有关基因疗法

天狼星

美国国家癌症研究所关于基因治疗的问题和解答

2001-6-7

  


1、 什么是基因？

基因是遗传的生物学单位。基因决定了生物的外显特征，例如头发和眼睛的颜色；更多的微妙特性，例如血液携带氧的能力；以及一些复杂的特征，例如受到多个基因和环境的共同作用后的物理表征。

基因是脱氧核糖核酸（DNA）分子的组成部分。人类大约有40000－50000个基因。基因携带了指导细胞产生特殊蛋白质例如酶的指令。只有在特定的阶段，细胞中的某个基因才会被激活。细胞中某些基因是否被激活决定了蛋白质的组成，从而决定了细胞的类型及功能。基因的异常将导致疾病产生。

2、 什么是基因治疗，它的目的是什么？

对基因的理解和操控技术的发展使科学家有能力改造患者的遗传物质，抵抗或防止疾病。基因治疗是一种实验性的医学干涉，包括改造活细胞中的遗传物质以抵抗疾病。基因治疗技术仍处于试验阶段，许多类型的癌症和其他疾病的研究处于临床实验阶段。

基因治疗的目标之一就是向细胞提供已缺失或改变的基因的正常拷贝。它不是向患者提供药物，而是通过改变患者细胞的遗传结构来纠正错误。用这种方法可以医治多种疾病，例如囊性纤维化和血友病。

基因治疗也能用作研究细胞功能的改变，例如通过刺激免疫系统细胞来攻击癌细胞或通过引入艾滋病毒抗性来治疗艾滋病。

3、 如何将基因转移到细胞中？

一般说来，不能将基因直接插入人类细胞中，必须用载体将其运送到细胞中。基因治疗中最常用的载体是病毒。科学家使用病毒是因为它们能插入细胞的DNA。在基因治疗中使用的病毒载体是有缺陷的：它们不能自我复制从而不具感染性。

大多数基因治疗临床试验用小鼠逆转录病毒运送目的基因。其他病毒载体还包括腺病毒，腺伴随病毒，痘病毒和疱疹病毒等。

4、 什么是逆转录病毒，如何在基因治疗中安全地使用它们？

逆转录病毒的遗传物质是核糖核酸（RNA）而不是脱氧核糖核酸（DNA）。逆转录病毒能产生逆转录酶，因此能将自己的RNA反转录为DNA，成为宿主DNA的一部分。

逆转录病毒有很多种，其中有些会导致艾滋病或其他疾病。在基因治疗中，科学家抑制逆转录病毒的某种活性，防止它们引起疾病，使之能被安全地使用。这使科学家能利用逆转录病毒的特性将目的基因运送到宿主DNA中。

除了使用逆转录病毒作为治疗的基础外，研究人员也利用逆转录病毒运送能使癌症细胞对抗生素敏感的基因。

5、 基因治疗的基本步骤是什么？

在大多数基因治疗的临床试验中，来自患者血液或骨髓的细胞在实验室中培养。这些细胞被暴露在带有目的基因的病毒中。病毒进入细胞后，目的基因就成为宿主细胞DNA的一部分。这些细胞在实验室培养后，通过静脉注射重新回到患者体内。这类基因治疗被称为ex vivo，就是"体外"的意思。基因是被运送到患者细胞中，但这些细胞存在于患者体外。

在其他研究中，载体或脂质体被用于将目标基因运送到患者体内的细胞中。这种基因治疗被称为"体内"。

6、 第一个使用基因疗法进行治疗的疾病是腺苷脱氨酶（ADA）缺乏症。这是什么样的疾病，为什么选择它作为治疗的目标？

ADA缺乏症是一种罕见的遗传病，患者没有正常的ADA基因，他们的缺陷基因不能产生功能性ADA酶。ADA缺乏的孩子一出生就有严重的免疫缺陷，十分容易受感染，有生命的危险。虽然ADA缺乏症能用PEG-ADA治疗，但这种药物十分昂贵（一年要花60000美元），而且必须通过静脉注射来维持生命。

ADA缺乏症被选为第一个基因治疗试验有以下几点原因：

这种疾病是由单个基因的缺陷导致的，基因治疗成功的可能性高 ；基因调控很简单，"总是开启"的状态，不像许多其他基因，调控很复杂 ；ADA的数量无需精确调控。即使很少量的酶也能受益，即使数量很多也能忍受。

第一个基因治疗临床试验在1990年9月开始。两个诊断为ADA缺乏症的儿童接受了这项新治疗。为了以防万一，他们也继续接受每周剂量的PEG-ADA。在接受了基因治疗后，孩子的免疫状况有所改进；但是效果仅能保持几个月，因此在未来的2到3年内必须一直接受治疗。接受基因治疗后，这两个孩子接受了定期测试，以证明重新改造的细胞是否还存活，是否产生ADA酶。同时两个孩子都接受小剂量的PEG-ADA以控制病情的发展。

7、 基因治疗如何应用于癌症治疗？

癌症的基因治疗研究中，研究人员希望基因治疗能改进机体自发抵抗疾病的能力或使癌细胞对其他治疗例如化疗更敏感。以下是一些基因治疗相关技术：

用基因的"工作"拷贝代替缺陷基因或未激活的基因。例如这项技术能被用于恢复缺陷基因（例如p53）的能力来抑制或阻断癌细胞的发展。

将能使细胞对抗癌药物更敏感的基因注射入癌细胞中。科学家希望药物治疗能杀死仅包含药物敏感性基因的细胞。

将多药物抗性（MDR）基因引入干细胞（骨髓中能产生血细胞的细胞）。MDR基因能使干细胞对高剂量抗癌药物的副作用有更多的抗性。

8、 现有基因治疗试验存在的危险是什么？

病毒通常能感染多种细胞。因此如果使用病毒载体运载基因，它们可能会更多地改变目标细胞。另一个危险是新基因插入DNA的位置可能出现错误，导致癌症和其他损伤的产生。

另外，如果DNA直接注射入肿瘤中，或利用脂质体运输系统，这些DNA将被非目的性的引入复制细胞中，产生遗传变化的可能性很小。

其他危险还包括，转化基因"过表达"，产生过多的缺失蛋白，导致损害；病毒载体产生炎症或免疫响应；患者可能将病毒传播给其他个体或传播到环境中。

然而，科学家利用动物测试和其他防范措施，在进行人类临床试验前确定和避免这类危险。

9、 在基因治疗作为治疗疾病的常见技术前科学家必须克服的问题有哪些？

科学家需要确定一种更简单有效的方法运送基因。为了有效地用基因疗法治疗癌症，艾滋病和其他疾病，研究人员必须发展一种能直接注射入患者体内的载体。这些载体必须针对目标细胞（例如癌细胞），成功地将目的基因结合到这些细胞的DNA中。

其他所需的特征有：必须将基因运送到患者DNA的正确位置（消除致癌的危险），并确保移植的基因能被机体正常的生理信号所调控。

虽然科学家们正努力克服这些困难，但要预测这些障碍何时被克服是不可能的。

10、如何批准基因治疗试验？

基因治疗试验计划或草案必须至少由两个科学机构严格审核。基因治疗草案也必须由美国食品和药物管理局（FDA）批准。另外，试验也可接受国家健康研究中心重组DNA顾问委员会的资助。

11、这个过程为何需要这么多步骤？

任何用于人类的研究都必须经过严格的审查。特别是基因治疗，它是一种十分有潜力的技术，有深远的意义。这些因素使科学家特别关注基因治疗的防范措施。

12、围绕人类基因治疗有哪些社会和伦理的问题？

这样的技术能很好地发展，但是如果轻率地使用的话，它们也会产生巨大的危害。

基因治疗能纠正遗传缺陷，治愈威胁生命的疾病。未来基因治疗技术会变得更简单，更易实施，但需要处理更多复杂的问题。

第一个问题就是关于改变人类卵细胞或精子遗传结构的可能性，被复制的细胞会将基因遗传给下一代。（因为这些复制的细胞被称为生殖细胞，因此这类基因治疗也被称为生殖系治疗）。另一个问题是关于提高人类的潜能，例如通过遗传干涉改善记忆和智力。

虽然生殖系基因治疗和遗传性能力提高有这样的潜在好处，但许多科学家对这些过程所涉及的问题仍忧心忡忡。生殖系基因治疗会永久地改变某个个体后代的遗传结构。因此人类基因库将会受到永久的影响。虽然这样的改变也许是好的，但一旦发生技术或判断上的错误将会导致大范围的影响。因此生殖系基因治疗没有获得NIH的批准。

关于遗传性提高，科学家担心这样的操作会成为富人和有权者奢侈的享受。一些人也担心广泛使用这项技术将导致对"正常"这个概念的重新定义。另外还有一些人利用这种操作滥用"优生学"这个概念，或通过筛选培养来改进遗传学性质。

13、如何解决这些社会和伦理问题？

科学家完成的人类基因组计划，大家公认此项计划获得的信息对于个体，家庭和社会都有深远的影响。伦理，法律和社会影响计划（ELSI）于1990年建立，旨在确定，分析和解决人类遗传学研究所带来的伦理，法律和社会问题。这样，各类问题能在这些科学性信息成为标准的健康卫生惯例前被确定和解决。

[此贴子已经被作者于2004-3-6 1:27:29编辑过]

天狼星

德

[此贴子已经被作者于2004-3-6 1:35:36编辑过]

天狼星

基因治疗的概念

2001-6-7

  


基因治疗是指将人的正常基因或有治疗作用的基因通过一定方式导入人体靶细胞以纠正基因的缺陷或者发挥治疗作用，从而达到治疗疾病目的的生物医学新技术。基因是携带生物遗传信息的基本功能单位，是位于染色体上的一段特定序列。将外源的基因导入生物细胞内必须借助一定的技术方法或载体，目前基因转移的方法分为生物学方法、物理方法和化学方法。腺病毒载体是目前基因治疗最为常用的病毒载体之一。基因治疗的靶细胞主要分为两大类：体细胞和生殖细胞，目前开展的基因治疗只限于体细胞。基因治疗目前主要是治疗那些对人类健康威胁严重的疾病。包括：遗传病（如血友病、囊性纤维病、家庭性高胆固醇血症等）、恶性肿瘤、心血管疾病、感染性疾病（如AIDS、类风湿等）。 　

广义的基因治疗是指利用基因药物的治疗，而通常说的狭义的基因治疗是指用完整的基因进行基因替代治疗，一般用DNA序列，主要的治疗途径是体外（ex vivo）基因治疗，即在体外用基因转染病人靶细胞，然后将经转染的靶细胞输入病人体内，最终给予病人的疗效物质是基因修饰的细胞，而不是基因药物。除间接体内法外，还可以用基因药物进行直接体内途径治疗，这些基因药物可以是完整基因，也可以是基因片段（包括DNA或RNA）；可以是替代治疗，也可以是抑制性治疗（包括DNA转录水平和mRNA翻译水平）。基因药物不但可用于治疗疾病，而且可用于预防疾病。这类基因药物治法简单易行，发展迅速，新型基因药物不断产生。从1990年转移ADA基因到现在的大部分基因治疗临床试验都是体外基因治疗，先从病人体内获得某种细胞（例如T淋巴细胞），进行培养，在体外完成基因转移后，筛选成功转移的细胞扩增培养，然后重新输入患者体内。这种方法虽然操作复杂，但效果较为可靠，称其为。同时，科学家们又千方百计设计出更加简便的基因治疗方法。例如，1994年美国科学家利用经过修饰的腺病毒为载体，成功地将治疗遗传性囊性纤维化病的正常基因cfdr 转入患者肺组织中。这种直接往人体组织细胞中转移基因的治病方法叫做体内（in vivo）基因治疗。

外源基因只有整合到染色体中，变为其中一部分才有可能得到持续的高表达。因此，采用什么样的手段将精心挑选的功能基因送到体内，穿过细胞膜，进入细胞核与染色体整合，这是基因治疗成败的关键。无论是体内（in vivo） 还是体外（ex vivo）基因转移都需要一种安全、无毒的工具来携带外源基因进入细胞内，这种工具被称作载体（vector）。科学家们发现，病毒侵染人体细胞时能将自身的基因组携带到细胞内，并利用人体细胞内物质完成自身繁殖，最终导致人类疾病。利用这一特性，科学家将病毒基因组中与致病相关的基因去掉，保留其携带基因组进入人体细胞的功能，再组装上理想的外源基因，即成为一种病毒载体。这样经过遗传修饰的病毒载体不能在人体细胞内复制，更不会致病，只可能将外源治病基因带入人体细胞内。目前，世界各国对病毒载体的研究较广泛，绝大多数临床试验都运用了这种方法。

方法介绍：

1 基因疫苗

基因疫苗指的是DNA疫苗，即将编码外源性抗原的基因插入到含真核表达系统的质粒上，然后将质粒直接导入人或动物体内，让其在宿主细胞中表达抗原蛋白，诱导机体产生免疫应答。抗原基因在一定时限内的持续表达，不断刺激机体免疫系统，使之达到防病的目的。 　

1.1　基因疫苗的免疫方法 　

　　基因疫苗的免疫方法即基因疫苗的给药途径，目前使用的方法有以下几种： 　

　　1）裸DNA直接注射：将裸质粒DNA直接注射到机体的肌肉、皮内、皮下、粘膜、静脉内。这种方法简单易行。 　

　　2）脂质体包裹DNA直接注射：包裹DNA的脂质体能与组织细胞发生膜融合，而将DNA摄入，减少了核酸酶对DNA的破坏。注射途径同裸DNA直接注射。 　

　　3）金包被DNA基因枪轰击法：将质粒DNA包被在金微粒子表面，用基因枪使包被DNA的金微粒子高速穿入组织细胞。 　

　　4）繁殖缺陷细菌携带质粒DNA法：选择一种容易进入某组织器官的细菌，将其繁殖基因去掉，然后用质粒DNA转化细菌，当这些细菌进入某组织器官后，由于不能繁殖，则自身裂解而释放出质粒DNA。

1.2　基因疫苗的优越性与问题 　　

　　基因疫苗被称之为第三代疫苗，自1993年问世后，在短短的5年中发展迅速。它与传统的疫苗相比，具有以下显著的优越性： 　

　　1） 抗原基因在体内持续表达产生抗原，不断刺激机体免疫系统产生长程免疫，免疫效果更可靠。 　

　　2） 对于易变异的病毒，可以选择各亚型共有的核心蛋白保守DNA序列作基因疫苗，产生跨株系的免疫保护反应，从而避免易变异病毒产生的免疫逃避问题。 　　

　　3） 一个质粒可插入多个抗原基因，即组成多价基因疫苗，故一种基因疫苗可免疫多种疾病。

　　4） 基因疫苗具有减毒活疫苗的免疫原性，但不会存在活疫苗的毒力回升的危险。 　

　　5） 基因疫苗的质粒DNA无免疫原性，不会像重组疫苗那样诱发针对载体的自身免疫反应，故可重复使用。另外，基因还不会受机体已有抗体的影响，可用于带母体抗体的婴儿。 　　

　　6） 对于毒性大、危险的病毒，以及难以提取抗原的疫苗，基因疫苗的制备相对安全，容易得多。

　　7） 基因疫苗制备简单，容易大量生产，且成本低。质粒DNA非常稳定，易于贮存和运输。

　　8） 使用方便，可以经多种途径给药，不需免疫佐剂等。 　

　　基因疫苗作为一类新型疫苗，还有一些方面不完善，在实际应用中还存在一些问题有待解决： 　　　1） 安全性问题：基因疫苗一般不会整合到染色体基因组上，但不能排除少数质粒DNA插入到染色体上，引起插入突变的可能性。不过目前的动物实验尚未发现发生插入突变的证据。

　　2） 免疫效率有种属个体差异：各动物之间的免疫效率不一样，这可能与不同动物细胞需要不同启动子有关。同种动物之间也有个体差异，免疫效率往往不能达到百分之百，这可能与抗原基因、给药方法途径、给药量有关。

　　3） 基因疫苗体内持续表达产生抗原蛋白，可能引发免疫耐受。 　　

　　4） 基因疫苗的免疫应答机制仍不清楚。 　

1.3　基因疫苗的应用 　

　　基因疫苗目前主要应用于传统疫苗无法对付的病毒性疾病和恶性疾病，如艾滋病、乙型肝炎、癌症等疾病的治疗和预防。 　

　　1）病毒性疾病：世界上第一例基因疫苗是用于治疗艾滋病的HIV基因疫苗。1996年批准在健康人身上进行预防艾滋病的基因疫苗的I期临床试验。流感病毒不同株间保守性抗原基因疫苗对不同株的流感病毒可产生抵抗力，以防止易变异流感病毒的免疫逃避。乙肝病毒表面抗原基因疫苗、包膜蛋白基因疫苗均可诱发机体产生免疫应答。基因疫苗还被用于其他病毒性疾病的预防，如单纯疱疹病毒 、狂犬病毒、丙肝病毒感染等。 　

　　2）癌症：有人用癌胚抗原基因疫苗诱导细胞毒性T淋巴细胞反应来治疗癌症。Plautz等也将MHC-I抗原基因疫苗治疗腺癌或纤维肉瘤也引发了对肿瘤的细胞毒性作用。 　　

　　3）免疫调节：在注射针对疾病的基因疫苗的同时，注射编码细胞因子或辅助因子的基因疫苗，有助于增强免疫应答，调节免疫反应方向或免疫反应类型。

2　反义RNA 　　

　　反义RNA指与mRNA互补后，能抑制与疾病发生直接相关基因的表达的RNA。它封闭基因表达，具有特异性强、操作简单的特点，可用来治疗由基因突变或过度表达导致的疾病和严重感染性疾病。

2.1　反义RNA治疗的基本方法

　　1） 反义寡核苷酸（反义ON）：体外合成10至几十个核苷酸的反义ON或反义硫代磷酸酯寡核苷酸序列，用脂质体等将反义ON导入体内靶细胞，然后反义ON与相应mRNA特异性结合，从而阻断mRNA的翻译。 　　

　　2） 反义RNA表达载体：合成或PCR扩增获取反义RNA的DNA，将它克隆到表达载体，然后将表达载体用脂质体导入靶细胞，该DNA转录反义RNA，反义RNA即与相应的mRNA特异性结合，同样阻断某基因的翻译。 　　

2.2　反义RNA的特点与问题 　

　　反义RNA用于基因治疗具有以下特点： 　　

　　1） 具有特异性强：只阻断靶基因的翻译表达。 　　

　　2） 安全性好：反义RNA只与特定mRNA结合，不改变基因结构，最终会被RNase水解，不残留。

　　3） 操作简单：反义ON可大量合成，反义RNA的DNA既可合成又可PCR扩增获得。 　

　　4） 靶基因范围广：适应于多种疾病，亦可同时用多个反义RNA封闭多个基因，有可能应用于多基因病。 　　

　　但是，反义RNA作为基因治疗的常规药物，还存在一些需要解决： 　

　　1） 反义RNA的选择设计难：反义RNA与mRNA亲和力、结合的特异性受结合位点两侧序列的二级或三级结构的影响。 　

　　2） 有副作用问题：副作用与反义ON的多聚阴离子性质有关，目前有人正在试图去除多聚阴离子性质，减少副作用。 　

2.3 　反义RNA的应用 　

　　反义RNA目前主要用于恶性肿瘤、病毒感染性疾病等。 　

　　1）恶性肿瘤：用反义K-ras封闭胰腺癌、肺癌的K-ras癌基因，对癌细胞具有明显的抑制作用。用反义RNA封闭慢性粒细胞白血病的bcr-abl融合基因的表达，能抑制肿瘤细胞的生长。通过反义RNA抑制程序性细胞死亡的拮抗基因bcl-2可提高化疗药对T淋巴细胞白血病细胞的杀伤作用。反义bcl-2亦可阻碍非何杰金氏淋巴肉瘤的生长。 　

　　2）病毒性疾病：HIV的反式激活蛋白反应顺序（TAR）与TAT蛋白结合可促使HIV转录，当用反义TAR封闭TAR时，可终止HIV的转录，现已取得体外抗HIV的效果。反义RNA对麻疹病毒也有显著的拮抗作用。 　

　　3）其他疾病：用胞间粘着分子的反义ON治疗肠炎病人，70%的病人其症状得到控制。针对CMV的反义ON也用于治疗CMV-视网膜炎病人。针对血管平滑肌细胞增殖的生长因子的反义ON能预防血管成形术后的再狭窄。 　

3　三链DNA 　　

　　脱氧寡核苷酸能与双螺旋双链DNA专一性序列结合，形成三链DNA，来阻止基因转录或DNA复制，此脱氧寡核苷酸被称为三链DNA形成脱氧寡核苷酸（TFO）。为了与作用在mRNA翻译水平的反义RNA的反义技术相区别，将三链DNA技术称之为反基因技术。

3.1　基本方法与机理 　

　　设计合成15～40个碱基的脱氧寡核苷酸，按T.AT、C+.GC、G.GC、A(AT三碱基体规律与双链DNA结合，通常结合在蛋白识别位点处，形成三链DNA，干扰DNA与蛋白质的结合，如转录激活因子，从而阻止基因的转录与复制。 　　

3.2　TFO的优点与问题 　

　　TFO用于基因冶疗时将有以下优点： 　

　　1） TFO所需剂量小，因为TFO是针对转录水平的DNA序列，而反义RNA作用的mRNA是DNA信息的放大，故TFO作治疗时的剂量较反义RNA大为减少。

　　2） 具有较强的特异性，因为1～2个碱基的错配将导致三链DNA稳定性大大降低。 　

　　但是，TFO还有一些问题需要解决： 　

　　1） 稳定性不够，半衰期较短。 　　2） TFO必经与同聚嘌呤同聚嘧啶片段结合，但这样DNA片段在真核细胞很少。 　

3.3　TFO的应用研究 　

　　由TFO的稳定性问题没解决，故其应用研究尚处于实验阶段，如抑制淋巴瘤的bcl-2基因、乳腺癌的HER2基因、肿瘤多抗药MDR-1基因的表达，也有人将TFO用于抑制HIV的整合。

天狼星

基因疗法治疗乙肝

　　摘自《科技之光》：由法国巴斯德研究所等单位联合研制成功的乙肝基因疫苗将于近期投入临床实验，这将是法国首次采用基因疗法治疗乙型病毒性肝炎。

　　这种基因疫苗是采用乙肝病毒包膜基因制成的，其作用是在注入人体后，激活患者的免疫系统，杀灭致病的乙肝病毒。负责此项临床实验的科学家说，基因治疗目前针对的主要对象还仅仅是干扰素治疗一直无效的乙肝患者。

　　干扰素是目前国际上广泛使用的治疗慢性乙肝、丙肝、肿瘤、性病等顽症的有效药物。干扰素治疗对部分乙肝患者还是非常有效的，基因疗法的目的只是要增加治疗乙肝的手段。

中国生物信息

2003.05.26

日本开发出基因疗法用新载体

2003-3-3

  


    日本庆应大学医学系上田政等人近日用乙肝病毒开发出可适用于基因疗法的新载体，它容易与肝细胞结合，能有效地提高肝病治疗效果。     

    据《日刊工业新闻》报道，这种载体是利用具有嗜肝性乙肝病毒表面上一种被称为ＨＢs 的抗原开发出来的，它能将特定基因传送到细胞内。研究人员把ＨＢs 抗原和治疗用基因同时放入酵母中，制成表面有许多ＨＢs 抗原、直径为１００至２００纳米的微粒。为了便于捕捉微粒在体内的行踪，他们又向微粒内注入了萤光蛋白质的基因，然后把微粒分别注射到植入了人类肝癌细胞和大肠癌细胞的两种实验鼠体内。结果，在肝癌细胞中发现了治疗用基因，而在大肠癌细胞中则没有发现。此外，在用新的载体运载化合物的实验中，化合物也只到达肝脏部位。由此，专家认为，这种载体容易与肝细胞结合，并有传递治疗肝病药物的效果。     

    目前基因疗法的载体多为逆病毒和腺病毒，这类载体有一定的毒性。新载体不仅能有效提高肝病治疗效果，而且将它作为预防肝病的疫苗成份，其安全性也较高。上田政等人目前正在和制药公司联手，以便用这种载体开发出新的基因疗法，并力争５年之内应用于临床。

来源：新华社

天狼星

肝癌基因治疗的现状与展望

世界华人消化杂志 1998年第2期第0卷 文献综述

作者：何兴祥　王家 马龙

单位：同济医科大学肝病研究所　湖北省武汉市　430030

关键词：肝肿瘤/治疗；基因疗法；分子生物学

　　Subject headings　liver neoplasms/therapy; gene therapy; molecular biology

　　中国图书资料分类号　R735.7

　　1　肿瘤基因治疗的策略

　　肿瘤基因治疗的最终目的是杀伤肿瘤细胞、抑制肿瘤生长使肿瘤消退.基本策略可归为三大类：①肿瘤免疫基因治疗：通过增强机体的特异和非特异性抗肿瘤免疫应答来控制肿瘤生长；②肿瘤遗传基因治疗：通过抑制肿瘤细胞的癌变基因的表达以治疗癌症；③肿瘤药物基因治疗：通过基因转移使肿瘤细胞对化疗的敏感性增加或者使正常细胞(如骨髓细胞)对化疗药物的耐受性增加来治疗肿瘤.

　　1.1　肿瘤免疫基因治疗　①针对免疫应答细胞的治疗：用细胞因子基因转染抗癌免疫应答细胞(如TIL、CTL)可增加其抗癌活性，可供选择的目的基因有白介素(IL-1、2、4、6、12等)、干扰素(IFNα和β等)、TNF、集落刺激因子(G-CSF、GM-CSF)等. rosenberg et al［1］将TNFα基因导入带有标记基因(NeoR基因)的TIL细胞中，使TIL的杀瘤活性大为增强，目前该方案已用于临床试验［1］.②针对肿瘤细胞的治疗：肿瘤之所以能逃避机体的免疫防御系统，其可能原因是：(a)肿瘤没有表达特异抗原或有抗原但缺乏免疫原性；(b)有些肿瘤能表达特异性抗原但缺乏主要组织相容性复合体(MHC)抗原；(c)缺乏B7分子的表达，因为近年来发现，T细胞的激活不但需要肿瘤相关抗原(TAA)和T细胞受体(TCR)的结合，还需要另一“共同刺激”信号B7分子和T细胞膜上的CD28受体的结合才能完成［2］. michigan大学医学中心的Nabel获准以B7基因治疗若干名晚期黑色素瘤患者，用脂质体包裹B7基因直接行瘤体内注射，以期B7基因的整合表达能促进T细胞抗肿瘤免疫.用该方法治疗的5名Ⅳ期黑色素瘤患者的结果令人鼓舞，其中一名患者的远端肿瘤完全消退［3］.

　　1.2　肿瘤遗传基因治疗　①针对癌基因的治疗：即通过反义寡核苷酸(antisense oligonucleotides, Oligos)技术干扰癌基因的转录和翻译，以关闭其表达.癌基因是一个大家族，已发现100余种，因此有多种目的基因可供选择.目前在临床上试用的Oligos主要有硫代磷酸寡核苷酸(MP.Oligos)［4］.美国Anderson癌症中心经FDA同意，进行首例Oligos治疗恶性肿瘤的临床研究［5］，其方案是取CML患者的白血病细胞以“净化骨髓”，同时给患者施行大剂量化疗和放疗以彻底杀灭体内的肿瘤细胞，再回输净化的自体骨髓.②针对抑癌基因的治疗：已确定的抑癌基因有DCC、NF1、NF2、RB、P53、WT1、FAP、VHL；新的抑癌基因的后选者有吴(曰)/(文)等1991年分离的RA538和Kaplan等1990年分离的RPTPaseγ.针对抑癌基因治疗的策略是恢复由于缺失或突变而丢失的抑癌基因的正常功能.临床前实验研究已取得肯定结果，如人野生型p53基因能抑制复发的T-ALL来源Be-13细胞的恶性表型［6］.但临床上的治疗试验开展甚少. 主要是针对这种“替代疗法”存在较大争议，例如以病毒载体导入抑癌基因p53，首先载体是否安全、，其次转导p53后对周围细胞有何影响等.③表达调控治疗：肿瘤的发病存在细胞周期调控基因的异常［7］，刘定干提出［8］通过人工使用药物，对细胞内的功能核酸3′或5′调控区进行控制，来实现基因治疗，而不是控制其编码区.目前正在试验的一些基因疗法是以杀灭癌细胞为目的，这和常规的手术切除肿瘤并无本质的区别，这些疗法均不能把甚至一个癌细胞变回到正常状态.但是，实践经验告诉我们，癌块周围的许多细胞已经偏离了正常状态.表达调控治疗的指导思想是把癌块周围的细胞和部分癌细胞的恶性度减弱，甚至变回到正常状态.

　　1.3　肿瘤的药物基因治疗　即将基因治疗技术与肿瘤化疗药物或药物前体结合起来有选择性杀伤肿瘤细胞和保护正常组织以增强化疗的效果.①“自杀”基因疗法：来自原核或低等生物的“自杀”基因(suicide gene)编码的酶类，能使一些药物前体转化而获得对哺乳动物细胞的毒性，并将这些基因导入肿瘤细胞，再伍用相应药物前体，可使肿瘤细胞因表达此类基因而“自杀”.已经发现的这类基因有单纯疱疹病毒胸腺嘧啶激酶(HSV-TK)基因、水痘-带状疱疹病毒胸腺嘧啶激酶(VZV-TK)基因、胞嘧啶脱氨酶(CD)基因.“自杀”基因的应用是对传统化疗的重大改进在脑瘤的治疗中取得了重大进展，有广泛的发展前景.1992年6月，美国基因治疗公司(GTI)的Culver等经RAC同意，拟选择少数手术无法切除的脑瘤患者开展一项基因治疗计划.目的基因即为HSV-TK. 其一期临床研究的部分结果表明，VDEPT(virus directed enzyme prodrug therapy)治疗成人脑瘤有一定效果. 8例接受治疗的患者中5例产生应答，其中3例脑瘤萎缩，同时患者对治疗耐受性良好.②肿瘤药物增敏基因：这类基因的产物能使细胞对已有肿瘤化疗药物的敏感性增加.如钙调素基因(CaM)能增加肿瘤细胞对长春花碱类化疗药物的敏感性，降低耐药性，从而增加化疗的效果.③肿瘤药物耐受基因：将肿瘤药物耐受基因导入正常造血干细胞或祖细胞可增加其对化疗药物的耐受剂量，间接地提高化疗的效果.如通过向造血干细胞内导入二氢叶酸还原酶(DHFR)基因，可使正常细胞获得对氨甲喋呤的耐受性［9］；又如通过导入多相耐药(MDR)基因，如MDR基因，可使正常细胞获得广泛的药物耐受性.这样就可在不损伤正常细胞的前提下，用大剂量化疗药物清除残留的肿瘤细胞.另外，集落刺激因子、促红细胞生成素、白介素等也能增强肿瘤患者骨髓耐受化疗的能力［10］.

　　2　肝癌分子生物学的研究

　　美国Barbacid小组最早从事肝癌基因研究，于1984年报道了在1例肝癌组织中有N-ras基因存在.李岱宗 et al［11］对肝癌癌基因谱做了较系统的深入研究，发现至少有7种癌基因：N-ras、C-myc、p53、,C-ets-2、C-fms、IGF-Ⅱ、IGF-ⅡR的表达异常.对肝癌抑癌基因的研究报道结果不尽相同，但多数资料显示染色体8p、13q、16q和17p区域存在与肝癌发生和演进关系密切的肿瘤抑制基因.肝癌中常见p53基因突变，且多为第249密码子第3碱基G→T颠换［12］.肝癌中染色体13q缺失的最小重叠区域为13q14，在肝癌组织中还同时发现伴随等位基因丢失的存留RB1等位基因突变以及和RB1等位基因丢失高度相关的P110RB1蛋白丢失，提示RB1基因为肝癌的又一重要抑癌基因［13］.国内顾健人 et al［14］分离的转甲状腺素蛋白(TTR)基因也是肝癌新的抑癌基因的候选者.流行病学调查发现HBV、HCV与肝癌有关.

　　3　肝癌基因治疗的现状及存在的问题

　　肝癌的基因治疗尚处于动物实验阶段，报道的文献亦不多. neda et al［15］阐述了一种将逆转录病毒载体靶向导入肝细胞的方法，在该方法中，改变逆转录病毒载体表面，使它可与肝细胞表面的去唾液酸α1酸性糖蛋白受体结合.同时，Wu et al［16］也进行了受体介导的基因转移细胞靶向性的研究，他们针对肝细胞特异的去唾液酸α1酸性糖蛋白受体，构建了一种可溶性的分子复合物载体.在体内外实验中，利用这一分子复合物载体，均已将外源基因选择性地导入肝细胞，并检测到外源基因的表达，除了细胞靶向性外在位点靶向性方面也有报道，Huber et al［17］将α-FP基因表达调控片段与VZV-TK基因重组，构造了PCR74和PCR 78质粒两个载体，经逆转录病毒转染肝癌细胞和非肝癌细胞，只有肝癌细胞才专一性地合成TK，建立了VDEPT概念，VDEPT病毒可使VZV-TK基因在肝癌细胞内特异性地表达，用araM处理可选择性地杀伤肝癌细胞.

　　许秀兰 et al［18］首次报道了含人N-ras cDNA反义密码顺序的逆转录病毒对人肝癌细胞株PLC/PRF/5的生长有明显的抑制作用，并伴有ras基因表达产物下降.以后黄贤明 et al［19］又报道用C-ets-2、C-myc、N-ras三个癌基因联合反义RNA使人肝癌细胞株SMMC-7721的生长速率下降约70%，有进一步探索的价值.

　　傅青春 et al［20］进行了脂质体-白细胞介素-2基因复合物瘤体内注射治疗肝细胞癌的实验研究，结果表明，脂质体-IL-2基因复合物直接注射入瘤体后获局部IL-2基因表达，从而诱生了机体抗肿瘤效应，也为肝癌的基因治疗提供了一种简便实用的模式.

　　但是肝癌的基因治疗仍有许多问题亟待解决：①以肝癌细胞为基因转移的受体细胞的靶向性问题；②逆转录病毒载体的安全性问题；③肝癌是多个癌基因激活，多个抑癌基因失活，多个步骤癌变共同作用的结果.如以肿瘤遗传基因治疗，其先决条件是把治疗基因导入身体的所有肿瘤细胞中，目前尚没有一种基因导入系统能获得这样高的效率.④肝脏是重要的代谢场所，如何使导入的基因的产物只对肿瘤细胞起作用而不影响正常细胞等.

　　4　肝癌基因治疗的展望

　　通过对其他肿瘤治疗方法及肝癌发生发展分子遗传模式的研究，对肝癌的基因治疗提出以下设想.①在免疫基因治疗方面：可将一细胞因子基因如IFN-γ、IL-2、TNF、B7等导入自体肿瘤细胞或抗肿瘤效应细胞.在肝癌中，可构建肝癌中特异表达的系统来导入这些基因，以增强肿瘤细胞的免疫原性或导入一些基因到抗肿瘤应答细胞如TIL以增强应答细胞的杀瘤作用.②在遗传基因治疗方面：由于肝癌的发生发展是多种癌基因的激活和抑癌基因的失活.可望联合多个关键的癌基因反义寡核苷酸或抑癌基因导入肿瘤细胞，使癌细胞回复至正常状态.此外，寻找一些针对表达调控的信息分子也是很有前途的. ③在药物基因治疗方面：将基因治疗与化疗联合的方法，为目前研究的热点.例如Huber等构建的VZV-TK系统，对癌周组织及骨髓细胞的影响有待验证.另外在肝癌的基因治疗中，将MDR导入骨髓干细胞配合化疗也是值是探讨的.

　　总之，随着外源基因转导、表达技术的提高及细胞靶向性与位点靶向性载体的构建，恶性肿瘤的基因治疗将成为一种有前途的治疗方法.美国NIH的一位官员预言：在下一世纪，基因治疗将成为对付我们现在不能治愈疾病的主要治疗方法.

　　通讯作者　何兴祥收稿日期　1997-11-10?

伟伦

太辛苦了！
谢谢！！！

hupenghui

辛苦你了！！！
握手！！
其实，我没仔细看完，太枯燥……

枯水清源

好好好，版主一旦得到肝癌进展，多多发上来。我们都努力发出好文章。

枯水清源

我有个好的基因治疗PPT,可是我不能上载。