性，称为共显性，某些复合体中如HLA每一对等位基因匀为共显性。共显性大大增加了人群中某些基因表型的多样化。基因的多态性显示了遗传背景的多样性和复杂性。它可能是人类在进化过程中抵御不良环境因素的一种适应性表现，对维持种群的生存与延续具有重要的生物学意义。

二、基因多态性的生物学作用：

1．遗传密码的改变：如果基因多态性的碱基的取代、缺失、插入引编码序列的核苷酸顺序改变，在转录和翻译合成蛋白质的过程中，有的对多肽链中氨基酸的排列顺序产生影响，有的不产生影响。可分为：错义突变(missense mutation)指DNA分子中碱基对的取代，使得mRNA的某一密码子发生变化，由他所编码的氨基酸就变成另一种不同的氨基酸，使得多肽链中氨基酸的顺序也相应地发生改变。无义突变(nonsense mutation)指由于碱基取代使原来可翻译某种氨基酸的密码子变成了终止密码子。例如UAU（ 氨酸）颠换成UAA（终止密码子）使多肽链的合成到此终止，形成一条不完整的多肽链，使蛋白质的生物活性和功能改变。转换也可引起无义突变。同义突变(same sense mutation)指碱基的取代并不都是引起错义突变和翻译终止，也就是虽然碱基被取代了，但蛋白质水平上没有引起变化，氨基酸没有被取代。移码突变 (frame-shifting mutation)指在编码序列中单个碱基、数个碱基的缺失或插入，片段的缺失或插入可使突变位点之后的三联体密码子阅读框发生改变，不能编码原来的正常蛋白质。

2．对mRNA剪接的影响：如果点突变发生内含子的剪切位点，可以产生两种影响：一是原有的剪接位点消失，二是产生新的剪切位点。无论是那一种形式，都可以导致mRNA的错误剪接，产生异常的mRNA，最终产生异常的表达产物，数个碱基的缺失、片段缺失等匀有可能造成剪接位点的缺失。

3．蛋白质肽链中的片段缺失：无义突变和DNA片段的缺失都可以导致肽链中的片段缺失，致使基因编码的蛋白质失去原有的功能。移码突变不仅翻译后的肽链中氨基酸序列发生改变，而且也导致肽链中的大片段缺失。

4．启动子的突变及非转录区的突变：可以使基因的转录水平或活性的增强或降低。

5．基因多态性的基因型频率分布：在人群中符合Hardy-Wenberg平衡。

三、基因多态性的医学意义：

人类基因多态性在阐明人体对疾病、毒物的易感性与耐受性，疾病临床表现的多样性（clinical phenotype diversity），以及对药物治疗的反应性上都起着重要的作用。临床上早期有关基因多态性的研究是从HLA基因开始的，分析基因型在疾病发生易感性方面的作用，如HLA-B27等位基因与强直性脊椎炎发生率的密切关联，可作为诊断的依据。通过基因多态性的研究，可从基因水平揭示人类不同个体间生物活性物质的功能及效应存在着差异的本质。通过对基因多态性与疾病的易感性的联系研究，如P53抑癌基因多态性与肿瘤发生及转移的关系研究，可阐明人体对疾病、毒物和应激的易感性，不仅为临床医学也为预防医学的发展带来新的领域。

疾病基因多态性与临床表型多样性的联系已受到重视，如肿瘤等多基因病的临床表型往往多样化，阐明基因型（genotype ）与表型(phenotype)之间的联系在认识疾病的发生机理、预测疾病的转归等方面也有重要的作用。药物代谢基因多态性可以影响药物的代谢过程及清除率，从而影响治疗效果。致病基因的多态性使同一疾病不同个体其体内生物活性物质的功能及效应出现差异，导致治疗反应性上悬殊，按照基因多态性的特点用药，将会使临床治疗符合个体化的要求。在疾病基因多态性研究的引导下，临床医生将有可能预断不同的个体在同样的致病条件下会出现什么样的病理反应和临床表现，即临床表型。如高血压的治疗将根据基因多态性的研究选择更具针对性的药物，调整其剂量，而不是不加选择地使用ACEI、钙拮抗剂或交感神经受体阻断剂。合并症的防治也会更个体化，更具针对性。

基因多态性的研究对于遗传病具有双重意义，一方面，基因的有害突变，不论是经典的点突变，还是动态突变，其本身就可能是遗传病的病因，另一方面,众多的多态性位点又是很好的遗传标记，可以在遗传病的研究和临床诊断中发挥重要的作用。1.多态性作为遗传病的病因：点突变引起的疾病：从镰刀状细胞贫血开始，突变引起各种遗传病的例子愈来愈多，遗传性肿瘤也逐渐被认识。重复序列多态性作为遗传病的病因：如CCG，CTG和CAG这样的三核苷酸重复序列，当其拷贝数过度增高时可以引起强直性肌营养不良等。三核苷酸拷贝数的扩增或突变发生在世代传递过程中，由于拷贝数在世代间的改变，它被称为动态突变。

目前动态突变疾病大多是些神经系统的退行性疾病，也有少数肿瘤。动态突变疾病的发现提示序列拷贝数的多态性能够成为遗传病的病因。2.多态性作为遗传标记的应用：绝大多数DNA多态性并不引起遗传病，但可作为遗传标记来使用。例如：上述提到的各种多态性标记，包括RFLP位点，微卫星和小卫星DNA标记都已广泛用于遗传病的连锁诊断。利用各条染色体上位置已知的众多的多态性标记，通过患病家系的连锁分析，可以找到多基因病的致病基因或相关基因的位置，并为他们的分离克隆提供依据。此外，在疾病的关联分析和病因学研究方面，通过比较患病群体和正常群体，可以发现两组间多态性位点的特定等位基因频率有显著差别，则表明该位点与该疾病相关联。使用多态性标记的关联分析既可以提示相关基因存在的位置，也有助于发病机理的阐明。基因多态性还可以用于疾病的分型与治疗，即根据患者疾病多态性的基因型来解释疾病的病因和临床表现。

在预防医学方面，基因多态性的研究涉及的范围广泛，包括基因多态性与病因未知的疾病关系的研究，也包括对已知特定环境因素致病易感基因的筛选。由于基因多态性有明显的种族差异，因此在基因-环境交互作用模式上，不同的种族之间有可能不同。所以，开展我国人群的基因多态性与环境的作用关系的研究具有重要的意义。而基因多态性的研究在职业病医学中则更具有实际的意义。对易感基因和易感性生物标志物的分析，将某些携带敏感基因型的人甄别开来，采取针对性预防措施，提高预防职业性危害工作的效率。对特定的污染物易感人群和耐受人群的基因多态性研究，有助于阐明环境因素的致病机制，也推动了遗传易感性标志物的研究。

四、基因多态性的检测方法：

1．限制性片段长度多态性（Restriction Fragment Length Polymorphism，RFLP）：由DNA 的多态性，致使DNA 分子的限制酶切位点及数目发生改变，用限制酶切割基因组时，所产生的片段数目和每个片段的长度就不同，即所谓的限制性片段长度多态性，导致限制片段长度发生改变的酶切位点，又称为多态性位点。最早是用Southern Blot/RFLP方法检测，后来采用聚合酶链反应（PCR）与限制酶酶切相结合的方法。现在多采用PCR-RFLP法进行研究基因的限制性片段长度多态性。

2．单链构象多态性（SSCP）：是一种基于单链DNA构象差别的点突变检测方法。相同长度的单链DNA如果顺序不同，甚至单个碱基不同，就会形成不同的构象。在电泳时泳动的速度不同。将PCR产物经变性后，进行单链DNA凝胶电泳时，靶DNA中若发生单个碱基替换等改变时，就会出现泳动变位（mobility shift），多用于鉴定是否存在突变及诊断未知突变。

3．PCR-ASO探针法（PCR-allele specific oligonucleotide, ASO）：即等位基因特异性寡核苷酸探针法。在PCR扩增DNA片段后，直接与相应的寡核苷酸探杂交，即可明确诊断是否有突变及突变是纯合子还是杂合子。其原理是：用PCR扩增后，产物进行斑点杂交或狭缝杂交，针对每种突变分别合成一对寡核苷酸片段作为探针，其中一个具有正常序列，另一个则具有突变碱基。突变碱基及对应的正常碱 基匀位于寡核苷酸片段的中央，严格控制杂交及洗脱条件，使只有与探针序列完全互补的等位基因片段才显示杂交信号，而与探针中央碱基不同的等位基因片段不显示杂交信号，如果正常和突变探针都可杂交，说明突变基因是杂合子，如只有突变探针可以杂交，说明突变基因为纯合子，若不能与含有突变序列的寡核苷探针杂交，但能与相应的正常的寡核苷探针杂交，则表示受检者不存在这种突变基因。若与已知的突变基因的寡核苷探针匀不能杂交，提示可能为一种新的突变类型。

4. PCR-SSO法：SSO技术即是顺序特异寡核苷酸法（Sequence Specific Oligonucleotide, SSO）。原理是PCR基因片段扩增后利用序列特异性寡核苷酸探针，通过杂交的方法进行扩增片段的分析鉴定。探针与PCR产物在一定条件下杂交具有高度的特异性，严格遵循碱基互补的原则。探针可用放射性同位素标记，通过放射自显影的方法检测，也可以用非放射性标记如地高辛、生物素、过氧化物酶等进行相应的标记物检测。

5. PCR-SSP法：序列特异性引物分析即根据各等位基因的核苷酸序列，设计出一套针对每一等位基因特异性的（allele-specific）、或组特异性 (group-specific)的引物，此即为序列特异性引物（SSP）。SSP只能与某一等位基因特异性片段的碱基序列互补性结合，通过PCR特异性地扩增该基因片段，从而达到分析基因多态性的目的。

6. PCR-荧光法：用荧光标记PCR引物的5’端，荧光染料FAM和JOE呈绿色荧光，TAMRA呈红色荧光，COUM 呈兰色荧光，不同荧光标记的多种引物同时参加反应，PCR扩增待检测的DNA，合成的产物分别带有引物5’端的染料，很容易发现目的基因存在与否。

7. PCR-DNA测序：是诊断未知突变基因最直接的方法，由于PCR技术的应用，使得DNA 测序技术从过去的分子克隆后测序进入PCR直接测序。PCR产物在自动测序仪上电泳后测序。常用方法有：Sanger双脱氧末端终止法;Maxam-Gilbert化学裂解法；DNA测序的自动化。目前DNA顺序全自动激光测定法是最先进的方法。

8. PCR指纹图法（PCR-fingerprints）：实用于快速的同种异型DR/Dw配型。在DR/DW纯合子及杂合子个体中，每种DR单倍型及每种单倍型组合所产生的单链环状结构的大小、数目和位置各异，由于同质双链和异质双链之间的分子构象不同。因此，在非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳时，它们的迁移率各不相同，从而获得单倍型特异的电泳带格局即PCR指纹。也有人用人工合成的短寡核苷酸片段作为探针，同经过酶切的人体DNA作Southern blot，可以得出长度不等的杂交带，杂交带的数目和分子量的大小具有个体特异性，除非同卵双生，几乎没有两个人是完全相同的，就象人的 指纹一样，人们把这种杂交带图形称为基因指纹(gene finger-printing)。

9. 基因芯片法：又称为DNA 微探针阵列（Micro array）。它是集成了大量的密集排列的大量已知的序列探针，通过与被标记的若干靶核酸序列互补匹配，与芯片特定位点上的探针杂交，利用基因芯片杂交图象，确定杂交探针的位置，便可根据碱基互补匹配的原理确定靶基因的序列。这一技术已用于基因多态性的检测。对多态性和突变检测型基因芯片采用多色荧光探针杂交技术可以大大提高芯片的准确性、定量及检测范围。应用高密度基因芯片检测单碱基多态性，为分析SNPs提供了便捷的方法。

五、肝病中的基因多态性研究现状：

1. HLA基因多态性：人类白细胞抗原（HLA）的主要功能是参与自我识别、免疫调节和对异体移植物排斥反应。现已发现70多种疾病与HLA的多态性有关，其中大多数自身免疫性疾病与HLAⅡ类基因相关。HLA基因定位于第6号染色体短臂（6P21.3），全长4000kb,包括100多个基因座位共554个等位基因系统。HLA分为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ 共3类。HLAⅡ类基因的第二外显子区核苷酸序列的高度变异性，产生了位数众多的等位基因。Ⅱ类基因包括三个亚区：HLA-DR、DQ、DP，每个亚区含两类基因A和B，HLA-DRB、DQA、DQB、DPA、DPB具有多态性，而HLA-DRA是固定不变。HLA-DRB1基因是最具多态性的基因，存在106个等位基因，尤其是外显子2处含有多达40个等位基因，最常见的有16个等位基因位点，此处含有与某些疾病的易感基因和保护基因。

1.1免疫性肝炎：最新的研究报道DRB1*0401和DRB1*0101等位基因最有可能为自身免疫性肝炎的易感基因。Donaldson等[1]在119例患者中对HLA-Ⅱ区DRB、DQA和DQB等位基因进行了研究，发现患者组编码DR52的HLA-DRB3*0101等位基因的出现频率为58%，而在正常对照组中只有25%的阳性频率（Pく0.0001）,与DR4的相关性也被证实，一个特定的等位基因DRB1*0401与自身免疫性肝炎具有高度的相关性。DRB1*0401和DRB3*0101编码HLA-DRβ链第67-72氨基酸残基，这一肽段出现在94%的自身免疫性肝炎患者，而具有这一肽段的人群自身免疫性肝炎的危险性是其他人群的9倍。

Strettell等[2]对86名自身免疫性肝炎白人患者的研究中发现，DRB1*0301是自身免疫性肝炎的易感基因，其RR=4.5(校正Pく0.0001)，证实了HLA-DRB1*0401与自身免疫性肝炎的相关性（RR=5.97，Pく0.0001），而HLA-DRB5*0101-DRB1*1501单倍型具有保护作用。在日本人群中，Ⅰ型自身免疫性肝炎HLA-DR4的出现频率明显增高，为90.3%而正常人群为38.6%，编码DR4抗原的等位基因HLA-DRB1*0405，而不是白种人中的DRB1*0401决定了自身免疫性肝炎的的易感性。此外还发现DQA1*0301和DQB1*0401与自身免疫性肝炎有较人弱的相关性，可能是由于与DRB1*0405的连锁不平衡引起。Czaja等[3]发现HLA-DRB1*0301在Ⅰ型自身免疫性肝炎者，预后差，对皮质激素疗效差，表明DRB1*0301既影响表达又影响行为。

    1.2．病毒性肝炎：Thurz等[4]报道在冈比亚人群中，HLA-DRB1*1302在乙肝短暂感染者的频率为26.6%,而DRB1*1301在持续感染者中比短暂感染者中频率更低，认为DRB1*1302与抵抗乙肝持续感染有关，为乙肝保护基因。Contrina等[5]报道DRB1*1301及*1302在急性乙肝的频率为36.4%，在慢性乙肝为13%。认为HLA影响人群对乙肝感染的易感性。研究表明在丙肝中，DRB1*0101和DQB1*0501等位基因在持续丙肝病毒清除者比慢性感染者有一个高的频率，而DRB1*03011和DQB1*0201在慢性丙肝感染者比那些病毒清除者有一个高的频率[6]。Higashi等[7]发现在DQB1*0401及DQB1*0402增加了丙肝感染者发生肝炎的危险性，而DQB1*0301及DQB1*0302则对发生丙肝有抵抗。最近Yenigun[8]报道DRB1*11等位基因频率在慢性丙肝感染患者明显下降（22.4 versus 51.0%; P < 0.01），认为DRB1*11等位基因是慢性丙肝感染的一个保护因素。虽然这些研究结果不一致，甚至相互矛盾，但都提示宿主的免疫遗传易感因素可能对肝炎病毒感染及肝炎的发生发展起着重要的作用。

1.3．肝纤化：Hirayama等[9]采用PCR-SSO法研究了日本血吸虫后肝肝纤化HLA-DRB1的基因型变化，发现没有单一的等位基因归因于肝纤化的易感性或抵抗，但发现三组等位基因显示频率下降或上升，易感等位基因DRB1*1202、*1404及*1405在第86位拥有氨基酸残基为缬氨酸，而抵抗等位基因DRB1*1101、*0409及*0701在86位拥有氨基酸为甘氨酸。认为在第86位的甘氨酸-缬氨酸二态性影响P1抗原结合槽P1袋的深度，这种HLA分子的二态性氨基酸影响日本血吸虫感染后慢性并发症的易感性或抵抗。在Hirayama等[10]另外的一篇报道则认为DRB1*1501等位基因与日本血吸虫后肝肝纤化抵抗有关。

1.4．肝硬化： 研究表明肝硬化病人HLA-DR3、B35抗原频率显著升高，病毒的感染可能与机体本身的遗传因素关系明显，而感染后疾病的发展过程及肝硬化的发生则与疾病的易感性有关。HLA-Ⅱ类基因的多态性与其易感性的关系已有文献报道。Aikawa等[6]采用PCR-RFLP等方法研究了67例慢性丙肝后肝硬化患者，发现等位基因DRB1*0405和DQB1*0401的频率明显升高，前者为43%，后者为22%。而等位基因DRB1*0901和DQB1*0303的频率下降，都达11%。Higashi等[7]报道在丙肝后肝硬化患者，DQB1*0401及DQB1*0402的频率是增加的，而DQB1*0303及DQB1*0301的频率是下降的，在HLA-DR4和DQB1*0401或*0402之间，及HLA-DR9与DQB1*0303之间存在强烈的连锁不平衡，认为HLA区存在丙肝后肝硬化的易感基因。Underhill等[11]报道在原发性胆汁性肝硬化中等位基因DQB1*0402的频率明显增加（11% vs 4%，相对危险性=3.3 p﹤0.01）。Tillman等[12]采用PCR-SSO方法研究了丙肝后肝硬化患者HLA基因的多态性，结果发现HLA-DRB1*11、DQB1*03等位基因的频率比正常人组明显下降，认为这两个等位基因降低的了产生丙肝后肝硬化的危险性，可能为抵抗基因。越来越多的研究表明免疫遗传背景与肝硬化相关。

    1.5．肝癌： Donalson等[13]研究了123例香港中国人原发性肝癌患者的HLA-DRB1、DQA1、DPB1基因的多态性，发现DRB1*1501、DQA1*0102、DPB1*0501等位基因的频率显著性升高，而DQA1*03、DPB1*0201、DRB1*0302的频率显著下降，但经统计学处理无显著性意义[12]。Li PK也用RFLP等方法研究了肝癌患者MHC基因的多态性，结果发现HLA-DR、DQ位点的等位基因多态性与肝癌无关。以上的这些研究表明，对HLA免疫相关基因的多态性的研究可能获得肝病的易感基因，从而为肝病的预防和治疗提供理论基础和新方法。  

2.细胞因子基因的多态性：

细胞因子的级联放大效应调节体液免疫和细胞免疫。免疫调节细胞因子：白细胞介素（IL-2），γ干扰素（INF-γ），肿瘤坏死因子α（TNF-α），构成Ⅰ类细胞因子（Th1）。而IL-4，IL-5，IL-6，IL-8，IL-10，IL-13 构成Ⅱ类细胞因子（Th2）。Th1类细胞因子与细胞免疫，清细胞内细菌及病毒的调节有关，抑制B细胞的激活，有助于迟发型超敏反应，增强细胞介导的细胞毒效应部分增强单核细胞MHCⅡ类抗原的表达。Th2类细胞因子与体液免疫有关，激活B细胞刺激抗体的产生，抑制抗原提呈细胞介导的抗原特异性T细胞增殖，增强B细胞MHCⅡ类抗原的表达，下调单核细胞MHCⅡ类抗原的表达。Th1 和Th2类细胞因子的免疫刺激和抑制效应，彼此相互调节，在正常条件下，他们精细调节机体的免疫应答。研究发现细胞因子基因的多态性与肝病的易感性及其进展预后相关。

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    2.1．肿瘤坏死因子α基因多态性（TNF-α）：它是炎症应答中关键性的细胞因子, 可以诱生TNF自身及白细胞介素（IL）-1、IL-6等其他细胞因子，增加HLA-Ⅰ、Ⅱ类抗原表达，促进B、T细胞增殖及免疫球蛋白的合成，具有广泛的诱导炎症和免疫调节功能。在肝坏死性炎症、纤维形成、发展为肝硬化门脉高压的过程中起着重要的作用。该基因定位于6p21.3。已发现肿瘤坏死因子α有多个多态性位点，即-308G→A，-238、-376、-163、+70G→A，多个微卫星等位基因。启动子-308处为G时定义为TNF1，为A时定义TNF2。TNF2与TNF-α基因的转录活性有关，导致高而持续的诱导水平的TNF-α，依次高的TNF-α可抑制IL-2的产生，从而降低血浆IL-2的水平。

Czaja等[3]报道TNFα基因-308位点A替代G的多态性在Ⅰ型自身免疫性肝炎患者比正常对照者更常见。此外，TNFα基因-308位点A替换的病人比没有这种替换的病人更年轻，具有HLA-DRB1*0301和A1-B8-DRB1*0301单倍型更常见，具有A替换的个人在用皮质激素治疗期很少进入缓解期，治疗失败的发生率更常见，尤其是A的替换是纯合子时进展到肝硬化更常见。Yee等[14]报道在30例慢性丙肝后肝硬化患者TNFα的多态性，发现TNFα（-308A）患肝硬化的危险性高5.1倍,认为TNFα的多态性与慢丙肝组织学严重程度相关。Tanaka等[15]研究了71例原法发性胆汁性肝硬化病人，发现TNF1/TNF1纯合子的频率为78%，TNF1/TNF2杂合子为19.7%，TNF2/TNF2纯合子为1.4%，认为TNF2等位基因与疾病的临床进展有关。

2.2．IL-1基因多态性：IL-1基因家族定位于2q13，编码3种蛋白，包括IL-1α、β及IL-1RA（受体拮抗剂）。IL-1RA与IL-1β竟争结合IL-1受体，且为IL-1活性强列抑制剂。IL-1β基因有四个核苷酸替代，但仅有一个TaqI限制内切酶多态性，位于外显子5的+3953，少见的等位基因2（IL-1β*2）与IL-1β分泌增多有关。IL-1RA在内含子2处有一个可变数目串联重复序列。Donaldson等[16]报道在原发性胆汁性肝硬化患者IL-1B*1.1的频率升高，而IL-1B*1.2和*2。2的频率下降，IL-RN*1.1的频率较高，IL-1RN*2的频率低，在原发性胆汁性肝硬化患者早期IL-1B*1.1的频率分布明显不同，而IL-1RN则在原发性胆汁性肝硬化患者早期及晚期的频率类似，认为IL-1基因的多态性是原发性胆汁性肝硬化的易感性和进展的标志。Takamatsue等[17]研究了142 例酒精性肝硬化患者IL-1B基因启动子-511和外显子5的多态性，发现IL-1B-511等位基因2的携带者在酒精性肝病者显著高于非酒精性肝病者，外显子5处等位基因2在非酒精性肝病者显著高于酒精性肝病者，认为IL-1B基因多态性与日本饮酒者酒精性肝病的发生有关。最近Wang Y报道[18]在IL-1基因多态性与丙肝后肝癌的相关性研究中发现IL-1β-31 T/T 或-511/-31C-T单倍型与日本丙肝病毒感染者发生肝癌相关。

2.3．IL-10基因多态性：IL-10是一个重要的抑制因子，抑制抗原特异细胞的活化、增生，降低单核细胞的提呈能力，及下调HLA-Ⅱ类分子和B7在它们的表面表达。IL-10也发挥潜在的抗炎效应，也发挥抗纤维化效应，在肝脏通过抑制胶原基因的转录，增加肝星状细胞胶原表达。IL-10基因敲除小显示增加肝纤维化，中性粒细胞浸润。IL-10基因定位于1q32，在转录起始部位上游-1117，-854，-625处有3个单碱基替换，2个微卫星位点（IL-10G和IL-10R，位于上游1.2kb 和4kb处），在健康者 -1117处A和G出现有类似的频率，而在-627处C→A的替换发生频率为21-23%，在-854处C→T替换是完全连锁不平衡，在-627*A等位基因和IL-10R及IL-10G等位基因之间存在着连锁。至今为止的报道，3个碱基替换只产生三个不同的单倍型GCC、ACC、ATA。间接的证据表明IL-10基因表达的这三个多态性与疾病相关。Cookson等[19]报道Ⅰ型自身免疫性肝炎IL-10启动子-1082、-819、-592三个位点的多态性，结果病例组与对照组等位基因频率分布无限制差异。Grove 等[20]研究了107例重度饮酒者IL-10启动子两个碱基替换的多态性，即-627C→A、-1117A→G，结果发现在50%过度饮酒者-627处至少有一个A等位基因，在过度饮酒者-1117处A等位基因稍多些，认为IL-10启动子-627处A等位基因携带者与增加饮酒者晚期肝病发生的危险性。

2.4．转化生长因子β基因多态性（TGFβ）：TGFβ是细胞因子大家族中的一员，有三种异构体（TGFβ1、2、3），其生物学特性类似。TGFβ可抑制培养的血管平滑肌细胞的增生和迁延，并可诱导胶原基因的表达和刺激前纤维蛋白溶酶激活抑制剂的产生。已发现TGFβ1基因有几个多态性[21]，在5’端区域-1827（C→A），-1639（G→A），-1348（C→T），-769（C插入），外显子1的29位T→C，外显子1的74位G→C，在内含子4处-8到713位的C缺失，及外显子5的788处C→T的多态性, Gewaltig J等[22]报道在TGF基因-800G>A、-509C>、Leu10Pro、Arg25Pro多态性与慢性丙肝的相关性研究中发现密码子25处的ArgPro 杂合子基因型比纯合子基因型在慢性丙肝患者发展为肝纤维化的速度更快，密码子10处的 LeuLeu纯合子基因型显示慢速的肝纤维化。

2.5.CD14基因多态性：CD14可调节活化的枯否氏细胞释放炎性前细胞因子。该基因定位于染色体，已发现CD14启动子区域-159处C→T的多态性。Jarvelainen HA等[23]研究发现在酒精性肝病患者中，CD14启动子-159处等位基因的频率CC为0.34，CT为0.51，TT为0.16，T等位基因与酒精性肝病的进展相关，尤其与肝硬化相关，认为T等位基因是酒精性肝损害的危险因素，尤其是TT纯合子产生肝硬化有一个更高的危险性

3.肝癌有关基因的多态性：

癌基因（oncogene,onc）是细胞内控制细胞生长的基因，在异常表达时，这些基因不受体内各种调节因素的影响，可持续表达，或过高表达，其产物可使细胞持增殖，癌基因的突变缺失使原癌基因产物的功能改变。抑癌基因(antioncogene)是一大类可抑制细胞生长并具有潜在抑癌作用的基因，当它失和后，可能使癌基因充分发挥作用而导致癌的发生和发展。抑癌基因突变、缺失使表达异常，会使细胞增殖失控发展成癌症。肝癌的发生不仅与癌基因的异常表达有关，而且与抑癌基因的失活有关而。癌基因、抑癌基因的多态性导致癌基因的异常表达或失活。

3.1. P53基因多态性：P53基因为抑癌基因，定位于17q12-13.3。蛋白产物为核蛋白及反式因子含357个氨基酸。它的表达急磷酸化与细胞周期相关，还可抑制c-myc表达及功能。P53基因具有多态性，已发现P53 基因外显子4处密码子72位存在CGC→CCC的多态性，导致P53Arg→P53Pro的改变。在外显子5处密码子156、157位存在T的插入，密码子136、313位有两个突变为沉默多态，密码子245、273位有错义突变，导致Ser替代 Gly，及His替代 Arg。在外显子7处密码子249位AGG→AGT的错义突变，导致P53 Arg→Ser的改变，此突变最为常见。

Okada F等[24]研究了75例丙肝病毒感染者P53基因的这一多态性改变，发现病例组与对照组P53 基因多态性频率无显著差异，但在男性丙肝最常见的基因型1b者P53Pro纯合子的频率显著高于对照组，而在丙肝其他基因型2a、2b中与P53基因多态性的频率之间未发现明显的统计学差异。认为男性P53Pro纯合子与丙肝1b型感染存在显著的相关性。Katiyar[25]等报道在HCC病人中除249位G→T突变外，还发现250位的C→T转换，与对照组进行比较后，认为在HCC中P53突变频率低与高频HBV感染有关，提示P53基因的多态性在HCC的发展中可能不起直接的作用。

3.2．P16基因多态性：该基因定位于9p21,它编码分子量为16kD的蛋白质，故称为P16。P16可与周期蛋白依赖性激酶4（CDK4）结合，并抑制CyclinD/CDK4的活性。P16基因的突变、缺失或表达异常，会使细胞增殖失控，发展成癌。研究发现P16基因外显子2处密码子61位存在G→T转换，导致形成终止密码子（GAG →TAG），外显子3存在一个纯合子缺失，及错义突变，两个微卫星多态（D9S125，D9S168）[26]。Matsuda Y等[27]采用SSCP等方法研究原发性肝癌患者P16基因的变化，发现5’CpG岛的甲基化为62.5%，纯合子缺失频率为10.4%，错义突变的频率为6.3%，认为纯合子缺失及错义突变、甲基化等变化致P16基因失活，在原发性肝癌中发挥重要的作用。

4.毒物代谢酶基因的多态性：

外源性化学物质的体内生物转化，依靠肝脏的毒物代谢酶来完成。这些酶可分为一相酶和二相酶。一相酶主要有细胞色素P450（cytochrome P450,CPY），二相酶主要有葡萄糖醛酸转移酶(UPD-glucuronosyltransferase,UGT)，谷光甘肽 -S-转移酶(glutathione-S- transferase,GST)，N-乙酰化转移酶(N-acetyltransferase,NAT)，环氧化物水解酶(epoxide hydrolase,EH)等。一相酶通过氧化、还原和水解作用，改变化学物质所具有的功年或使其分解。二相酶催化外源性化学物质与某些强极性基因如甲基、乙酰基、葡萄糖醛酸和谷光甘肽等发生结合反应，从而使其极性或水溶性增强，有利于随尿或胆汁排出。然而，外源性化学物质经生物转化后，毒性并不都是减弱，有的毒性反而增强。

4.1．一相代谢酶基因多态性：细胞色素P450-2E1（CYP2E1）是细胞色素P450家族的一个主要成员，主要在肝脏表达。它能够被乙醇诱导活化，参与亚硝胺、乙醇、苯和CCL4等小分子物质的代谢。该基因或酶活性的改变，将影响它们对机体的毒性和致癌性。CYP2E1基因定位于10q24.3-ter，长11.4 kb,含9个外显子。已证明CYP2E1基因位于第6内含子的DraⅠ和5’端非编码区的RsaⅠ/PstⅠ位点的多态性影响CYP2E1的表达。Yoshiko等[28]应用RFLP技术研究了82例男性日本嗜酒者的P450-2E1的多态性，发现在20例酒精性脂肪肝，62例酒精性肝纤维化或肝硬化患者存在3种基因型，杂合子（B型c1/c2，两个纯合子（A型 c1/c1 ，C 型c2/c2），纯合子（c1/c1）在肝肝纤维化组的频率显著比非肝纤维化组的频率要高，结果提示酒精性肝硬化的易感性与P450-2E1基因的RsaI 和PstI多态性有关，Yu等[29]对台湾人的研究发现，具有A等位基因型者患肝癌的危险性是C基因型和B 基因型的者的2.9倍，提示RsaⅠ多态与肝癌存在关联，还发现同为A基因型，吸烟者较不吸烟者发生肝癌的危险性更高（OR值为24.3），对于习惯性饮酒者，携带 c2等位基因可增加其患肝癌的危险性。

4.2．二相代谢酶基因多态性：谷光甘肽-S-转移酶（GST），能催化谷光甘肽与多种亲电子底物结合，包括苯并芘，亚硝胺类化合物，卤代烃，AFB等，研究最多的是GSTM家族，定位于1p13.3，其中GSTM1有GSTM1a、1b、null 3个等位基因，GSTM1空白基因型与肝癌的发生有关[30]。N-乙酰化转移酶（NAT），能催化大量芳香胺类致癌物的灭活和活化，该基因定位于8p21.1-23.1。编码的蛋白质包括NAT1和NAT2及NATP3。已发现NAT1及NAT2基因具有多态性，但其意义不明[31]。对环氧化物水解酶（EH）研究最多的是微粒体环氧化物水解酶（mEH），该基因定位于1p11-qter,由9个外显子和8个内含子构成，Hasseff等发现了人群中的两个频发突变位点，113位和139位，这两个突变通过改变酶蛋白的稳定性而影响EH酶的活性，分别使EH活性下降40%和升高25% [32]。

5.乙醇代谢酶基因多态性：

乙醇摄入体内后90%-98%在肝脏代谢。其代谢途径主要有4条：乙醇脱氢酶（ADH）乙醇氧化体系，微粒体乙醇氧化体系，NADPH氧化酶-过氧化氢体系和黄嘌氧化酶-过氧化氢酶体系。其中以前两种途径最为重要。在正常情况下，低血浓度的乙醇主要经乙醇脱氢酶（ADH）乙醇氧化体系代谢，在长期饮酒时其高血浓度的乙醇则主要经微粒体乙醇氧化体系代谢。ADH乙醇氧化体系包括两种酶：乙醇脱氢酶（alcohol dehydrogenase，ADH）和乙醛脱氢酶（aldehyde dehydrogenase ，ALDH），ADH催化乙醇脱氢生成乙醛，乙醛进一步在ALDH的催化下脱氢生成乙酸。微粒体乙醇氧化体系主要由细胞色素P450（cytochrome P450,CYP450）家族组成，而在乙醇代谢中起主要作用的是CYP2E1，它受乙醇诱导并参与乙醇代谢。

5.1．乙醇脱氢酶（ADH）的多态性：

ADH是由20多个同工酶组成的大家族，常见的主要有5种，即ADH1-5。根据其催化性能可将其分成3型：Ⅰ型包括ADH1-3，Ⅱ型为ADH4，Ⅲ型为ADH5。对乙醇代谢起主要作用的是ADH1-3。ADH基因定位于4q21-25。ADH1-3基因在染色体上相邻近，组成一个约80kb的族群，3个基因间存在高度同源性，它们的长度约15kb，而且匀包含9个外显子。已发现ADH2和ADH3存在基因多态性现象。      

5.1.1．ADH2基因多态性：ADH2位点 ADH2*1为野生型等位基因，在其第3外显子发生G143A点突变后，形成ADH2*2，ADH2*3则是ADH2*1第9外显子发生T1107C点突变所致。ADH2*1发生点突变形成ADH2*2和ADH2*3后，在这两个突变型等位基因中分别形成MaeⅢ 和AluⅠ的酶切位点，因而可用这两种限制酶分别对其进行检测。ADH2*3在白种人和中国人中的等位基因频率很低，均小于5%。因此，ADH2主要涉及ADH2*1和ADH2*2两种等位基因，ADH2*2/*1、ADH2*1/*2、ADH2*2/*2基因型。在欧美白种人中ADH2*1的等位基因频率在85%以上。而在亚洲人中则ADH2*2等位基因的频率在85%以上。野生型的ADH2*1是无活性的，而突变型的ADH2*2则具有ADH活性。所以亚洲人饮酒后易使乙醇代谢为乙醛而发生脸红，头晕等反应。研究表明ADH2的基因多态与日本人是否发展成为酗酒者有关，ADH2*1/*1基因型在酗酒者中的频率远高于健康对照（P﹤0.001）；而在酗酒者中，ADH2*2/*2基因型者发生肝硬化的危险性更高，比值比（odds ratio,OR）为4.6[33]。

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5.1.2．ADH3基因多态性：用限制性内切酶SspⅠ消化ADH3基因第8外显子，发现ADH3位点存在野生型的ADH3*1和突变型ADH3*2（G1048A）两种等位基因，分别编码γ1和γ2两种亚单位，形成3种基因型，包括快代谢型ADH3*1/*1与慢代谢型ADH3*1/*2和ADH3*2/*2。ADH3*1在欧美白种人中的等位基因频率为50%-60%，在黑人中为85%。而在亚洲人中高达95%，存在着明显的种族差异。ADH3多态与饮酒方式有关，携带ADH3*2慢代谢等位基因的个体易产生酒精依赖，导致酒精中毒。Day等[34]的研究显示，ADH3*1的频率在对照组为55.1%，肝硬化组为62.7%，其差别无统计学意义（P＞0.05）。最近Frenzer A等[35]报道ADH3*2/*2 及 ADH2*1/*1等位基因与酒精性肝硬化及酒精性胰腺炎相关。.

5.2．乙醛脱氢酶（ALDH）的多态性：

已发现ALDH有12种同工酶，常见的有4种，分别定位于不同的染色体的4 个基因编码。定位于12号染色体的ALDH2是线粒体ALDH的主要编码基因，ALDH2是乙醛的主要代谢酶，与60%以上的乙醛代谢有关，在ALDH2的第12外显子存在限制性内切酶MboⅡ的多态位点，从而形成野生型的ALDH2*1和突变型的ALDH2*2（G1510A）两种等位基因。基因型为ALDH2*1/*1者具有ALDH酶活性，而基因型为ALDH2*1/*2和ALDH2*2/*2者，因饮酒后可使乙醛氧化为乙酸延迟而被认为不具有ALDH酶的活性。在朝鲜人中ALDH2*1和ALDH2*2的频率分别为0.84和0.16。在日本人中，则分别为0.73和0.27，大约50%为无ALDH2活性的ALDH2*1/*2和ALDH2*2/*2基因型，而在白种人中ALDH2*2的频率很低[36]。在中国和日本的酗酒者中，ALDH2*2的频率明显低于非酗酒者，而在酗酒者中，ALDH2*1/*2可能是酒精性肝病的危险因素[37]。

六．结语：

基因多态性的研究是目前国内外学术界科研的热点。本文就与肝病有关的一些较常见的基因的多态性进行了总结，从中可窥出肝病与基因多态研究最新进展情况。基因芯片等新技术的出现，研究基因多态性的方法更加方便、简单。随着与肝病有关的基因新的多态性位点被发现，基因多态性与肝病相关性研究的更加深入广泛，论文也会越来越多。其目的在于通过对肝病相关基因多态性的研究，不仅可以从遗传学的角度在分子水平阐明肝病的发病机理，而且还可以为肝病的预防、判断预后及基因治疗提供理论依据和新思路。

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作者单位：430030 华中科技大学附属同济医院肝病研究所

金错刀

不过基因多态性加大了治疗难度。呵呵。