阻断乙型肝炎病毒母婴宫内传播的影响

天狼星

ISSN 1009-3079 CN 14-1260/R 世界华人消化杂志 2003年12月15日;11(12):2042-2045 阻断乙型肝炎病毒母婴宫内传播对血清HBV DNA和转录体的影响 王清图, 修 霞, 郭 永, 王爱婷, 齐 峰, 苏 勤, 张 伟, 刘 节 -------------------------------------------------------------------------------- 王清图, 修霞, 郭永, 王爱婷, 齐峰, 潍坊市妇幼保健院 山东省潍坊市 261011 苏勤, 张伟, 刘节, 中国人民解放军第四军医大学唐都医院病理科陕西省西安市 710038 项目负责人: 王清图, 261011, 山东省潍坊市青年路76号, 潍坊市妇幼保健院. [email protected] 电话: 0536-8319609 传真: 0536-8361865 收稿日期: 2003-05-14 接受日期: 2003-06-04 摘要 目的: 探讨不同方法阻断乙型肝炎病毒母婴垂直传播的效果，明确携带乙型肝炎病毒(HBV)健康生育期妇女干预治疗对保护婴儿抗-HBV感染的意义. 方法: 设计了对慢性携带HBV孕妇进行治疗性干预、对其高危新生儿正常免疫的治疗方案. 将60例HBsAg/HBeAg阳性孕妇分成二组，HBIG与左旋咪唑涂布剂治疗组31例，未治疗组29例. 治疗组均在孕26 wk起开始注射，孕妇和新生儿血清HBsAg、抗-HBs、HBeAg、抗-HBe、抗-HBc检测采用ELISA法，HBV DNA及全长型和顿挫型转录体测定用PCR电泳和RT－PCR法. 孕妇与新生儿血清双盲法测定病毒DNA及不同的病毒转录体分子，分析母婴之间乙肝病毒分子水平上的关系. 结果: 母血中HBsAg/HBeAg阳性者，其新生儿外周血中HBsAg阳性率: 治疗组2/31例，宫内感染率为6.45 %. 未治疗组4/29例，宫内感染率13.7 %. 孕妇治疗性干预有明显的阻断HBV宫内感染效果，与对照组比较分别有十分显著的差异(P <0.01). 无论治疗组还是对照组，都有超过一半的患儿携带顿挫型病毒转录体. 结论: 携带HBV孕妇于孕晚期给HBIG和左旋咪唑涂布剂联合治疗后，可有效降低婴儿HBsAg和HBV DNA携带率. 王清图, 修霞, 郭永, 王爱婷, 齐峰, 苏勤, 张伟, 刘节. 阻断乙型肝炎病毒母婴宫内传播对血清HBV DNA和转录体的影响. 世界华人消化杂志 2003;11(12):2042-2045 http://www.wjgnet.com/1009-3079/11/2042.asp 0 引言 孕妇携带的乙型肝炎病毒(HBV)可垂直传播感染新生儿，目前分娩时采取的一系列防范措施，尚不能完全阻止母婴垂直传播[1]. 宫内感染是母婴传播的主要途径，是导致婴儿出生后乙肝疫苗(HBVac)接种失败的主要原因[2]，因此，阻断母婴传播成为控制乙肝流行的关键环节.我们用HBVac、乙肝免疫球蛋白(HBIG)和左旋咪唑涂布剂(levamisole liniment)联合方案探讨阻断HBV宫内传播的临床疗效，取得较好的效果，乙肝病毒携带呈“大三阳” 孕妇所生婴儿阻断率达80 ％以上[3]. 本文报告不同阻断方法对HBsAg、HBV DNA和转录体的影响. 1 材料和方法 1.1 材料 2000-01-01/2002-12，我院产科门诊于孕20 wk开始门诊检查血清乙肝病毒标志物(HBVM)，观察HBsAg/HBeAg阳性60例，经孕期干预，并住院分娩进行分组观察分析. 60例HBsAg/HBeAg阳性孕妇分为治疗组31例及未治疗组29例，观察新生儿与母亲外周血中HBVM、DNA以及不同类型病毒转录体的变化，评价干预措施的效果. 60例孕妇孕期均无先兆流产史，无急性或慢性肝炎病史、症状及体征，无肝功能受损情况. 孕妇年龄、孕产次、胎龄均无明显差异. 60例孕妇分娩新生儿60名，男32女28例. 1.2 方法 1.2.1 60例HBsAg/HBeAg阳性孕妇治疗方法 孕26 wk开始按来诊次序分为: 治疗组31例: 孕26 wk始孕妇4 wk/次臂大肌注射HBIG (上海生物制品研究所生产，批号为20000712)200 IU，同时使用左旋咪唑涂布剂(福建省凯华药业有限公司生产，批号为20000307，500 mg/支)5 mL涂布于上、下肢体内侧皮肤易吸收处，2次/wk，3 mo一疗程，未治疗组29例，根据患者或其亲属的意见未给予上述任何主动或被动免疫防治措施，孕妇所生的新生儿的乙肝疫苗接种均按第0、1、6 mo进行. 1.2.2 血清学检测 孕妇20-26 wk抽取肘静脉血2 mL，新生儿分娩24 h内采股静脉血2 mL. 送我院中心实验室分离血清，检测HBVM采用酶联免疫黏附测定法(ELISA); 试剂盒由上海科华生物技术有限公司提供. 同份标本低温冰冻(-50 °C)保存，按以前的方法[4, 5]自血清中提取病毒核酸，每次提取用血清200 mL，提取物终体积为50 mL. 经PCR及RT-PCR进行扩增，经琼脂糖电泳显示产物. 1.2.3 病毒DNA的PCR扩增 上游引物为txs(1445): 5’-GGA CCG TGT GCA CTT CGC TT-3’下游引物为txas(1574): 5’-CCT CAA GGT CGG TCG AC-3’取2 mL提取物，在含有引物对txs/txas的50 mL反应体系中应用Tag DNA聚合酶(gibco BRL，life technologies inc.gaithersburg，MD)按标准条件扩增35个循环. 应用fRNA的cDNA质粒pMT9T40A (200 pg)和trRNA的cDNA质粒pMT9T41A (200 pg)作为阳性对照，用水作为阴性对照. 1.2.4 逆转录后通过半巢式PCR检测HBV RNA 3’端结构 我们以前的结果[4, 5]表明，由于锚定Oligo d(T)引物能够特异的扩增poly(A) RNA，检测病毒RNA的3’端结构的反应不需要Dnase I预处理标本; trRNA扩增用的Oligo d(T)引物与fRNA末端1 803-1 806位置的结构也有一定的亲和力，因此本研究用trRNA RT-PCR这一个反应同时显示trRNA和fRNA两种转录体分子，与其产物大小分别为235 bp和360 bp. 第一轮反应上游引物为txs; 第二轮反应上游引物为txs2(1 464): 5’-TCA CCT CTG CAC GTC GCA TG; 共用锚定引物为txas5 (1 683): 5’-(T)15GCT GG-3’应用50 mL单管RT-PCR系统(roche，mannheim，germany)进行逆转录和扩增. 为了表明血清中RNA的广泛存在和其分子的相对完整性，应用含有引物对GAPDH1/GAPDH2的RT-PCR体系对相同的标本中3－磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)RNA进行逆转录和扩增. 所用上游引物为: GAPDH1(3 755): 5’-CAT CTC TGC CCC CTC TGC TGA-3’下游引物为: APDH2(4 344): 5’-GGA TGA CCT TGC CCA CAG CCT-3’为了进一步显示反应的扩增效率及特异性，始终应用质粒DNA pMT9T40A和pMT9T41A进行平行扩增，前者为fRNA RT-PCR阳性而trRNA反应阴性;后者为fRNA 反应阴性而trRNA反应阳性. 此外，去离子水和18S/22S核糖体RNA也被用来作为阴性对照，应用Kwok和Higuchi的方法[6]避免实验室内污染，并把所有的反应至少重复一次. 1.2.5 扩增产物的检测 把产物(15 mL)上样到含溴化乙锭(0.2 mg/mL)的琼脂糖凝胶(2 g/L)进行电泳，紫外线下观察，分别用UVP凝胶分析系统和光学照相记录数据，用应用软件(LabWork 3.0 UVP)评价产物的强度. 统计学处理 计量资料采用ｔ检验. 2 结果 2.1 治疗组与非治疗组孕妇所生新生儿HBVM的比较 治疗组共31例:孕妇均接受乙肝免疫球蛋白200 IU/mo，共4次，左旋咪唑涂布剂治疗500 mg/支，3次/wk，涂布四肢内侧皮肤3 mo治疗，治疗过程中无不良反应，足月分娩. 新生儿出生后48 h内、接种乙肝疫苗前采集外周血检测HBVM，其中HBsAg阳性2例 (6.45 %). 外周血抗-HBs阳性10例(32 ％). 未治疗组共29例: 未接受任何主动或被动免疫防治措施，足月妊娠分娩. 新生儿娩出后48 h内采集外周血送检，其中HBsAg阳性4例. (13.7 %). 外周血抗-HBs阳性7例(24％). 两组比较，治疗组HbsAg阳性病例少于未治疗组，HBsAb阳性病例多于未治疗组P <0.01，表1. 表1 新生儿外周血HBVM 组别 n HBsAg(+) HBsAb(+) HBeAg(+) HBeAb(+) HBcAb(+) 治疗组 31 2 10 1 2 16 未治疗组 29 4 7 1 0 8 2.2 两组孕妇与新生儿血清中HBV DNA、fRNA (全长型)、trRNA(顿挫型)的比较 对未治疗组血清标本16对，治疗组送检标本31对，进行HBV DNA及fRNA、trRNA等不同类型病毒转录体的检测，结果见表2 (P <0.01). 表2 新生儿/母亲外周血HBV DNA、fRNA、trRNA的比较 组别 n DNA fRNA trRNA 治疗组 31 1/18 1/14 17/17 未治疗组 16 1/6 2/4 10/10 未治疗组HBsA g/HBeAg阳性孕妇４例中病毒DNA强阳性(+++)３例，fRNA强阳性(+++)2例，trRNA阳性(+～++)3例. 所生婴儿2男2女，HBeAg/抗－HBc阳性2例，抗－HBc阳性1例，无HBV DNA和fRNA阳性例，但4例全呈trRNA阳性(+). 12例HBsAg/抗－HBc阳性孕妇中，HBV DNA阳性3例，fRNA阳性(+++)2例，trRNA阳性(+～+++)7例. 所生婴儿8男4女，HBsAg阳性2例，抗－HBe/抗－HBc阳性4例，HBV DNA阳性1例，fRNA阳性2例(+)，trRNA阳性(+～++)6例. 即本组16例新生儿中，HBV DNA阳性1例(6 ％)，fRNA阳性2例(12.5 ％)，trRNA阳性10例(62 ％)，其中1例为HBV DNA(+)、fRNA(+)、trRNA(++). 治疗组31例孕妇中HBsAg/HBeAg/抗－HBc阳性16例，其中HBV DNA阳性(+++)12例，fRNA阳性(++～+++)11例，trRNA阳性(+～++)11例，所生婴儿7男9女，HBsAg/抗-HBc阳性合并HBV DNA阳性1例，抗-HBs或抗-HBs/抗-HBe阳性11例，fRNA弱阳性(+)1例，trRNA弱阳性(+/－)11例.HBsAg/抗-HBe/抗-HBc阳性15例，HBV DNA阳性6例，fRNA阳性(+++)3例，trRNA阳性(+～+++)6例,所生7男8女，抗－HBs阳性3例，抗－HBc阳性6例，无HBV DNA和fRNA阳性例，trRNA阳性(+～+++)6例. 即本组婴儿血清HBsAg/抗-HBc阳性合并HBV DNA阳性1例(3％)，fRNA弱阳性(+)1例，trRNA阳性17例(55 ％). 3 讨论 3.1 对HBsAg阳性孕妇行主动和被动免疫，可以有效降低宫内感染率 本组资料中，乙肝病毒携带状态呈HBsAg阳性者中，未治疗组孕妇其新生儿外周血HBsAg阳性者占13.7 %，治疗组为6.45 %. 未治疗组与各治疗组比较有十分显著的差异(P <0.01). 已有研究表明乙肝免疫球蛋白对阻断乙肝病毒母婴传播有一定作用，孕妇产前多次注射HBIG能有效减少HBV的宫内感染[3]; 左旋咪唑是一种非特异性免疫调节剂，主要作用于T细胞，诱导早期前T细胞分化成熟，成为功能性T细胞并可使功能失调的T细胞恢复正常，同时增强单核细胞的趋化性和吞噬作用，激活巨噬细胞和粒细胞移动抑制因子，诱生内源性干扰素，提高免疫和病毒疗效，已经用于治疗慢性乙型肝炎[7]. 本组资料提示，应用HBIG及左旋咪唑可明显降低宫内HBV感染. HBV母婴传播发生率与母体HBsAg的浓度以及是否有HBeAg有关. 现认为在早期和中期妊娠时感染HBV常易清除，而很少发生宫内感染，晚期妊娠时母亲携带较大量HBV病毒者容易传染给胎儿，有人提出HBV经胎盘感染胎儿的可能时间为孕中期或孕晚期[8]. 因此我们认为选择孕26 wk以后作为开始阻断HBV垂直传播的治疗时间较恰当. 3.2 母婴传播是形成慢性HBV感染的重要原因 据估计我国的慢性HBV感染约有30-50 %是通过母婴传播发生的. 对于未接受治疗的母亲来讲，单独 HBsAg阳性母亲的婴儿约40 %在半岁内出现HBsAg阳性，而HBsAg和HBeAg双阳性母亲的婴儿HBsAg阳性率高达90 %以上[9]. 这些婴儿多数转变为慢性HBV感染，形成新的传染源. 虽然a-干扰素和拉米夫定对慢性乙型肝炎有一定疗效,但并不理想.因此阻断HBV母婴传播对控制HBV流行及其相关疾病具有重要意义. 在高流行区，HBV多数于围产期或幼儿期通过母-婴垂直传播，容易慢性化[10]. 慢性感染早期是病毒高复制阶段，常为HBeAg阳性，血中有高水平的病毒DNA.随着血清HBeAg转阴，血中病毒DNA随之减少，这种病例可检测到anti-HBeAg[11].尽管血清中HBsAg相对稳定，每年也有约1-2 %自然转阴，这是HBV慢性感染的更晚期阶段. 在某些病例，HBsAg转阴后一段时间内血液中仍存在anti-HBcAg[12]. 我们的研究表明，fRNA与血中DNA水平和HBeAg密切相关.非治疗组母亲血清HBsAg/HBeAg/HBV DNA和fRNA阳性者，其所生婴儿血清亦为阳性，干预治疗组母亲血清HBsAg/HBeAg/HBV DNA和fRNA阳性者，其所生婴儿有1例亦为阳性. 而无论非治疗组还是治疗组，虽然无HBeAg和HBV DNA等病毒复制的证据，母血中抗-HBc阳性和trRNA阳性与婴儿血清中trRNA的阳性率却相当高(表2)，这与苏勤et al [4, 5] 认为TrRNA的存在与否与上述病毒复制指标没有明确相关性观点相一致.在迄今为止所有的HBV血清学指标中trRNA表现最稳定.染色体内整合的HBV DNA可能是trRNA的主要转录模板.我们通过对比观察证实孕期应用HBIG及左旋咪唑可明显降低新生儿的HBsAg/HBeAg和HBV DNA的感染率，但不能降低新生儿血液中trRNA的携带率，其意义值得进一步研究.乙肝宫内感染是一个复杂问题，除了与产程时间、分娩方式等有关外，HBV本身的变异已成为阻断其母婴传播的困难之一. 是否携带HBV的母亲所生新生儿出生时检测RNA能早期发现HBV隐匿性感染[13]，并早行预防及治疗，有待深入观察.