干细胞研究的问题与对策

天狼星

ISSN 1009-3079 CN 14-1260/R 世界华人消化杂志 2003年12月15日;11(12):2011-2014


张刚庆, 方驰华


  

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张刚庆, 方驰华, 中国人民解放军第一军医大学珠江医院肝胆外科广东省广州市  510282
广东省自然科学基金资助课题, No. 2001, 010593, No. 2002, 020097
项目负责人: 方驰华, 510282, 广东省广州市, 中国人民解放军第一军医大学珠江医院肝胆外科.  [email protected]
电话: 020-61365787    传真: 020-61643020
收稿日期: 2003-06-05    接受日期: 2003-08-18

摘要
干细胞的研究就是探索有关单个细胞增生、分化，甚至发展为一个生物有机体，在成熟的机体内健康的细胞替换衰老和受损伤的细胞规律和机制的研究. 干细胞的研究已深入到了医学的各个方面. 本文结合近年的文献，对干细胞研究过程中，随着新的发现而来的一系列问题: 干细胞的定义、干细胞的来源、干细胞的不同类型、干细胞进行医学方面的治疗潜力、干细胞应用于临床疾病的治疗必须解决的问题和需要克服的障碍等几个方面的问题和进展作一综述.

张刚庆, 方驰华. 干细胞研究的问题与对策. 世界华人消化杂志  2003;11(12):2011-2014
http://www.wjgnet.com/1009-3079/11/2011.asp

0    引言
干细胞研究就是探索有关单个细胞发展为一个生物有机体，在成熟的机体内健康细胞替换衰老和受损伤细胞的规律和机制的研究. 这是一个新兴的科学领域，各国的科学工作者对这个领域给予了足够的重视，从各方面进行研究和探索. 本文针对干细胞的定义、干细胞的来源和类型、利用干细胞进行医学方面的治疗潜力、要将干细胞应用于临床治疗需要进行的探索和研究、需要克服的障碍和必须解决的问题等几个方面作一综述.

1   干细胞的定义与特性
对于干细胞的定义，有多种意见，但多数研究者认为，干细胞是一类具有自我更新和多向分化增生的原始细胞，能产生表现型和基因型与自己完全相同的子细胞，形成人体多种组织器官的祖细胞，即具有生理性的更新能力，又具有对损伤与疾病导致的反应与修复功能的细胞[1, 2].
        干细胞有两个重要的特点: 首先，他是非特异性细胞，能通过分裂在很长一段时间内可以自我区分和进行自我更新，其原因可能是没有允许他进行特殊功能的特殊组织结构. 其次，在正常的生理或实验条件下，他们能被诱导分化成具有特殊功能的细胞，如: 心肌细胞、胰岛分泌细胞、肌细胞、神经细胞、肝细胞和血细胞等[3-8]，经过多年在实验室进行没有特殊条件和因子，让干细胞自然地分化为特殊类型细胞的研究发现，引起干细胞分化的是细胞内和细胞外的信号. 细胞内的信号由细胞的基因所控制，外部信号包括隐藏在其他细胞的化学信号、与相邻细胞的物理接触或微环境中的某一个分子结构[9]. 但是，促使所有的干细胞进行分化的细胞内、外信号是否都是相似的？是否能在实验室中检测到促使干细胞分化成特殊类型的细胞的一整套特殊的信号? 这一问题关系到控制干细胞分化的新方法的研究，关系到培养包括细胞治疗在内的可用于特殊目的细胞和组织的方法的建立.
        干细胞分类主要是从两个不同的侧面来进行的. 一方面是根据干细胞的来源及分化潜能分类，可分为: 胚胎干细胞和特定组织的干细胞(即成体干细胞). 胚胎干细胞来源于3-5 d大小的胚胎，他们可以分化成成年机体所需的数百种特定的细胞，在发育过程中，其可以分化成诸多特殊类型的细胞，形成各种组织器官，如: 心、肺、皮肤及其他组织器官[10, 11]. 成体干细胞来源于一些成体组织，如骨髓、肌肉、脑、肝等[2, 8, 12-14]，他们可连续不断地分化，以补充正常损耗、损伤和疾病所引起的细胞消耗. 另一方面是按其分化能力的差异来分类，可分为三种类型: 一类是全能干细胞，可分化形成机体所有细胞类型， 如胚胎干细胞; 第二类是多能干细胞，可以产生两种以上不同类型的分化细胞; 第三类是专能干细胞，只能分化为单一类型的分化细胞. 第二、三类干细胞存在于成年组织中，故又称为成体干细胞，如神经干细胞、肌肉干细胞、间质干细胞和表皮干细胞等. 许多报道证明存在于成年机体组织中的干细胞不仅向该组织细胞类型分化，以不断补充修复该组织器官，而且可向其他不相关细胞类型分化，因而认为成体干细胞的分化具有可塑性[5, 7, 8, 15]. 2001年美国加利福尼亚大学和匹兹堡大学研究人员在《组织工程学》杂志上报道[16]，他们从患者的臀部和大腿处抽取了少量的脂肪和液体，然后对脂肪和液体进行清洗和纯化，并用一种酶进行处理以分解把细胞结合在一起的物质，最后从处理过的脂肪中提取干细胞，结果发现240 g左右的脂肪组织能够产生5 000万到1亿个干细胞，这些干细胞具有发育为健康的软骨、肌肉和骨细胞的能力，认为这一发现有可能使脂肪成为干细胞的主要来源，今后将不必从胚胎组织或骨髓中提取干细胞.

2   胚胎干细胞
胚胎干细胞(ESC)是从附置前的早期胚胎内细胞或附置后胚胎原始生殖细胞中分离克隆出的一种干细胞. 胚胎干细胞系最早建立于1981年，是由美国和英国研究人员成功分离和体外培养的小鼠ESC[17]，在此之后的20 a里，相继从早期胚胎建立了猪、牛、兔、灵长类动物的ESC系. 1998年从接受不孕症的夫妇所捐献的处于囊胚阶段的早期胚胎中分离了人的ESC[16, 18]. 2000年又成功地从人囊胚中建立了两株未分化的人 ESC细胞系[19].
         胚胎干细胞具有许多重要的生物学特性: 发育的全能性、无限的扩增性(在体外无限扩增是ESC研究和应用的前提和关键，这为ESC提供了无限的细胞来源)、可操作性(在体外可对ESC进行遗传操作选择，如导入异源基因、报告基因或标志基因，诱导个体基因突变或导入额外基因使之过度表达[20]). 但到如今，仍未有一个统一的鉴定胚胎干细胞特征的标准，尚未找到胚胎干细胞重要的生物学特征和功能特征的特异性指标.目前较常用的鉴定生物学特征方法主要是[21]: (1)将胚胎干细胞传代培养几个月或更长的时间，以明确细胞是否有长期的自我复制能力，并观察检查胚胎干细胞是否健康和保持未分化. (2)利用特定方法来检测只有未分化细胞才有的细胞表面标志，一个重要的试验是检测Oct-4的蛋白的表达，Oct-4是一个转录因子，其作用是帮助转移基因及时进出细胞，是细胞分化和胚胎发育过程中的重要部分，他是未分化细胞的特异性表达标志.(3)检查染色体，以明确染色体是否被损害，数目是否被改变.目前较常用的检测胚胎干细胞是否有多潜能的方法主要有[22, 23]: (1)在细胞培养过程中允许细胞自然的分化. (2)对细胞进行处理，使之向特殊类型的细胞分化. (3)将细胞注射入免疫抑制的鼠体内，检测是否可以形成良性肿瘤畸胎瘤，因为畸胎瘤是特异性地包含许多分化和部分分化的细胞的混合体，是一个胚胎干细胞区分于其他复杂的细胞的指征.
       在自然条件下培养胚胎干细胞，能保持不分化，但当细胞被允许聚集在一起形成胚状体时，就很自然地开始分化，可形成肌细胞、神经细胞和其他类型的细胞[2, 19, 24, 25]. 虽然自发的分化是培养中的胚胎干细胞的健康的标志，但其不是在培养中产生特殊类型细胞的有效方法. 要得到分化的特殊类型的细胞一般是通过控制胚胎干细胞的存在条件来实现. 可通过改变培养基的化学成分，改变培养皿的表面组成或通过插入特殊的基因来修饰细胞，从而使其分化为特殊类型的细胞[26]. 经过多年的研究，已建立了一些基本的方法和找到了一些直接使干细胞分化为一些特殊类型的细胞的特殊培养条件[24, 25, 27-33]. 如果能够直接将胚胎干细胞分化为各类特殊类型的细胞，这些特殊类型的细胞将可以被利用来治疗某些已明确的疾病，如: 帕金森氏病、糖尿病、外伤性脊髓损伤、浦肯野细胞变性、心脏疾病病、视力和听力丧失等，这也是将干细胞应用于临床细胞治疗的关键问题.

3   成体干细胞
成体干细胞是在组织和器官分化的细胞中发现的未分化的细胞，能自我复制，能分化为所在组织或器官的细胞类型的细胞. 成体干细胞在活生物机体的基本作用是维护和修理所驻的组织器官.目前，一些研究者用躯体干细胞来替代成体干细胞这个名字，而不象胚胎干细胞那样由细胞的来源来命名[6].成体干细胞在成熟的组织中是不明确的[34-36].成体干细胞在许多的组织和器官中被检出，但其在组织器官中的数量很少，仅存留在组织的某个特殊的区域，可多年保持静止直到所在组织出现疾病或损伤.
      近期，在成体干细胞的研究中，在很多的组织中发现了成体干细胞，已报道的存在成体干细胞的组织有: 脑、骨髓、外周血、血管、骨骼肌、皮肤和肝脏等[6-8, 25, 30, 37, 38]. 由此，人们想到了成体干细胞是否可以用来移植的问题，并进行了一系列的研究和探索，骨髓干细胞移植治疗血液系统疾病，就是这方面进行得较早和比较系统的研究. 事实上某一确定类型的成体干细胞在适当的条件下，可以分化为多种不同的细胞类型[8, 38]，如果能够在实验室对这种分化进行控制的话，这些细胞将可以用于许多疾病的治疗.
      对于成体干细胞的检测尚未有一个统一的鉴别和检验标准. 当前常用以下3种方法的一种或几种: 用分子标记来标记活体组织中的细胞，然后来决定其产生的特殊的细胞类型. 从活体动物体内提取细胞进行细胞培养，然后移植到另一动物体内，检验其是否能复制出其来源组织的组织. 分离细胞进行培养，并对其进行处理，如加入细胞因子或导入新的基因，检测其能分化为何种其他的细胞类型 .
       研究报道，成体干细胞存在于许多的组织中，并且可正常进入分化为所驻组织的特殊细胞类型的过程[6-8, 26, 37, 38]; 成体干细胞也展现分化为其他组织类型的细胞的能力，这叫做转分化或可塑性[8, 39, 40]. 成体干细胞的正常分化途径，在活生物体内，成体干细胞可保持分裂很长的时间，并且可产生特殊组织的特殊形态、功能和结构的特殊类型的细胞[15, 41]. 如: 造血干细胞可以分化为所有类型的血液细胞: 红细胞、T淋巴细胞、B淋巴细胞、成熟的杀伤细胞、中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、单核细胞、巨噬细胞和血小板等. 许多实验也已证明，成体干细胞具有可塑性和转分化能力，如造血干细胞可以分化为三类脑细胞、骨骼肌细胞、心肌细胞和肝细胞等[8, 40-42]. 骨髓间质细胞可分化为: 骨骼肌细胞、心肌细胞和肝细胞等[2, 43, 44]. 现在的研究目标是干细胞可塑性的机制研究，如果这些机制明了和可以控制的话，现有的从健康组织中来的干细胞就可用于修复病变组织.
       在成体干细胞的研究中，尚存在许多的问题需要进一步明确: (1)有多少种成体干细胞，他们存在于何处？(2)在体内成体干细胞的来源，他们是残留的胚胎干细胞还是另有来源？为什么包绕其周围的细胞均分化而他可保持不分化？(3)是否可通过控制其生长条件来提高增生能力，从而产生足够的组织细胞用于移植.(4)存在于骨髓或外周血中的单个干细胞是否可分化为组织或器官的细胞. (5)刺激干细胞在受损伤或病变的部位出现的条件或因子是什么？(6)在实验性操纵下，成体干细胞是否能正常地展现其可塑性或仅仅是转分化？干细胞有规律地分化和增生的信号是什么？

4    胚胎干细胞与成体干细胞的关系和特点
成体干细胞与胚胎干细胞相比，除了来源的不同和成体干细胞可以避免伦理之争外[1]，另一个优点是易于管理，成体干细胞体外培养时不象胚胎干细胞样容易自发分化[32]. 但目前成体干细胞的研究还只在初级阶段，分离、提纯极微量的干细胞还存在技术难题，很多成体组织干细胞还未找到[33].
         胚胎干细胞与成体干细胞在细胞再生治疗方面各有优缺点.当然，胚胎干细胞与成体干细胞在他们能分化的细胞的类型数量也是不同的. 胚胎干细胞是多潜能的，能分化为全身所有的细胞类型. 成体干细胞只能分化为所来源的组织和器官的类型的细胞. 然而，有证据表明，成体干细胞的可塑性是存在的，他们能分化为较多的细胞类型[15, 39, 40].
       应用成体干细胞的一大潜在优点是细胞来源于患者，在体外扩增再移入患者的体内，不会产生免疫排斥.胚胎干细胞从供者引入患者，可引起移植排异，受者是否对胚胎干细胞产生排异在人类的研究中尚未被很好的解决[15, 39, 41]. 另外，大多数的胚胎干细胞是容易培养的，而成体干细胞在成熟的组织中的数量是较少的，用细胞培养的方法来扩增他们的数量尚未有很好的技术方法，由于细胞治疗需要大量的干细胞，因此限制了成体干细胞的应用，这也是他们之间的重要差异.

5   干细胞潜在的用途
干细胞可以由胚胎和成体组织而来，他们在临床的应用前景广阔，但最主要和常见的用途是修复或重建患病或损伤的组织，如: 帕金森病、糖尿病、脊髓损伤几、肌营养不良综合征、肝衰和心衰等[26, 42-45]. 具体对于不同来源的干细胞，其潜在的用途并不完全相同. 在胚胎干细胞的应用方面，通过对胚胎干细胞的研究可以得到关于人类发现过程中的复杂的信息[41]，认识未分化的干细胞分化成各种类型细胞的机制，其中心问题是明确其分子和基因控制机制. 临床的许多疾病，如癌症、家族性粉样多神经瘤胶原病、和出生缺陷综合征等，都是由于异常的细胞分裂和分化所引起，了解这个过程的分子和基因控制机制，就能得到更多的关于这些疾病的发生和治疗的信息，就能为上述疾病提供崭新的治疗手段. 科学家已利用胚胎干细胞制造出许多小鼠的疾病模型，如LeschNhan、HGPRT(HGPPT基因缺陷)综合征、TTK基因缺陷、HBS贫血等，并使人的致病基因在小鼠体内表达，为下一步治疗人类疾病奠定了坚实的基础[1]. 但是，在这个问题上，困扰我们的最大的障碍是干细胞开始或停止分化的信号研究. 胚胎干细胞在药物研究方面，可能为新药的研究及安全性检测手段带来巨大的变革[33]. 胚胎干细胞体外自然分化过程与个体发育形成十分相似，可以在体外研究药物有无致畸性，如在干细胞分化初期进行药物处理后，再种植于假孕母体，观察新生个体有无畸变;同时干细胞系因其性状稳定，借助基因组学或蛋白质组学观察用药后目标基因的转化，可以作为药物筛选的平台[41, 46, 47]. 另一方面，干细胞可以作为一个良好的药物载体，将药物制备成纳米级微粒摄入干细胞内带到病变部位达到直接治疗作用.
         随着对胚胎干细胞研究的不断深入， 在此基础上对成体干细胞生物学特性的有了逐步认识， 人们发现，在成年动物体内多种组织器官(包括骨髓、牙髓、脑、肌肉、皮肤、消化道、角膜、视网膜、肝脏和胰腺等)存在着可进行自身组织修复的成体干细胞. 事实上， 在成人体内多种组织器官中也发现了干细胞，同时发现成体干细胞除了具有较强的自我更新和增生、分化潜能外， 还具有可塑性. 同时，由于胚胎干细胞的研究受伦理和政策上的限制， 这使得人们对应用成体干细胞进行细胞再生治疗充满希望[1].
        干细胞技术也许能产生可用于所谓“细胞治疗”的细胞和组织，但用干细胞技术治疗疾病至少还要经历三个阶段: 第一个阶段是把一种组织的成体干细胞直接移植给相应组织坏死或损伤的患者以治疗疾病. 但只有他们能够被分离、纯化和增生达到行使组织器官的功能的数量时，他们潜能才能得到发挥. 第二阶段是掌握干细胞向某种组织细胞分化的条件，在体外对干细胞进行诱导，使之“定向”分化成所需的细胞. 对于某些遗传性疾病，还可对干细胞进行基因修饰. 对经过“定向分化”或“基因修饰”后的干细胞进行筛选后，把“合格”的细胞移植给患者，即“细胞或组织替代”技术，其可用于那些因某种细胞死亡而引起的疾病，比如糖尿病、帕金森病等. 在这方面研究者们近2 a来作了大量的工作，在体外研究中发现，一定的诱导条件下，骨髓来源的干细胞可向肝脏[8]、胰腺、肌肉及神经细胞分化， 骨髓中的间充质干细胞( MSCs)可向骨、软骨、脂肪、造血基质及神经元样细胞等分化， 肌肉、神经干细胞也可向造血细胞分化. Kim et al [2]在干细胞治疗心肌梗死、皮肤损伤、帕金森病等方面做出了有益的尝试，取得了不错的成果. 但干细胞分化为成熟的目标组织细胞环境和条件的选择，仍是关键问题. 第三阶段即是在体外进行“器官克隆”，真正在体外形成一个具有正常生理功能和结构的人体器官以供患者移植. 但要实现这个目标，还需要一定的努力和时间.